《Toxicology》：In vitro assessment of respiratory sensitization potential and allergic asthma: a miRNA-based approach
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职业性暴露于呼吸致敏剂是过敏性哮喘的主要病因。尽管microRNAs（miRNAs）日益被认为与哮喘发病机制相关，但其在过敏性哮喘中的具体作用仍不明确。本研究旨在评估一种基于人类的三维体外模型，以探究miRNAs在过敏性哮喘中的可能作用。采用VITROCELL
职业性暴露于呼吸致敏剂是过敏性哮喘的主要病因。尽管microRNAs（miRNAs）日益被认为与哮喘发病机制相关，但其在过敏性哮喘中的具体作用仍不明确。本研究旨在评估一种基于人类的三维体外模型，以探究miRNAs在过敏性哮喘中的可能作用。采用VITROCELL? Cloud Alpha 6系统，对空气-液体界面（ALI）培养的Calu-3细胞分别暴露于三种呼吸致敏剂：六亚甲基二异氰酸酯（HDI）、六氯铂酸铵（HClPt）和偏苯三酸酐（TMA）；同时测试了皮肤致敏剂2,4-二硝基氯苯（DNCB）和刺激物十二烷基硫酸钠（SDS）。通过MTT法和乳酸脱氢酶（LDH）法评估细胞毒性，并通过跨上皮电阻（TEER）评估上皮屏障完整性。进行了miRNA谱分析，随后进行了靶向分析。定量检测了细胞因子释放（IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-17、IL-18、IL-33、MCP-1、MIP-1α、TGF-β和TSLP），并利用miRNA模拟物和抑制剂研究了miRNAs的参与情况。检测了HMOX基因表达。miRNA谱分析显示多种miRNAs在所有呼吸致敏剂作用下均一致下调，包括miR-26b-5p、miR-34a-5p、miR-125b-5p、miR-148a-3p和miR-200a-3p。HClPt诱导了IL-6释放和HMOX表达的显著增加，而HDI和TMA则导致显著降低。为理解其潜在联系，研究人员使用了特定的miRNA模拟物和抑制剂条件。结果表明，miR-18b-5p、miR-135b-5p和let-7a-5p调控IL-6释放和HMOX表达。来自不同化学类别的呼吸致敏剂能够诱导影响IL-6和HMOX表达的不同miRNA依赖性调节机制。这些发现支持基于人类细胞的体外模型在研究过敏性哮喘中的相关性。
论文解读：基于miRNA的呼吸致敏与过敏性哮喘体外评估研究
研究背景与意义
过敏性哮喘是一种常见的慢性炎症性疾病，全球约有3亿患者，其发病与遗传、环境过敏原暴露及空气污染物等因素密切相关。职业性哮喘（OA）作为过敏性哮喘的重要亚型，主要由工作场所的呼吸致敏剂引发，包括高分子量（HMW，>10 kD）物质（如动物蛋白）和低分子量（LMW，<1 kD）化学物质（如异氰酸酯、铂盐）。目前，哮喘发病机制的研究多聚焦于辅助性T细胞（Th）亚群失衡（如Th2型细胞因子IL-4、IL-5介导嗜酸性粒细胞浸润，Th1/Th17型细胞因子促进中性粒细胞炎症），但呼吸致敏剂诱导的早期分子事件仍不明确。
microRNAs（miRNAs）作为内源性非编码RNA，通过结合信使RNA（mRNA）调控基因表达，参与多种病理过程。近年研究发现miRNAs与哮喘发病相关，但其对呼吸致敏剂的响应特征及调控机制尚不明确。现有研究多依赖动物模型或患者样本（血液、呼出气冷凝液），缺乏可模拟人体气道环境的体外机制研究。因此，本研究通过建立基于人类支气管上皮细胞（Calu-3）的三维体外模型，结合新型暴露技术，旨在揭示呼吸致敏剂诱导的miRNA表达谱变化及其对炎症因子和氧化应激基因的调控作用，为过敏性哮喘的机制研究和替代动物实验提供新策略。该研究成果发表于毒理学领域期刊《Toxicology》。
关键技术方法
研究采用空气-液体界面（ALI）培养的Calu-3细胞构建三维气道上皮模型，通过VITROCELL? Cloud Alpha 6系统对细胞进行雾化暴露，模拟体内吸入暴露场景。选取三种不同化学类别的呼吸致敏剂（HClPt、HDI、TMA）、一种皮肤致敏剂（DNCB）和一种刺激物（SDS）作为受试物。核心技术包括：miRCURY LNA miRNA Focus PCR Panel进行miRNA谱分析；ELISA法检测13种细胞因子释放；实时荧光定量PCR（qPCR）检测HMOX基因表达；通过转染miRNA模拟物（mimic）和抑制剂（inhibitor）验证特定miRNA的功能。
研究结果
3.1 细胞毒性测定
通过MTT还原实验和LDH泄漏实验评估细胞活力，确定各化合物的最大非细胞毒性浓度（CV80）。结果显示，HClPt（5 mg/mL）、HDI（1 mg/mL）、TMA（7.5 mg/mL）和DNCB（1 mg/mL）在各测试浓度下细胞活力均>80%；SDS呈剂量依赖性降低细胞活力，CV80为30 mg/mL。据此选定后续实验浓度。
3.2 膜完整性（TEER）影响
测量暴露前后跨上皮电阻（TEER）以评估上皮屏障功能。未暴露时Calu-3细胞TEER值约500-600 Ω，表明形成紧密单层。暴露24小时后，SDS（30 mg/mL）、HDI（1 mg/mL）和TMA（7.5 mg/mL）显著降低TEER值（P<0.05），而HClPt和DNCB无明显影响，提示部分致敏剂可破坏上皮屏障完整性。
3.3 miRNA谱与表达影响
通过miRNA芯片筛选15个候选miRNAs，发现呼吸致敏剂可诱导特异性miRNA表达变化：HClPt主要下调miR-18a-5p、18b-5p、30e-5p，上调miR-16-5p、17-5p、135b-5p、let-7a和let-7c；HDI和TMA则上调miR-18a-5p、18b-5p，下调miR-16-5p、26b-5p、34a-5p、135a、135b-5p、let-7a和let-7c。其中miR-26b-5p、34a-5p、125b-5p、148a-3p和200a-3p在所有呼吸致敏剂作用下均显著下调，最终选定miR-17-5p、18b-5p、135b-5p、148a-3p和let-7a-5p进行后续验证。
3.4 细胞因子分析
ELISA检测显示，仅IL-6、IL-8和TGF-β可被检测到。IL-8和TGF-β释放与对照组无显著差异；HClPt显著诱导IL-6释放（P<0.05），而HDI和TMA显著降低IL-6分泌（P<0.01），表明IL-6是呼吸致敏剂诱导的差异炎症因子。
3.5 特定miRNA对细胞因子释放和基因表达的调控
通过转染miRNA模拟物/抑制剂发现：HClPt诱导的IL-6升高和HMOX表达上调可被miR-18b-5p模拟物、miR-135b-5p抑制剂和let-7a-5p抑制剂抑制；HDI和TMA诱导的IL-6降低和HMOX下调则可被miR-135b-5p模拟物（HDI组）和let-7a-5p模拟物（TMA组）逆转。结果表明miR-18b-5p、135b-5p和let-7a-5p通过调控IL-6/HMOX通路参与呼吸致敏剂的响应。
讨论与结论
讨论部分指出，本研究建立的Calu-3细胞ALI模型结合VITROCELL雾化暴露系统，可有效模拟呼吸致敏剂的气道暴露场景，避免了动物模型的物种差异。尽管未发现区分呼吸致敏剂与刺激物/皮肤致敏剂的通用miRNA标志物，但不同化学类别致敏剂（铂盐、异氰酸酯、酸酐）诱导了独特的miRNA表达谱，提示其可能通过不同分子机制引发过敏反应。IL-6作为关键炎症因子，其表达受miR-135b-5p和let-7a-5p的双向调控，且与氧化应激基因HMOX的表达呈正相关，揭示了miRNA-IL-6-HMOX轴在呼吸致敏早期事件中的作用。
研究局限性在于模型缺乏免疫细胞组分，无法完全模拟体内免疫应答；且部分难溶性化合物因雾化系统限制未能达到更高暴露剂量。未来需整合原代气道细胞、免疫细胞共培养体系，并结合临床样本验证，以完善呼吸致敏剂的不良结局路径（AOP）框架。
结论：不同化学类别的呼吸致敏剂可通过特异性miRNA依赖机制调控IL-6释放和HMOX表达，基于人类细胞的体外模型为过敏性哮喘的机制研究和风险评估提供了可靠工具。
