MT1G通过激活PI3K–AKT通路抑制铁死亡促进透明细胞肾细胞癌进展

《Translational Oncology》：MT1G promotes the progression of ccRCC by suppressing ferroptosis through activation of the PI3K–AKT pathway

　　

透明细胞肾细胞癌（ccRCC）是泌尿系统最常见且具有临床侵袭性的恶性肿瘤，其特征是信号通路失调和对铁死亡（Ferroptosis）的抵抗。金属硫蛋白-1 G（MT1G）在ccRCC中通常下调，但其表达升高与不良预后 paradoxically 相关，提示其具有促癌作用。本研究整合生物信息学分析、体外及体内实验，探讨了MT1G在ccRCC中的生物学功能及潜在机制。研究人员发现，尽管MT1G在ccRCC组织中全局下调，但其表达与PI3K–AKT通路活性呈正相关，并抑制铁死亡。功能实验显示，敲低MT1G可抑制细胞增殖、克隆形成和迁移，同时促进铁死亡并降低PI3K–AKT活性；反之，MT1G过表达或PI3K激动剂UCL-TRO-1938处理可挽救这些表型。体内异种移植瘤模型证实，沉默MT1G可抑制肿瘤生长，伴随PI3K–AKT活性降低及铁死亡抑制标志物下调，而这些效应可被UCL-TRO-1938逆转。综上所述，这些发现表明MT1G通过激活PI3K–AKT通路并抑制铁死亡来促进ccRCC进展，为其预后意义及作为治疗靶点的潜力提供了机制基础。

该论文题为《MT1G promotes the progression of ccRCC by suppressing ferroptosis through activation of the PI3K–AKT pathway》，发表于《Translational Oncology》。透明细胞肾细胞癌（ccRCC）作为泌尿系统最常见的恶性亚型，虽检出率因影像学普及而上升，但晚期患者复发率高且五年生存率低，且对放化疗普遍耐药。现有研究指出，ccRCC的恶性进展与代谢重编程及抗凋亡表型密切相关，其中铁死亡抵抗是关键机制之一。虽然已知VHL基因缺失导致HIF-α持续激活可上调SLC7A11和GPX4等铁死亡抑制因子，且PI3K–AKT通路异常激活能通过磷酸化SLC7A11（Ser34位点）增强胱氨酸摄取和脂质过氧化物解毒，从而促进肿瘤细胞逃避程序性死亡，但该调控网络的深层机制仍未完全阐明。金属硫蛋白-1 G（MT1G）作为一种富含半胱氨酸的金属结合蛋白，在不同肿瘤类型中表现出功能异质性：在前列腺癌和肝癌中常作为抑癌因子下调，而在结直肠癌和胃癌中则表现为促癌作用。尽管已有线索表明MT1G在ccRCC中可能作为促癌因子，但其具体机制，特别是是否参与调控铁死亡尚不清楚。为此，研究人员开展了本研究，旨在阐明MT1G在ccRCC中的作用及其与PI3K–AKT通路、铁死亡之间的关联。

为开展研究，作者采用了多项关键技术方法。首先利用TCGA数据库（TCGA-KIRC队列）进行生物信息学分析，涵盖差异表达、生存分析及CIBERSORT免疫浸润计算。其次，在细胞层面利用人ccRCC细胞系786-O和Caki-1构建了稳定转染模型，并通过RT-qPCR验证干扰效率。随后，通过CCK-8、平板克隆、Transwell迁移实验及Annexin V-FITC/PI流式细胞术评估细胞表型。铁死亡检测采用C11-BODIPY（581/591）荧光探针测定脂质过氧化水平及细胞内Fe²⁺含量。分子机制层面通过Western blotting检测PI3K、p-AKT、GPX4、SLC7A11及ACSL4等蛋白表达。最后，利用BALB/c裸鼠构建皮下异种移植瘤模型，并结合免疫组化（IHC）和免疫荧光（IF）对体内肿瘤组织进行验证。

研究结果具体如下：

MT1G在ccRCC中下调，但其高表达与不良预后、PI3K–AKT通路激活及铁死亡抑制相关

基于TCGA数据的转录组分析显示，ccRCC肿瘤组织中MT1G表达显著低于正常组织。然而，Kaplan–Meier生存曲线分析表明，高MT1G表达的患者总生存期明显短于低表达组，提示其作为不良预后指标的价值。GO和KEGG富集分析显示，MT1G相关基因显著富集于PI3K–AKT信号通路及脂肪酸代谢过程。基因集富集分析（GSEA）进一步揭示了其与铁死亡过程的强关联。此外，CIBERSORT分析显示高MT1G表达组中CD8+ T细胞、M1巨噬细胞和树突状细胞浸润减少，而调节性T细胞（Tregs）、M2巨噬细胞和中性粒细胞浸润增加。相关性分析证实了MT1G表达与PI3K水平呈正相关。

MT1G过表达显著增强ccRCC细胞的恶性表型

通过建立稳定过表达（MT1G-OE）和敲低（MT1G-KD）细胞模型，研究人员发现MT1G-OE组在24、48和72小时的OD值均显著高于Vector组，表明增殖潜能增强；而MT1G-KD细胞在各时间点OD值均显著降低。克隆形成实验显示MT1G-OE组形成的克隆数量更多、体积更大，而MT1G-KD组则相反。Transwell迁移实验表明MT1G-OE细胞迁移能力增强，MT1G-KD细胞迁移受损。流式细胞术分析显示MT1G-OE细胞凋亡率显著降低，而MT1G-KD细胞凋亡显著增加。

MT1G过表达通过上调铁死亡抑制因子抑制ccRCC细胞铁死亡

C11-BODIPY染色研究显示，MT1G-KD细胞中脂质过氧化（LPO）相关的绿色荧光强度、细胞内活性氧（ROS）水平及Fe²⁺积累均显著高于Vector组，而MT1G-OE细胞则显著降低。Western blot结果显示，MT1G-OE细胞中铁死亡抑制蛋白GPX4和SLC7A11表达上调，而促铁死亡蛋白ACSL4下调；MT1G-KD则呈现相反趋势。给予铁死亡抑制剂Ferrostatin-1（Fer-1）处理后，能够逆转MT1G-KD引起的ROS积累、LPO升高以及GPX4和SLC7A11的下调。

MT1G通过激活PI3K–AKT通路抑制铁死亡

Western blot分析表明，MT1G-KD细胞中PI3K蛋白水平和AKT磷酸化水平显著降低，而MT1G-OE细胞中则显著升高。使用PI3K特异性激动剂UCL-TRO-1938处理MT1G-KD细胞后，被抑制的PI3K–AKT信号活性得到恢复。更重要的是，UCL-TRO-1938处理显著增加了MT1G-KD细胞中GPX4和SLC7A11的表达，降低了ACSL4水平，从而部分抑制了铁死亡。

MT1G过表达促进裸鼠ccRCC异种移植瘤生长

体内实验中，接种MT1G-OE细胞的异种移植瘤表现出比Vector组更快的生长速度，最终肿瘤体积和重量更高；而MT1G-KD处理则显著抑制了肿瘤发展。免疫荧光分析显示，MT1G-OE肿瘤中增殖标记物Ki-67和血管标记物CD31的阳性率显著高于MT1G-KD组。

PI3K激动剂逆转MT1G敲低对ccRCC异种移植瘤的抑制作用

免疫组化染色显示，与Vector组相比，MT1G-KD肿瘤中SLC7A11阳性率显著降低，ACSL4阳性率增加。Western blot分析进一步证实，MT1G-KD肿瘤中PI3K、p-AKT、GPX4和SLC7A11水平显著降低，ACSL4表达强烈上调。值得注意的是，经PI3K激动剂UCL-TRO-1938处理后，这些分子变化被显著逆转，即PI3K、p-AKT、GPX4和SLC7A11表达水平回升，ACSL4下降。

在讨论部分，作者指出本研究揭示了MT1G在ccRCC中作为致癌因子的主要功能，其通过激活PI3K–AKT信号通路抑制铁死亡来驱动肿瘤恶性进展。这一发现与MT1G在肝癌等肿瘤中的抑癌作用形成鲜明对比，强调了其组织环境依赖性。研究人员推测，ccRCC中VHL–HIF-α轴的异常可能导致HIF-1α直接结合MT1G启动子区的缺氧反应元件（HREs），从而驱动其转录激活。从机制上看，MT1G可能利用其富含半胱氨酸的结构与PI3K的p85亚基相互作用，减弱PTEN的抑制作用。此外，该研究阐明的MT1G–PI3K–AKT–铁死亡轴不仅解释了ccRCC的铁死亡抵抗特性，还将其与肿瘤微环境（TME）的代谢适应性和免疫抑制特征联系起来，因为MT1G表达与特定免疫细胞浸润相关。尽管研究提供了扎实的实验证据，但作者也指出了局限性，如MT1G与PI3K的直接结合界面尚未通过Co-IP等方法验证，且体内实验主要依赖皮下移植模型，未能完全模拟人体肾脏原生环境。

论文结论部分总结道：首先，MT1G被确定为ccRCC中的重要致癌驱动因子，其高表达与患者不良临床结局密切相关。其次，研究初步阐明了MT1G致癌活性的核心机制：MT1G激活PI3K–AKT信号通路，进而上调铁死亡抑制因子GPX4和SLC7A11的表达，从而抑制肿瘤细胞铁死亡并促进ccRCC进展。这项工作不仅加深了对ccRCC铁死亡抵抗机制的理解，也为将MT1G–PI3K–AKT–铁死亡轴作为ccRCC潜在的预后生物标志物和新的治疗靶点提供了实验依据。