《Toxicology and Applied Pharmacology》：Proteome profiling of emamectin-treated primary rat cortical cells following up to twelve days in vitro exposure
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维托尔德·M·温尼克（Witold M. Winnik）| 威廉·帕吉特（William Padgett）| 丹妮尔·弗里伯恩（Danielle Freeborn）| 托马斯·杰克逊（Thomas Jackson）| 赫曼斯·切鲁库里（Hemanth Cherukury）| 约瑟
维托尔德·M·温尼克（Witold M. Winnik）| 威廉·帕吉特（William Padgett）| 丹妮尔·弗里伯恩（Danielle Freeborn）| 托马斯·杰克逊（Thomas Jackson）| 赫曼斯·切鲁库里（Hemanth Cherukury）| 约瑟夫·瓦尔迪兹（Joseph Valdez）| 马修·瓦尔迪兹（Matthew Valdez）| 西娜·麦克（Cina Mack）| 蒂莫西·J·谢弗（Timothy J. Shafer）| 大卫·W·赫尔（David W. Herr）| 普拉萨达·拉奥·S·科达万蒂（Prasada Rao S. Kodavanti）
美国环境保护署（U.S. Environmental Protection Agency）公共卫生与综合毒理学部门（Public Health and Integrated Toxicology Division）神经学与内分泌毒理学分部（Neurological and Endocrine Toxicology Branch），研究三角园（Research Triangle Park），北卡罗来纳州27711
摘要
本研究利用原代大鼠皮质培养物，识别出可能与神经毒性（NT）和发育神经毒性（DNT）机制相关的蛋白质组学变化路径。选择苯甲酸埃玛菌素（Emamectin benzoate，EMB）作为测试化学物质。为了将蛋白质组学表达数据与先前描述的与神经突起生长（Neurite Outgrowth，NOG）相关的影响以及EMB引起的皮质细胞培养多电极阵列电活动变化进行比较，我们从CompTox化学品仪表板（CompTox Chemicals Dashboard）中检索了数据。在当前的急性EMB实验中，从培养第7天（DIV7）开始暴露，持续24小时。在高剂量EMB下，有241种蛋白质发生了显著变化。然而，在所有三种EMB浓度下，只有两种蛋白质在处理后24小时内表现出显著的蛋白质丰度变化。在涉及从接种后2小时开始连续EMB处理的发育模型中，最长处理时间和最高浓度（1.25 μM）的第12天（DIV12）记录到了最多的显著蛋白质比例变化（104种），其中85种蛋白质下调，20种蛋白质上调。主要的蛋白质变化发生在神经发育和神经突起生长、涉及GABA和谷氨酸的神经元过程、微管、线粒体-氧化磷酸化以及钙调节途径中。数据显示，基于蛋白质组学的方法有助于理解毒素如何引发神经毒性和生理效应，并可能用于提出AOP（Adverse Outcome Pathways）途径，作为未来筛选和优先评估大量化学物质的安全性模型。
引言
开发快速可靠的筛选方法来评估化合物的神经毒性（NT）和发育神经毒性（DNT）仍然是监管科学中的一个关键未满足需求。为了解决这一问题，正在开发新的体外方法（NAMs），以提高安全性评估的效率并减少对脊椎动物实验的依赖。NAMs有助于向针对性的体内测试过渡，为危害识别提供坚实的基础（Bal-Price等人，2018年；Carstens等人，2022年）。
苯甲酸埃玛菌素（Emamectin benzoate，EMB）是阿维菌素（avermectin）的半合成衍生物，于1997年首次获准作为高效杀虫剂用于多种农作物中的鳞翅目昆虫和螨虫防治（Ishaaya等人，2002年；Jansson等人，1996年；Pan等人，2024a）。其主要作用机制是与神经肌肉接头处的谷氨酸门控氯通道（GluCl）和GABA受体高亲和力结合，导致目标无脊椎动物不可逆的麻痹和死亡（Ishaaya等人，2002年；Wang等人，2023年）。除了农业领域，EMB还越来越多地用于水产养殖，以防止寄生虫如海虱（Bloodworth等人，2019年；Raja等人，2022年；Willis和Ling，2003年）。
最初认为EMB对人类的神经毒性较低——因为GluCl通道仅存在于无脊椎动物中，并且预计EMB不会穿过血脑屏障影响中枢神经系统（CNS）中的GABA受体（Pan等人，2024a；Wolstenholme，2012年）。然而，多起急性EMB中毒事件，主要是故意过量服用，表现为CNS抑制、胃肠道不适和呼吸衰竭（Godhiwala等人，2020年；Lalmalsawmi等人，2024年；Pan等人，2024a；Pan等人，2024b；Yen和Lin，2004年；Park，2018年）。体外研究证实了这些观察结果，显示EMB对人类支气管上皮（16HBE）、正常肝细胞（QSG7701）和肠上皮（Caco-2）细胞以及Molt-4 T细胞和THP-1巨噬细胞具有显著的细胞毒性（Chen等人，2023年；Niu等人，2020年；Wei等人，2023年；Yue等人，2024年；Zhang等人，2017年）。
GABA能系统对神经发生、突触形成和中枢神经系统的成熟至关重要（Topchiy等人，2024年；Watanabe等人，2002年；Wu和Sun，2015年）。在这些关键时期受到干扰可能导致长期的神经发育障碍，包括癫痫发作和认知缺陷（Heaney和Kinney，2016年；Powell等人，2003年；Schmidt和Mirnics，2015年；Topchiy等人，2024年）。体内啮齿动物研究表明，EMB暴露会诱导氧化应激、炎症（El-Sheikh el和Galal，2015年；Khaldoun-Oularbi等人，2015年；Noshy和Azouz，2021年）以及发育问题，如后代体重减轻、后肢张开（Wise等人，1997年）。此外，最近在斑马鱼幼体中的研究发现，EMB会抑制GABA相关基因和神经发生，并降低成年大鼠的神经发生（Gu等人，2023年；Noshy和Azouz，2021年）。
本研究中使用的大鼠原代皮质培养模型是一个经过充分验证的DNT筛选平台。先前的研究表明，该模型能够有效捕捉原代皮质细胞的关键发育转变，例如从培养第5天（DIV5）到第8天（DIV8）期间GABA受体反应从不成熟到成熟的转变（Inglefield和Shafer，2000年）。此外，微电极阵列（MEA）和高内涵成像（HCI）分析验证了这些培养物在评估神经网络发生和突触形成方面的适用性，使其适合进行中等通量的危害优先级评估：在原代皮质培养中，使用MEA在最初的12天内检查了神经网络发生，结果显示动作电位尖峰活动在DIV5到DIV12之间迅速发展（Cotterill等人，2016年），并且MEA检测进一步用于DNT危害的化合物筛选（Brown等人，2016年）。此外，在同一原代皮质细胞培养中，通过微电极阵列记录了12天内的自发神经网络活动，并评估了86种化合物的DNT危害和进一步优先级（Frank等人，2017年；Feshuk等人，2023年）。最后，HCI用于检测化学物质引起的变化，结果表明在最初的15天内，皮质神经元发展出极化的神经突起网络（即轴突和树突），并且突触前蛋白突触素的表达随时间增加，表明突触的形成（Harrill等人，2011b）。
当前的体外研究使用原代大鼠皮质培养物，旨在识别可能成为不良结果途径（AOPs）关键事件的蛋白质组学变化。我们在两种不同条件下表征了EMB的影响：一种是在DIV7时的急性24小时处理——此时原代皮质细胞已达到主要的发育里程碑（Inglefield和Shafer，2000）；另一种是持续到DIV12的慢性发育暴露。通过使用最小处理相关细胞毒性的浓度范围，我们致力于为未来开发基于机制的、成本效益高的NAMs提供基础，以筛选大量的化学物质库。
部分摘要
化学物质
苯甲酸埃玛菌素（Emamectin benzoate，EMB：CAS编号155569-91-8；图1），也称为MK-244，从MedChemExpress LLC（美国新泽西州蒙茅斯 Junction）获得。EMB的纯度为98%。EMB的储备溶液在二甲基亚砜（DMSO）中制备，并在暴露前用暴露培养基稀释。DMSO载体的最终浓度为0.2%，并未引起显著的细胞毒性（数据未显示）。所有标准细胞培养试剂均来自Gibco（美国纽约州格兰德岛），除非
细胞毒性
通过LDH释放测量的EMB在皮质细胞中的细胞毒性具有浓度和时间依赖性（图4）。根据这些数据，选择了在48小时内引起小于15%细胞毒性的浓度，以确保蛋白质组学变化不是由细胞死亡引起的。对于急性暴露，选择了0、0.625、1.25和2.5 μM的浓度。
讨论
在这项研究中，我们采用了定量、非靶向蛋白质组学方法来表征原代皮质细胞在急性及长期（DNT）暴露于EMB后的蛋白质变化模式。我们识别出与每种处理方案相关的独特分子特征。数据表明，长期暴露主要影响了与神经元发育和突触稳态相关的蛋白质亚群。
结论
虽然我们的发现突出了DNT组和急性研究组之间的不同蛋白质组学特征，但这些差异可能反映了特定暴露方案的综合作用——包括持续时间、剂量和累积压力——而不是唯一定义发育阶段特异性神经毒性。
急性暴露模型显示神经元和细胞骨架蛋白受到抑制，特别是与微管相关的蛋白。值得注意的是，2.50 μM EMB处理24小时后
CRediT作者贡献声明
维托尔德·M·温尼克（Witold M. Winnik）：撰写——初稿、可视化、监督、软件、资源、方法学、调查、正式分析、数据管理。威廉·帕吉特（William Padgett）：方法学、调查、正式分析。丹妮尔·弗里伯恩（Danielle Freeborn）：调查。托马斯·杰克逊（Thomas Jackson）：撰写——审阅与编辑、正式分析。赫曼斯·切鲁库里（Hemanth Cherukury）：撰写——初稿。约瑟夫·瓦尔迪兹（Joseph Valdez）：正式分析。马修·瓦尔迪兹（Matthew Valdez）：正式分析。西娜·麦克（Cina Mack）：调查、正式分析。蒂莫西·J·谢弗（Timothy J. Shafer）：调查。
利益冲突声明
作者声明没有财务或其他利益冲突。
本文描述的研究已由美国环境保护署的公共卫生与环境评估中心（Center for Public Health and Environmental Assessment）审查并批准发表。批准并不表示内容必然反映该机构的观点和政策，提及商品名称或商业产品也不构成使用推荐。
本研究得到了
致谢
作者感谢美国环境保护署CPHEA的Colette Miller博士和美国环境保护署CCTE的Yue Ge博士对本文早期版本提出的有益意见。
