AMP激活的蛋白激酶非依赖性机制在肺动脉狭窄诱发右心室衰竭中的作用

《Translational Medicine of Aging》：AMP-activated protein kinase independent mechanisms of pulmonary artery banding-induced right ventricular failure

　　伊丽莎白·A·斯特雷特（Elizabeth A. Straight）| 莎拉尼亚·S·贝塔达普拉（Sharanya S. Bettadapura）| 扎克瑞·S·富勒顿（Zackery S. Fullerton）| 悉尼·M·波尔森（Sydney M. Polson）| 丹妮尔·R·布伦斯（Danielle R. Bruns）
美国怀俄明大学运动机能学与健康系，拉勒米，WY 82071

**摘要**
**引言**
肺动脉高压（PH）会导致右心衰竭，这是一种生存率极低的致命疾病。右心室（RV）的功能是预测PH患者预后的关键指标，但目前尚无治疗方法能够改善RV功能。AMP-激活的蛋白激酶（AMPK）是细胞能量的主要调节器，其在左心室（LV）疾病中的药理激活具有保护作用。我们团队及其他研究者的先前研究表明，AMPK的激活对缺氧引起的PH和RV功能障碍具有保护作用。然而，缺氧是全身性的，因此AMPK对RV重塑的直接影响尚不完全清楚。

**目的**
本研究旨在探讨AMPK是否对肺动脉结扎（PAB）诱导的RV衰竭具有保护作用，这是一种直接的RV后负荷手术模型。

**方法**
我们通过增加AMPK活性（使用二甲双胍）和基因敲除AMPKα2（AMPK KO）来研究AMPK的作用。PAB或假手术（Sham）后四周，我们通过组织学和超声心动图评估RV重塑情况。

**结果**
PAB在形态和功能上均导致了RV功能障碍。然而，无论是AMPK的激活还是敲除，都对RV重塑没有影响。RV质量与胫骨长度的比值（RV/TL）在对照组、二甲双胍组及AMPK KO组中分别为1.5 mg/mm、1.5 mg/mm和1.2 mg/mm；RV肌细胞面积分别为302 mm2、253 mm2和293 mm2；RV分数面积变化（FAC）分别为25%、35%和24%。

**结论**
AMPK在RV中似乎既不是驱动PAB诱导的RV衰竭所必需的，也不足以单独起到保护作用。我们认为RV中的AMPK信号通路与LV及缺氧引起的PH中的信号通路不同，并建议未来的研究应寻找针对RV的额外治疗靶点。

**1. 引言**
肺动脉高压（PH）是一种患者生存率极低的致命疾病。升高的肺动脉压力会增加右心室（RV）的后负荷，导致RV重塑异常，最终引发RV衰竭。RV功能是预测PH患者预后的最重要指标[1]。尽管RV功能对患者预后至关重要，但由于对RV疾病机制的理解不足，针对RV的疗法仍难以开发。AMP-激活的蛋白激酶（AMPK）是细胞代谢的主要调节器，虽然在左心室（LV）中具有保护作用[2, 3]，但其对RV疾病的影响尚不明确。最近的研究表明，AMPK的激活在缺氧引起的PH模型中具有保护作用[4, 5, 6, 7]。在慢性缺氧模型中，AMPK的抑制可以抑制平滑肌增生并减轻RV收缩压（RVSP）的升高[4]。在缺氧与血管内皮生长因子抑制剂联合的PH模型（Sugen缺氧模型）中，AMPK激活剂二甲双胍可以降低肺动脉压力并减少血管重塑[5]。然而，这些研究的局限性在于它们使用了缺氧引起的RV功能障碍或其他全身性损伤，因此应激和AMPK激活剂/抑制剂同时影响LV、肺和周围组织，因此尚不清楚AMPK是否直接有益于RV功能。在本研究中，我们采用肺动脉结扎（PAB）这一直接的RV后负荷模型，该模型不会引起全身性缺氧，也不会影响肺或LV的功能[8, 9]。我们通过增加AMPK活性（使用二甲双胍）和基因敲除AMPK（使用心脏特异性AMPK KO）来探讨AMPK对PAB诱导的RV重塑的影响，假设AMPK的激活会减轻RV重塑，而AMPK的敲除会加重RV疾病。

**2. 材料与方法**
2.1 RV功能障碍模型及心脏肌细胞特异性AMPK敲除（AMPK KO）小鼠
所有实验均在C57BL6背景的成年雄性和雌性小鼠（4-6个月大）中进行。小鼠生活在温度控制的饲养箱中，遵循12小时光照-黑暗周期（早上7点开灯，晚上7点关灯）。小鼠可自由摄取食物（LabDiet 5001）和水分。所有实验均获得怀俄明大学动物护理和使用委员会的批准。二甲双胍以200 mg/kg/天的剂量添加到饮用水中，以维持LV功能并激活AMPK[10]，这也是我们团队在缺氧性RV衰竭小鼠模型中的使用方法[6]。对照组（Con）小鼠饮用普通水。
我们使用Cre重组酶介导的切除技术进行AMPK的基因操作[6]。心脏特异性α-肌球蛋白重链（α-MHC）MerCreMer小鼠与AMPKα2 floxed小鼠杂交。小鼠生长至四个月大后，通过他莫昔芬诱导AMPK的敲除。他莫昔芬以30 mg/kg/天的剂量连续给药五天，随后进行一周的洗脱期，以确保转基因成功且避免心脏毒性[11]。
他莫昔芬洗脱后，小鼠接受PAB或假手术（Sham）。小鼠使用1.5%异氟烷麻醉并插管。在第一个和第二肋骨之间的中线处切开皮肤，通过开胸术结扎肺动脉（PA）。在PA基部用23G针头打结以限制PA血流。假手术组仅进行插管和开胸，不结扎PA。所有小鼠在PAB或Sham手术后四周被安乐死。将RV与LV分离并称重，随后用液氮快速冷冻以供后续分析。通过卡尺测量胫骨长度（TL），以标准化RV质量。

**样本数量**
对照组（WT）：7只雌性，7只雄性；假手术组（Sham）：8只雄性，4只雌性；PAB组（WT）：7只雌性，9只雄性；PAB组（AMPK KO）：4只雌性，9只雄性；假手术+对照组（Sham+Con）：4只雌性，5只雄性；PAB+二甲双胍组（Sham+Met）：4只雌性，4只雄性；PAB+二甲双胍组（PAB+Met）：8只雌性，6只雄性；PAB+AMPK KO组（PAB+Met）：6只雌性，5只雄性。

**2.2 超声心动图**
使用VisualSonics Vevo 2100进行超声心动图检查，以评估RV功能[6]。小鼠使用2%异氟烷和1 L/min氧气麻醉。仅纳入心率（HR）高于360 bpm的动物。检测的视图包括：长轴（亮度模式（BM）LV、肺动脉（PA）、脉冲波（PW）PA、短轴（BM）LV RV、运动模式（MM）RV以及心尖MM三尖瓣（TR）和组织多普勒（TR, PW TR）。

**2.3 RNA分离、逆转录和PCR**
快速冷冻的RV组织采用标准Trizol方案进行RNA分离。RNA经逆转录后，使用SYBR Green混合物进行qRT-PCR分析，并以管家基因18s为基准进行标准化。引物序列如下：
Nppa正向：GCCGGTAGAAGATGAGGTCATG
Nppa反向：GCTTCCTCAGTCTGCTCACTCA
Nppb正向：CGCTGGGAGGTCACTCCTAT
Nppb反向：GCTCTGGAGACTGGCTAGGACTT
表达值相对于相应性别的对照组（Sham）进行ΔΔCt计算，并以倍数差异表示。

**2.4 组织学**
RV组织在最佳切割温度（OCT）化合物中冷冻，然后在预冷却的切片机中切成6 μm厚的切片。采用已描述的凝集素染色方法[6]。切片用Olympus IX71倒置显微镜成像，并在ImageJ软件中定量分析。

**2.5 统计分析**
数据采用三因素ANOVA（基因型/药物 x 手术 x 性别）进行分析，随后进行性别/干预组内的Student's t检验。数据以平均值±标准误（SEM）表示，并使用GraphPad Prism软件进行分析。

**3. 结果**
如预期，PAB导致RV肥大，表现为RV/TL增大（图1A,E）、Fulton指数升高（补充图）以及RV肌细胞横截面积（CSA）增大（图1B-G）。然而，与假设相反，二甲双胍（Met）并未减轻PAB诱导的RV肥大重塑，除了RV肌细胞横截面积在雄性PAB小鼠中有所减少。PAB引起的RV肥大在AMPK KO组和WT组之间无差异，两组RV/TL和RV CSA均高于相应性别的对照组（图1E-H）。PAB导致RV壁在收缩期和舒张期增厚，这种肥大重塑既未被二甲双胍减弱，也未被AMPK KO加重（表1）。

**下载**
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**图1. AMP-激活的蛋白激酶（AMPK）既不能保护也不能加重肺动脉结扎（PAB）诱导的右心室（RV）重塑。**
(A) 二甲双胍（Met）未能减轻PAB诱导的RV质量与胫骨长度比值（RV/TL）的增加；
(B) RV肌细胞横截面积（CSA）的增加。
(C) 代表性图像。
(D) PAB降低了RV分数面积变化（FAC）；然而二甲双胍未能防止这种减少。PAB在两性组的Sham和PAB小鼠中均降低了FAC。
(E) PAB在野生型（WT）和心脏AMPK敲除（AMPK KO）小鼠中均引起了RV肥大。
(F) PAB增加了WT和AMPK KO小鼠的RV CSA。
(G) 代表性图像。
(H) PAB降低了WT和AMPK KO小鼠的FAC。*p<0.05 PAB vs Sham, #Met vs Con。
开放条形：Sham；实心条形：PAB。数据通过三因素ANOVA及性别/干预组内的Student's t检验进行分析。数据以平均值±标准误表示。每组n=4-7只。

**表1. 男性和女性小鼠的超声心动图结果**
上排：接受肺动脉结扎（PAB）或假手术并给予二甲双胍（Met）治疗；下排：AMP-激活的蛋白激酶（AMPK）野生型（WT）或心脏特异性AMPK敲除（AMPK KO）小鼠。
PAB组的FAC低于对照组，两组性别均无改善。PAB组的RV壁厚度在收缩期（RV Wall;s）和舒张期（RV Wall;d）均高于对照组，二甲双胍显示部分缓解效果。三尖瓣环平面收缩期 excursion（TAPSE）在PAB+Met组女性中降低。每组的心率（HR）无变化。FAC在PAB WT和PAB KO组中低于相应性别的对照组。肥大性重塑与一系列适应不良基因程序的诱导密切相关，包括脑利钠肽（Nppb）和心房利钠肽（Nppa）[13]。PAB（肺动脉结扎）导致Nppb的表达增加，而Met（甲基精氨酸）进一步加剧了这一现象（图2A）。PAB还诱导了Nppa的表达，在雄性PAB小鼠中这种表达被Met减弱，但在雌性小鼠中则被加剧（图2B）。PAB增加了AMPK野生型（WT）和敲除型（KO）小鼠中Nppb和Nppa的表达（图2C,D）。下载：下载高分辨率图像（347KB）下载：下载全尺寸图像

图2. AMP激活的蛋白激酶（AMPK）不能防止或加剧肺动脉结扎（PAB）引起的病理基因表达。(A) PAB刺激了利钠肽B（Nppb）的表达，而Met进一步加剧了这一现象。(B) 利钠肽前体A（Nppa）的表达在PAB中被诱导，但在雄性小鼠中被Met减弱。(C) PAB在野生型（WT）和心脏AMPK敲除（AMPK KO）小鼠中诱导了Nppb的表达。(D) Nppa的表达在PAB或心脏AMPK缺失的情况下几乎没有变化。*p<0.05 PAB vs Sham, *# Met x PAB的交互作用。开放条形：Sham，实心条形：PAB。数据通过三因素方差分析（ANOVA）进行评估，并在性别和手术组内进行事后Student’s t检验。数据以平均值±标准误差（SEM）表示。每组n=4。

4. 讨论
右心室（RV）功能是肺动脉高压（PH）患者预后的最重要预测指标[1]。然而，尽管维持RV功能非常重要，但其衰竭的机制仍不清楚，目前也没有针对RV的特异性治疗方法。AMPK激活在左心室（LV）中具有很强的心脏保护作用[2, 3]，并且可以防止缺氧引起的RV衰竭[4, 6]，但AMPK是否直接影响RV尚不清楚。因此，我们研究了在PAB引起的直接RV压力负荷模型中AMPK的作用。结果显示，药物激活AMPK不能防止RV功能障碍，而AMPK的缺失也不会加剧RV重塑。有必要进一步研究RV衰竭的其他机制。

AMPK激活通过代谢和非代谢途径在LV中具有广泛的心脏保护作用[2, 3]。AMPK激活剂二甲双胍[14]可以减轻经主动脉结扎（TAC）引起的LV重塑，表现为LV重量减轻和LV射血分数保持[15]。腺病毒过表达AMPKα2通过改善线粒体功能来预防TAC引起的心力衰竭[16, 17]。AMPK激活在多种形式的PH中也具有保护作用，二甲双胍可以逆转MCT诱导的PH中的RV收缩压[16, 17]和缺氧引起的RV功能障碍[6, 18]。然而，MCT和缺氧都是全身性损伤，会影响肺部和LV的重塑。因此，目前的研究在直接测试AMPK在RV中的增益/损失方面仍然有限。在本研究中，我们发现二甲双胍对PAB引起的RV重塑作用有限，既没有改善RV肥大，也没有改善RV收缩功能。在某些情况下，二甲双胍甚至加剧了RV重塑，表现为雌性RV中BNP和ANF的表达增加以及RV FAC的抑制，即使在Sham组动物中也是如此。由于已有报道指出二甲双胍的作用机制与AMPK无关[15, 19]，我们还通过基因敲除AMPK功能来测试AMPK在PAB引起的RV重塑中的必要性。与二甲双胍对RV重塑无影响的结果一致，我们发现AMPK WT和KO小鼠在PAB反应中的结构和功能差异也不存在，这表明RV对后负荷增加的反应独立于AMPK。RV疾病的机制仍不清楚，但最近对三种物种（大鼠MCT、猪PAB、人类RV衰竭）的比较通过转录组学和蛋白质组学揭示了共同的通路，这些通路在致心律失常的右心室心肌病中尤为明显[20]。令人惊讶的是，这三种模型之间的代谢途径并不一致，这可能支持代谢和AMPK在衰竭的RV中具有独特调控的观点。

阐明RV特异性的重塑机制一直很困难，部分原因是将LV的数据外推到RV疾病上。实际上，NHLBI的一个工作组总结了RV的独特性，并强调了基于RV的研究的必要性，指出“不能仅通过从LV衰竭的经验来理解RV衰竭……RV与LV不同”[21]。支持这一观点的是，PAB和TAC的比较显示，虽然RV和LV之间的肥大基因表达相似，但大多数其他基因的调控方式不同，RV中细胞外基质基因的表达显著富集，而LV中则没有[22]。鉴于AMPK在LV中的保护作用而在RV中无效的充分证据，我们认为心室之间的差异可能是造成这一现象的部分原因。RV和LV在生理、负荷条件以及细胞和分子特性上存在根本差异。由于LV的系统血管阻力远高于RV，LV的工作负荷是RV的五倍[23]。因此，这两个心室可能有不同的能量需求。例如，在健康状态下，LV主要依赖氧化磷酸化而不是糖酵解，并且具有较高的线粒体密度以支持持续的氧化代谢[24]。相比之下，RV在静息状态下的糖酵解通量较高[25]。RV的氧气消耗和ATP产生率低于LV[26]，这可能表明RV具有更大的代谢储备能力[26]。尽管这些代谢差异尚未通过实验验证，但这些差异可能与RV和LV之间的AMPK信号通路不同有关，从而导致AMPK功能的增益/损失结果不同。虽然AMPK激活在LV中的保护作用已被充分记录，但由于RV对AMPK介导的能量产生途径的依赖性较低，这种保护作用可能不会直接体现。需要进一步的研究来阐明RV中AMPK的具体机制及其与LV中的差异。

5. 局限性和结论
我们承认本研究存在一些局限性。实验小鼠生活在海拔7220英尺的轻微缺氧环境中，这种中等程度的缺氧压力可能影响了对照组/Sham组的表型[27]。因此，虽然我们确信PAB压力足以诱导RV重塑，但在海平面上AMPK激活所提供的保护作用可能会有所不同。尽管我们通过无创超声全面量化了RV功能，但其他心脏成像方法（如侵入性血流动力学）也可能提供有关肺-RV耦合和RV舒张功能的宝贵信息。利用侵入性血流动力学研究AMPK功能增益和损失的方法也可能有助于直接量化PAB和RV压力负荷情况下的PA和RV收缩压的变化。RV对心脏压力（如压力负荷）反应中的重塑时间点尚未完全明确。虽然一些研究表明早期时间点可能导致适应性重塑，但后期时间和慢性炎症被认为与适应不良重塑和衰竭相关[28]。变化发生的时间及其导致RV适应性还是适应不良性重塑的原因仍有待阐明，这对于成功开发治疗方法至关重要。最后，我们无法在当前样本中进行免疫印迹实验来检测AMPK的增益/损失。然而，我们之前的研究清楚地表明，AMPK KO小鼠的RV AMPK表达显著降低[6]。尽管二甲双胍是一种公认的AMPK激活剂[29]，但二甲双胍治疗也有可能产生非AMPK依赖性的效果[19]。因此，不同的AMPK激活剂在PAB引起的RV功能障碍中仍可能产生有益效果。

综上所述，我们得出结论：RV中的AMPK并不是驱动PAB引起的RV衰竭所必需的。数十年的临床和临床前研究一直采用基于LV的策略来治疗RV，我们认为这种方法可能不会取得成功。尽管目前尚不清楚为什么基于LV的治疗（如AMPK激活）在RV中无效，但我们认为LV和RV之间的分子和生理差异可能是原因[30]，并建议未来的研究考虑这些差异，以便开发针对RV的特异性治疗方法。

致谢
作者贡献声明：
Danielle R Bruns：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、可视化、监督、软件使用、资源管理、项目管理、方法学、资金获取、正式分析、概念化。
Zackery S. Fullerton：撰写——审阅与编辑、方法学、研究、数据管理、概念化。
Sydney M. Polson：撰写——审阅与编辑、方法学、正式分析、数据管理。
Sharanya S. Bettadapura：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、可视化、数据管理。
Elizabeth A. Straight：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、可视化、研究、正式分析、数据管理、概念化。

数据与材料的可用性
原始数据将在合理请求时由作者提供。

利益冲突
作者声明没有利益冲突。

伦理批准和参与同意
所有实验方案均获得了怀俄明大学动物护理和使用委员会的批准。

财务支持和赞助
本研究得到了NIA K01 AG058810和AG058810-04S1（DRB）以及怀俄明州INBRE 2P20GM103432的支持。