《Ultrasonics》：Characterization of microvascular remodeling in metastatic sentinel lymph nodes via skeletonization framework generated by ultrasound localization microscopy
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姜凌音|杜炳泽|吴一云|蔡婷|张国锋|朱一飞|丁波|薛红辉|吴晓歌|林涵|吴军|徐青松|张东|涂娟中国南京大学物理学院声学系，心血管信息与健康工程医学江苏省重点实验室，南京210093摘要淋巴液向前哨淋巴结（SLN）的扩散是乳腺癌早期转移的主要途径。由于转移过程主要由病理性的血管
姜凌音|杜炳泽|吴一云|蔡婷|张国锋|朱一飞|丁波|薛红辉|吴晓歌|林涵|吴军|徐青松|张东|涂娟
中国南京大学物理学院声学系，心血管信息与健康工程医学江苏省重点实验室，南京210093
摘要
淋巴液向前哨淋巴结（SLN）的扩散是乳腺癌早期转移的主要途径。由于转移过程主要由病理性的血管生成驱动，因此高分辨率成像和SLN微血管的量化对于评估肿瘤扩散至关重要。在本研究中，我们将超声定位显微镜（ULM）应用于兔VX2乳腺肿瘤模型，并开发了一种基于骨架化的分析框架来量化淋巴微血管形态。该方法从灰度ULM图像中提取血管中心线，以得出描述微血管结构的五个形态参数。我们的结果表明，ULM能够实现目标区域的亚波长可视化，揭示了转移性SLN特有的迂曲密集的新血管网络。定性观察和定量指标一致地表明，转移性SLN与正常SLN在结构上存在显著差异。具体来说，转移性SLN表现出更密集、更无序的血管组织，这与原发肿瘤的微血管模式不同。这些发现为临床应用提供了实验基础，表明基于ULM的微血管特征分析作为诊断乳腺癌淋巴转移的非侵入性方法具有巨大潜力。
引言
根据最新的全球癌症统计数据，乳腺癌是女性患者中最常诊断出的恶性肿瘤，并且继续造成巨大的死亡和社会经济负担[1]，[2]。肿瘤转移被认为是预后的关键决定因素。在乳腺癌的早期阶段，转移通常通过淋巴系统依次进行。大量的临床证据表明，前哨淋巴结（SLN）作为淋巴液扩散的第一个站点，能够可靠地反映整个区域淋巴系统的转移状态，是早期乳腺癌诊断和预后的关键指标[3]，[4]，[5]，[6]。转移阴性的SLN通常表示没有进一步的腋窝受累，患者可以避免额外的腋窝手术。相反，SLN阳性需要及时进行手术或系统干预以改善生存结果。因此，准确评估SLN的状态对于乳腺癌的适当分期和治疗决策至关重要。
肿瘤生长和转移与病理性血管生成高度相关[7]，[8]。当肿瘤直径超过1-3毫米时，肿瘤微环境中的缺氧会刺激血管内皮生长因子（VEGF）和基本成纤维细胞生长因子（bFGF）等促血管生成因子的过度表达，从而促进新血管的形成。这些新形成的血管通常缺乏成熟的平滑肌层，表现出不规则的分支、迂曲和动静脉分流，形成高度无序的血管网络[9]。类似的血管生成过程也发生在癌症转移过程中的SLN中。正常淋巴结的血管从淋巴结门向皮质呈放射状排列，而转移性浸润会破坏这种结构，产生异常的新血管。这些观察结果表明，异常的血管生成可能是淋巴转移的潜在标志，对SLN的血管成像可能有助于早期检测转移[10]，[11]。
超声成像由于其非侵入性、无电离辐射、便携性和低成本等优点，在临床实践中得到了广泛应用。在各种技术中，多普勒超声仍然是检测血流的最成熟方法。特别是彩色多普勒成像可以显示血流速度和方向，而功率多普勒成像仅显示血流强度，但具有更高的检测灵敏度。然而，传统多普勒成像使用高通带壁滤波器来抑制低频组织运动，这无意中会去除小血管中的慢血流信号[12]。近年来，平面波复合和时空杂波抑制方法（如奇异值分解（SVD）的进步使得微血管成像技术（例如超微血管成像（SMI）能够显著提高对弱血流的灵敏度[13]，[14]，[15]，[16]，[17]。尽管如此，多普勒和SMI的空间分辨率仍受限于声波波长。例如，在5 MHz的激发频率下，理论分辨率极限约为150微米，难以分辨与癌症转移密切相关的微血管结构。
超声定位显微镜（ULM）的出现为超分辨率微血管成像带来了革命性的发展。受光学定位显微镜[18]的启发，ULM将静脉注射的微泡造影剂（直径1-3微米）定位为单个点散射体，并追踪其轨迹以克服声学衍射限制。通过以超快帧率重建微血管网络，ULM实现了接近波长十分之一的空间分辨率，并对慢血流表现出极高的灵敏度[19]，[20]，[21]，[22]。随着成像硬件和重建算法的不断改进，ULM已成功应用于神经科学和临床研究[23]，[24]，[25]，[26]。值得注意的是，通过有效补偿呼吸和心脏搏动等生理运动，ULM现在能够在包括肝脏、肾脏和淋巴组织在内的器官中进行稳定的微米级血管重建[27]。在肿瘤学中，通过提供详细的血管形态和血流速度可视化，ULM为转移检测提供了新的可能性，并在肿瘤侵袭评估和治疗监测方面具有巨大潜力。
本研究旨在利用ULM来研究转移过程中SLN的微血管重塑，并评估其在早期检测乳腺癌转移方面的潜力。为此，我们开发了一个将ULM成像与基于骨架化的分析方法相结合的定量框架来描述血管形态。基于在八只兔子上建立的VX2乳腺肿瘤模型，我们对每只兔子的腘窝淋巴结和/或原发肿瘤进行了ULM成像。在定量分析中，对ULM图像进行了骨架化处理，并提取了各种超分辨率血管形态参数，以区分转移阳性和转移阴性淋巴结。结果进一步证明了ULM在揭示转移性和非转移性SLN之间的一致性差异方面的能力。这些结果表明，ULM作为一种非侵入性工具，在精确评估早期SLN转移方面具有巨大潜力，可能有助于提高乳腺癌分期的准确性。
节片段
动物准备
使用八只2.5个月大的新西兰白兔（2.7-3.7公斤；中国莱夫动物繁殖中心）建立了VX2乳腺肿瘤模型。所有实验方案均得到了南京中医药大学附属医院的动物伦理和福利委员会的批准，并由经过认证的技术人员执行。
为了生成供体肿瘤，将处于对数生长阶段的VX2癌细胞（2×10^6个细胞；中国吉源博悦生物工程有限公司）注射到
分组分配和基于IHC的微血管量化
根据H&E染色评估，3只兔子的腘窝淋巴结中发现了转移性病变，这些兔子被指定为MP组，其余5只兔子组成MN组。图4a显示了一个MP淋巴结的代表性H&E染色切片，淋巴结门用黄色标出，转移区域用红色标出。这些转移区域表现出典型的细胞学异常，特征是核增大、染色加深且轮廓不规则，
讨论
在本研究中，我们展示了ULM在兔乳腺癌模型中对SLN进行高分辨率微血管成像的能力，并结合了基于骨架化的血管结构定量分析。ULM图像的定性检查和定量分析均显示，MP-LN表现出类似肿瘤的微血管结构，明显区别于MN-LN。这些发现表明，ULM有可能作为一种有效的
结论
总之，本研究建立了一个新的成像框架，将ULM与基于骨架化的定量分析相结合，用于描述乳腺癌转移过程中SLN的微血管重塑。该框架能够实现亚波长级别的淋巴结微血管可视化，揭示了转移阴性和转移阳性SLN之间的显著质量和数量差异。转移性病变的特点是血管密集且混乱
CRediT作者贡献声明
姜凌音：撰写——原始草稿，研究，正式分析，数据管理。杜炳泽：撰写——原始草稿，软件，正式分析，数据管理。吴一云：撰写——原始草稿，验证，项目管理，数据管理。蔡婷：研究，正式分析，数据管理。张国锋：软件，研究。朱一飞：可视化，软件。丁波：软件，资源管理。薛红辉：可视化，正式分析。吴晓歌：可视化，验证。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（编号：12227808、12274220和12574497）和江苏省自然科学基金（编号：BE2023818和BK20222002）的支持。
