铜死亡相关基因LOXL2在甲状腺癌中的预后价值和治疗潜力

《Translational Oncology》：Prognostic value and therapeutic potential of the cuproptosis-related gene LOXL2 in thyroid cancer

　　

背景：铜死亡（cuproptosis）是一种铜依赖性的程序性细胞死亡形式，已被证实与多种癌症的进展相关。然而，铜死亡相关基因（CRG）LOXL2在甲状腺癌（THCA）中的作用及其预后价值仍未得到充分探索。方法：研究人员通过结合生物信息学筛选与实验验证的整合方法，系统研究了CRGs在THCA中的预后意义。利用The Cancer Genome Atlas（TCGA）数据库中的THCA队列对所有已识别CRGs的表达谱进行了分析，以评估其转录改变及与患者预后的关联。随后进行了通路富集、免疫浸润和药物敏感性分析，以探索这些基因的功能相关性。选择表现出显著差异表达和预后相关的CRGs，通过EdU增殖、CCK-8和Transwell试验进行体外功能验证，以阐明LOXL2在THCA进展中的作用。此外，研究人员还评估了铜死亡诱导剂对THCA细胞的抗肿瘤作用，以探索靶向铜死亡的潜在治疗策略。结果：系统表达分析确定了四个在THCA组织中显著失调的CRGs（MT1A、MT1F、LOXL2和MT1M）。基于这四个基因的表达模式，THCA患者被分为低风险组和高风险组。值得注意的是，高风险组表现出显著较低的免疫评分和较差的总生存期（OS）。通路分析揭示了高风险组中甘油磷脂代谢和氧化磷酸化的改变。在这四个基因中，LOXL2与THCA预后的相关性最强。功能试验表明，敲低LOXL2显著抑制了THCA细胞的活力、增殖、迁移和侵袭。重要的是，铜死亡激活剂的处理对THCA细胞发挥了强效的抗癌作用。结论：该研究提示LOXL2可能作为铜死亡相关通路的潜在生物标志物，并代表THCA的潜在治疗靶点。此外，研究结果表明，药理学靶向铜死亡相关基因可能为THCA的管理提供一种有前景的治疗策略。

甲状腺癌（THCA）作为最常见的内分泌恶性肿瘤，尽管总体预后优于其他癌症，但其全球发病率在过去十年中持续激增，尤其在年轻成人中占比显著，严重威胁公共健康。现有的细胞死亡形式如铁死亡、自噬等与癌症发展密切相关，而近期发现的铜依赖性细胞死亡形式——铜死亡（cuproptosis），涉及细胞内铜水平升高导致线粒体脂蛋白积累及Fe-S簇蛋白不稳定，刺激三羧酸循环（TCA循环）相关酶生成，进而调控铁代谢、氧化磷酸化和异常细胞增殖。血清铜浓度升高与THCA进展相关，且铜氧化相关基因FDX1影响THCA患者生存预后，但铜死亡相关基因（CRGs）在THCA中的具体作用和潜在治疗价值尚不明确。赖氨酰氧化酶样蛋白2（LOXL2）作为一种依赖铜和赖氨酰酪氨酸醌（LTQ）的胺氧化酶，已被证实可通过促进上皮间质转化（EMT）、缺氧和血管生成支持肿瘤恶性进展，但其在THCA中的角色尚未见报道。因此，本研究旨在通过生物信息学与实验验证相结合的方法，系统探究CRGs在THCA中的预后意义及LOXL2的生物学功能，为THCA的临床治疗提供新靶点。

本研究主要采用以下关键技术方法：利用TCGA数据库获取THCA患者RNA测序数据及临床信息；通过CIBERSORT、ESTIMATE算法及TIDE数据库分析肿瘤微环境（TME）免疫细胞浸润及免疫逃逸；利用GDSC数据库结合oncoPredict包预测药物敏感性；采用EdU、CCK-8及Transwell试验验证细胞增殖、迁移与侵袭能力；通过RT-qPCR及Western blotting检测基因表达水平。

研究结果

Identification of differentially expressed CRGs in THCA patients

研究人员从Todd R. Golub等人鉴定的41个CRGs出发，基于TCGA数据库分析THCA组织与正常甲状腺组织的表达差异，筛选出4个显著差异表达的CRGs：LOXL2上调，而MT1A、MT1M和MT1F下调。

Establishment and validation of the CRG risk model

通过多变量Cox回归建立预后模型，风险评分公式为：Risk score = (0.0302) × MT1A + (0.312) × LOXL2 + (0.1902) × MT1M + (0.1111) × MT1F。高风险组死亡率更高，LOXL2表达升高，且总生存期（OS）显著低于低风险组（log-rank p = 0.00876）。ROC曲线显示该模型具有良好的预测准确性（1年AUC=0.909，3年AUC=0.735，5年AUC=0.678）。

CRGs regulate important cancer pathways in THCA

单样本基因集富集分析（ssGSEA）显示，LOXL2表达与血管生成、EMT标志物及细胞外基质（ECM）降解呈正相关；MT1A与ECM相关基因、糖酵解及脂肪酸降解相关；MT1F与DNA复制、ECM降解及P53通路负相关；MT1M与脯氨酸代谢、精氨酸降解及脂肪酸降解正相关，与DNA复制负相关。

GO and KEGG analyses of the CRGs

基因本体（GO）分析显示差异表达基因（DEGs）显著富集于受体调节活性、胶原含ECM、钙信号通路、氧化应激及PI3K-AKT信号通路等。京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析表明，高风险组氧化磷酸化、甘油磷脂代谢、粘着斑等通路显著激活；低风险组ECM降解、花生四烯酸代谢、凋亡等通路更显著。

The necroptosis score is correlated with tumour microenvironment (TME) characteristics

免疫微环境分析显示，高风险组静息记忆CD4+ T细胞比例较高，且APC共抑制、细胞因子受体信号等多种免疫相关特征存在显著差异。高风险组基质评分显著升高，免疫评分和ESTIMATE评分显著降低，且TIDE值升高，提示免疫监视受损。

The expression of CRGs is related to immune infiltration levels in THCA

ESTIMATE分析表明，LOXL2和MT1A表达与ESTIMATE评分、基质评分及免疫评分呈正相关，MT1F则呈负相关。进一步分析显示，LOXL2表达与B细胞浸润负相关，与内皮细胞和巨噬细胞正相关；MT1A与内皮细胞正相关；MT1F和MT1M与巨噬细胞、NK细胞及CD4+ T细胞负相关，与内皮细胞和CD8+ T细胞正相关。

Predicting the sensitivity of THCA patients to antitumour therapy with the cuproptosis score

药物敏感性分析显示，低风险组对曲美替尼（trametinib）和吉非替尼（gefitinib）响应更高；高风险组对阿西替尼（axitinib）、BI-2536、帕唑帕尼（pazopanib）、阿立塞替布（allisertib）、司美替尼（selumetinib）和卡莫司汀（carmustine）更敏感。

LOXL2 was highly expressed in THCA and associated with poor prognosis

LOXL2在THCA细胞系及组织中高表达，且高表达LOXL2的患者生存率更低，提示LOXL2是THCA潜在的预后标志物。

LOXL2 knockdown inhibits THCA cell proliferation, migration and invasion

通过siRNA敲低LOXL2后，CCK-8及EdU试验表明THCA细胞活力和增殖能力显著降低；Transwell试验显示细胞迁移和侵袭能力减弱，证实LOXL2在THCA进展中发挥关键作用。

Targeting the cuproptosis pathway inhibits THCA progression

铜死亡诱导剂依莱克洛莫（elesclomol）处理THCA细胞后，IC50值分别为3.908 nM（TPC-1）和36.49 nM（K1），显著抑制细胞活力、增殖、迁移和侵袭。同时，elesclomol处理后LOXL2蛋白水平降低（mRNA水平无显著变化），提示其可能通过LOXL2途径减缓THCA进展。

讨论与结论

讨论部分指出，THCA虽预后较好但发病率上升需关注。铜死亡作为新型细胞死亡途径，其相关基因在癌症诊疗中具有潜力。本研究发现MT1A、MT1F、MT1M下调及LOXL2上调与THCA预后相关，GO/KEGG分析提示CRGs可能通过氧化应激、钙信号通路及PI3K-AKT信号通路发挥作用。高风险组氧化磷酸化和甘油磷脂代谢激活，且与免疫微环境中免疫细胞及基质细胞浸润减少相关，解释了预后差异。体外实验验证了LOXL2促进THCA细胞恶性行为的作用，且elesclomol处理效果与LOXL2敲低一致。LOXL2作为CRG与铜死亡的相互作用未见报道，本研究首次发现elesclomol处理后LOXL2蛋白水平下降，可能与细胞外铜浓度失衡有关。局限性在于LOXL2与铜死亡的机制关系未明，缺乏体内实验验证，结论为假设生成性。

结论：LOXL2作为CRG，可能成为预测THCA预后和肿瘤进展的当代生物标志物。靶向铜死亡有望成为THCA的新型治疗策略。本研究由多项基金资助，数据来自TCGA数据库，发表于《Translational Oncology》。