脉冲超声诱导的基因工程细菌蛋白纳米粒子的空化行为

《Ultrasonics Sonochemistry》：Cavitation behaviors of genetically engineered bacterial protein nanoparticles induced by pulsed ultrasound

　　冯高|杨海燕|罗晓青|龚婷|邹建忠|秦对|周玉峰
中国重庆医科大学医学与工程超声国家重点实验室，重庆400016

摘要
基因工程改造的细菌蛋白纳米颗粒（GVs-E.coli）凭借其天然的肿瘤趋向性、良好的生物安全性和固有的空化活性，增强了高强度聚焦超声（HIFU）的治疗效果。然而，GVs-E.coli的空化行为尚未得到系统研究，其背后的调控机制也尚未完全阐明，这成为限制其最佳诊疗应用的关键知识空白。在此研究中，我们使用定制的超声平台，在模拟组织的琼脂糖幻影中的无壁流道内研究了GVs-E.coli的空化行为。在不同峰值负压（PNPs）和细菌浓度下进行了被动空化检测（PCD），并分析了声发射在时间和频率域的表现。研究结果表明，GVs-E.coli的稳定空化（SC）阈值为1.6 MPa，惯性空化（IC）阈值为2.2 MPa。空化剂量与PNP呈正相关，但谐波和次谐波表现出不同的增长模式。研究发现，OD600（600 nm处的光密度）= 1.0时，空化活性最为显著。这些发现为优化GVs-E.coli介导的超声疗法奠定了基础，并加速了其作为下一代声敏剂的临床转化。

1. 引言
超声诱导的空化——即在声学激励下微观气泡核的振荡或崩塌——是生物医学超声应用中的关键现象[1]。研究表明，空化可以暂时打开血脑屏障（BBB），增强药物的经皮渗透性，并促进药物和/或纳米材料的细胞内递送[2][3]。此外，它还是一种有效的策略，用于增强对目标组织的热消融和机械损伤。空化介导的肿瘤碎片分解可以刺激免疫系统，从而改善生存结果并产生有益的远端效应[4]。
外源性气泡核被用来降低引发声空化所需的超声能量。由脂质、蛋白质或聚合物壳包裹惰性气体核心的气体微泡（MBs）已被广泛研究作为超声造影剂（UCAs），以增强和调节空化[5]。虽然这些MBs已被批准用于临床超声心动图和微血管多普勒成像，但最近显示出在癌症治疗中的潜力[6][7]。然而，它们由于相对较大的尺寸（例如在μm级别），限制了它们在血管系统中的分布，无法穿透实体肿瘤或致密的间质组织[8]。此外，它们缺乏强烈的靶向特异性，这引发了安全问题，因为它们在相邻正常组织中的积累可能会由于声能重新分布而引发脱靶的热损伤或机械损伤[9]。为了解决这些限制，开发了纳米级的空化剂，如聚合物包裹的纳米气泡（NBs）。然而，这些剂主要依赖于通过增强渗透性和保留效应的被动靶向，这对于精确的肿瘤定位来说是不够的[10]。此外，它们的体内循环时间非常短（例如只有几分钟），从而限制了它们用于持续或重复治疗的效用[11]。
气体囊泡（GVs）是由细菌和古菌产生的基因编码的、惰性的、中空的、充满气体的蛋白质纳米颗粒。它们具有纺锤形形态（类似于鱼的鳔），长度为0.1–2 μm，宽度为45–200 nm。由于其微小的尺寸、高稳定性和生物相容性，工程化和改良的GVs已被探索作为造影剂、药物递送载体和免疫增强剂，用于疾病的预防、诊断和治疗，并取得了有希望的初步结果。大肠杆菌（E.coli）通过其厌氧趋向性天然定植于肿瘤核心的缺氧区域，并可通过基因工程表达趋化受体，使其响应肿瘤微环境信号并随后抑制肿瘤进展。通过利用E.coli作为递送载体并利用其良好的生物安全性，表达在E.coli中的GVs（GVs-E.coli）已成为一种有前景的癌症治疗声敏剂，正如我们之前的研究所示[10][12]。体内实验证实，GVs-E.coli可以在高强度聚焦超声（HIFU）治疗过程中增强空化、热消融和药物递送。例如，GVs-E.coli作为空化核协同增强了HIFU的治疗效果，与对照组相比，肿瘤抑制率高达87%[8]；与GVs-E.coli结合的紫杉醇（PTX）和全氟己烷（PFH）阳离子脂质纳米颗粒（PTX-CLs）增强了PTX-CLs在肿瘤中的积累，从而促进细胞凋亡并抑制残留肿瘤组织的增殖[12]；GVs-E.coli与全氟己烷/聚乳酸-羟基乙酸（PFH/PLGA）纳米颗粒（记为GVs-E@PP）结合，调节了肿瘤的声学环境——增加了胶原纤维、弹性模量和声速，并减少了肿瘤血管生成——最终显著降低了肿瘤增殖并延长了携带肿瘤的小鼠的生存期[14]。
为了推进GVs-E.coli的安全和有效应用，对其空化活性的全面表征是必不可少的。声空化特性通常使用被动空化检测（PCD）进行量化，该技术能够对空化气泡发出的信号进行频谱分析[14]。通过检测振荡气泡的二次声发射并分析频率域特征，PCD可以区分空化状态：谐波发射对应于低幅度振荡，次谐波是稳定空化（SC）的标志，而宽带噪声表示惯性空化（IC）[15][16]。不同微生物的GVs的临界崩塌压力范围从0.09 MPa到1 MPa，它们的声学响应存在显著差异[17]。在0.4 MPa的声压下，GVs显示出更强的基频（1 MHz）信号、明显的谐波和与磷酸盐缓冲盐水（PBS）对照组相比的重叠宽带信号。GVs在第一个施加的超声脉冲期间（至少5000个周期）内诱导空化，但这种气泡活动在随后的脉冲中迅速减弱[18]。在0.5 MHz的激发频率下，空化发射主要是宽带的，而在1.6 MHz时，主激发频率的谐波处的窄带内容占主导。数值模拟和高速摄像机成像研究表明，检测到的空化发射并非来自单个GVs，而是GVs在超声暴露过程中释放的气体聚集成较大气泡的结果。然而，GVs-E.coli诱导的空化活性尚未得到表征。鉴于GVs在细菌膜内形成细胞内簇，它们的空化特性预计与自由GVs不同。
本研究旨在阐明在一系列声学参数下GVs-E.coli在模拟组织血管幻影中的空化行为和特性。开发了一个定制的超声暴露平台，其中集成了一个无壁琼脂糖流道以容纳GVs-E.coli悬浮液。在峰值负压（PNPs）从1.0 MPa到3.0 MPa和光密度OD600高达2.0的细菌浓度下，通过平面传感器被动检测空化诱导的声发射。PCD信号使用示波器捕获，并在时间和频率域进行分析。这项研究有望提供关于GVs-E.coli声学活性的见解，从而有助于合理设计和优化GVs-E.coli介导的超声疗法。

2. 材料与方法
2.1. GVs-E.coli的制备
GVs-E.coli的制备按照我们之前建立的方案进行[8]。简要来说，首先在37℃和220 rpm下在Luria-Bertani（LB）培养基中培养E.coli BL21(AI)。为了表达GVs，将细菌用质粒pET28a_T7-ARG1转化，并用于接种起始培养物（LB培养基+50 μg/ml卡那霉素+1%葡萄糖），然后在37℃下培养16小时。将该培养物以1:100的比例稀释到含有50 μg/ml卡那霉素和0.2%葡萄糖的新鲜LB培养基中，并在37℃下培养至OD600=0.5的浓度（使用Infinite 200 pro，Tecan Trading AG，瑞士）。然后用0.5% L-阿拉伯糖和0.4 mM IPTG在30℃下诱导表达22小时[19]。诱导后，通过离心（350 g，2小时，4℃）收集GVs-E.coli，用无菌PBS洗涤三次并储存。三天后，通过透射电子显微镜（TEM，7500，Hitachi High-Tech，东京，日本）观察GVs-E.coli，如图1所示。

2.2. 幻影制备
制备了一个含有GVs-E.coli悬浮液流动通道的模拟组织琼脂糖幻影。简要来说，将1.5 g琼脂糖粉末（Biowest，布尔戈斯，西班牙）溶解在100 mL去离子水中，然后在微波炉中加热（30秒间隔旋转）直至完全透明。使用真空泵（DZF-6030，上海浩庄仪器有限公司，上海，中国）在20分钟内将琼脂糖溶液的压力逐渐从500 mbar降至70 mbar。将一根直径为3 mm的石墨棒水平放置在定制的丙烯酸模具（5 cm × 5 cm × 2 cm）内，小心倒入脱气的琼脂糖溶液而不干扰石墨棒，然后在室温下让块状物凝胶约30分钟。轻轻取出石墨棒后，将形成的通道连接到硅胶管上，并用防水胶带密封以防止气体交换和气泡形成。

2.3. 实验装置
实验装置如图2所示。这里提到的定制超声平台是指下面详细描述的现成组件的集成，不涉及任何专有硬件。所有超声暴露都在充满脱气水（溶解的O2 < 3 mg/L）的容器中进行，以最小化声学衰减和气泡形成。单个元件聚焦换能器（ML-P1，重庆荣海超声医学工程技术研究中心有限公司，重庆两江新区，中国；中心频率为1.062 MHz，焦距为54.2 mm，孔径直径为60 mm）的安装使其焦点与琼脂糖幻影中的3-mm流道轴重合。简而言之，脉冲发生器/接收器（DPR-300，Imaginant，Pittsford，NY，美国）以10 kHz的脉冲重复频率（PRF）传输脉冲，回声在数字示波器（DHO-4404，Rigol，江苏苏州）上捕获。通道暂时充满空气，然后使用3D平台（FMC-4030，成都富宇科技有限公司，成都，中国）移动聚焦换能器，直到回声幅度达到峰值，确认焦点对齐。任意波形发生器（DG4000，Rigol，江苏苏州）产生所需的波形，该波形由射频功率放大器（Model 240 L，Electronics & Innovation，罗切斯特，NY，美国）放大并传递给聚焦超声换能器。

2.4. 被动空化检测（PCD）
为了表征GVs-E.coli产生的声空化活性，将一个平面换能器（中心频率为2.25 MHz，V306-SU，Evident，Waltham，MA，美国）安装在琼脂糖通道的近场和远场之间约3 cm的位置，以最大化信号接收。接收到的发射信号由增益为20 dB的脉冲发生器/接收器放大，并在DHO-4404数字示波器上以62.5 MHz的采样率数字化，该示波器与任意波形发生器同步触发。

2.5. 稳定和惯性空化阈值及剂量
通过声发射信号的光谱特征区分气泡空化。谐波和超谐波成分表示SC，而谐波之间的宽带噪声表示IC。对于每次采集，记录的时间域信号x(t)使用快速傅里叶变换（FFT）在MATLAB（MathWorks，Natick，MA，美国）中转换为频率谱X(f)和功率谱密度|X(f)|2。应用每个带宽为1 kHz的梳状滤波器来分离第2-4次谐波（2f0-4f0，f0 = 1.062 MHz是基频）以及0.5、1.5、2.5、3.5和4.5次超谐波。谐波和超谐波成分的累积能量定义为稳定空化剂量（SCD），而宽带噪声的剂量定义为惯性空化剂量（ICD）。
(1) ICD=∫05f0X(f)2df - SCD
为了确定SC的阈值，首先计算声发射信号的谱。如果0.5f0处的次谐波幅度至少比0.25f0和0.75f0处的幅度高3 dB，如图3所示，则认为发生了SC[20]。同时，IC阈值定义为GVs-E.coli产生的宽带噪声显著高于在相同条件下使用脱气PBS获得的基线的最低压力。

2.6. 统计分析
每种条件下的所有测量至少进行三次，相应结果以平均值±标准差报告。使用ORIGIN（OriginLab，Northampton，MA，美国）中的一尾Student’s t检验进行实验数据成对比较，p < 0.05被认为具有统计学意义。

3. 结果
3.1.**声场**
聚焦超声换能器的声场是使用针式水听器（HN-0500，Precision Acoustics，英国多塞特）在脱气水中进行测量的（见图4）。沿x轴和y轴的-6 dB焦距分别为2.42毫米和2.57毫米，这足以覆盖GVs-E.coli流动的横截面。在换能器轴上54.2毫米处观察到一个峰值压力幅度，其-6 dB焦距为18.5毫米。

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**图4.** 通过水听器扫描获得的焦平面（a）和沿传输换能器轴的（b）标准化声压分布。

**3.2. GVs-E.coli的空化信号和频谱**
PBS和GVs-E.coli样品都暴露在超声脉冲下，它们的声发射信号、频率谱和功率密度谱进行了比较（见图5）。在低声压下（例如，PNP = 1 MPa），PBS发生线性振荡，其频谱中仅显示基频和少数谐波。随着激发压力的增加，GVs-E.coli的空化信号幅度显著高于PBS对照组。因此，在频率和功率密度谱中出现了明显的谐波、超谐波和宽带噪声。在高声压下（例如，PNP = 3 MPa），宽带噪声主导了GVs-E.coli的频率和功率密度谱，这归因于强烈的IC（空化）活动。在这种条件下，次谐波和超谐波变得可以忽略不计或甚至消失，表明GVs-E.coli诱导的空化活动强烈依赖于声激发压力，这与UCAs（超声微泡）和GVs的行为相似[21]。值得注意的是，GVs-E.coli的超谐波为4f0/3和5f0/3，而UCAs中的超谐波为3f0/2和5f0/2（例如，Sonovue）。这种差异可能与GVs-E.coli的不规则形态有关。

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**图5.** 由200 μs脉冲在1 kHz脉冲重复频率下产生的代表性声发射信号（左列）及其对应的频率谱（中列）和功率密度谱（右列），峰值负压力分别为（a）1.0 MPa、（b）2.0 MPa和（c）3.0 MPa，来自GVs-E.coli悬浮液（OD600 = 2.0）和PBS。

**3.3. 与PNP相关的SC阈值和剂量**
如图6所示，为了评估GVs-E.coli的SC（空化）活性，量化了谐波和次谐波的能量。在整个测试压力范围内（1.0–3.0 MPa），GVs-E.coli在两个指标上均表现出比PBS更高的谐波和次谐波能量，证实了其诱导SC的优越能力。尽管SC能量随PNP增加而增加，但不同谐波和次谐波的增长模式有所不同。谐波能量呈指数增长，而次谐波能量在1.6 MPa和2.4 MPa时分别经历了两个阶段的增长。SC阈值是根据识别次谐波和超谐波的标准确定的。在1.6 MPa的超声压力下，观察到次谐波能量的显著增加（图6b中p < 0.01）。随着声压的升高，GVs-E.coli的高阶谐波和次谐波相对于PBS变得更加突出。当PNP增加到2.4 MPa时，次谐波能量达到了相对较高的水平。

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**图6.** 1.062 MHz超声脉冲（脉冲持续时间：200 μs；PRF：1 kHz）的峰值负压力（PNP）对GVs-E.coli（OD600 = 2.0）和PBS的（a）谐波和（b）次谐波能量的影响，*：p < 0.05，**：p < 0.01，***：p < 0.005。

**3.4. 与PNP相关的IC阈值和剂量**
分析了宽带噪声（IC的公认声学特征），以表征在不同PNP下GVs-E.coli的空化动态（见图7）。随着PNP的增加，其增长模式显示出不同的阶段。在低压力（1.0–1.4 MPa）下，GVs-E.coli的宽带噪声能量与PBS相当，表明IC活动最小。在1.6 MPa的SC阈值下，GVs-E.coli悬浮液显示出比PBS更高的宽带噪声（p < 0.05）。在1.6 MPa到2.2 MPa之间，宽带噪声有中等程度的增加，这对应于某些细菌中GV的部分破裂，并与谐波和次谐波的逐渐增长相吻合（见图6），表明SC和IC事件同时发生。当PNP超过大约2.4 MPa时，检测到宽带噪声的显著增加，主要是由于GV蛋白壳的广泛破裂和在强烈声激发下的广泛IC活动。

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**图7.** 1.062 MHz超声脉冲（脉冲持续时间：200 μs；PRF：1 kHz）的峰值负压力（PNP）对GVs-E.coli的宽带噪声能量的影响，*：p < 0.05，**：p < 0.01，****：p < 0.001。

**3.5. 与GVs-E.coli浓度相关的SCD**
在PNP为2.0 MP时，研究了GVs-E.coli浓度（OD600值变化，其中OD600 = 0对应于PBS）与SC活性之间的关系，该压力不足以破裂GV蛋白壳（见图8）。在低浓度下（例如，OD600 < 1），谐波和次谐波剂量都较低，表明SC活性有限，并存在一个引发空化的浓度阈值。超过这个阈值后，谐波能量持续增加，而次谐波能量最初上升，然后在OD600超过约1.75时趋于平稳。这种饱和和受限的增加可能是由于GVs-E.coli内部存在完整的蛋白壳。相比之下，谐波能量的持续增加可能是由于溶液中GV的数量较多，从而增强了声散射。

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**图8.** 1.062 MHz超声脉冲（脉冲持续时间：200 μs；PRF：1 kHz；PNP：2.0 MP）引起的（a）谐波和（b）次谐波能量对GVs-E.coli浓度的影响，*：p < 0.05，**：p < 0.01，****：p < 0.001。

**3.6. 与GVs-E.coli浓度相关的ICD**
为了评估GVs-E.coli浓度与IC活性之间的关系，在PNP为2.2 MP时对不同OD600值的样品进行了超声处理——该压力之前已被确定为IC阈值（见图9）。当OD600 < 1时，GVs-E.coli的宽带噪声仅比PBS略有增加（OD600 = 0），表明GV的数量不足以引发显著的空化活动。随着OD600的增加，宽带噪声稳步上升，表明GVs-E.coli浓度与IC剂量之间存在正相关。较高的GVs-E.coli浓度可能增强GV破裂和塌陷的概率，从而加剧IC。值得注意的是，在测试的浓度范围内没有观察到饱和现象，表明通过增加焦点区域的GVs-E.coli浓度可以进一步放大IC。

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**图9.** 1.062 MHz超声脉冲（脉冲持续时间：200 μs；PRF：1 kHz）引起的宽带噪声能量对GVs-E.coli浓度的影响，*：p < 0.05，**：p < 0.01，***：p < 0.005。

**4. 讨论**
GVs已成为超声成像和超声介导疗法中的有前景的生物分子对比剂和空化核。GVs-E.coli的空化效应在某些超声治疗策略中起着重要作用，包括用于实体肿瘤的HIFU消融、止血和基因/药物输送。空化阈值和适当的剂量对于确保治疗效果和安全性至关重要。在本研究中，使用PCD评估了在不同细菌浓度和声学PNP下GVs-E.coli的空化特性和剂量。我们的测量结果与磷脂壳UCAs[21]有显著差异。在GV-E.coli中观察到的周期三倍频空化特征和升高的压力阈值归因于细胞内的GVs，而不是细菌本身的声散射或阻尼。不含气体的细菌表现为充满液体的弹性壳，在亚波长范围内其散射截面遵循瑞利散射，与(a/λ)4成正比，其中a是细胞半径，λ是声波波长。它们与MHz频率超声的相互作用本质上是线性的且较弱，这一特性与产生分数次谐波发射不兼容[22]。此外，直接比较表达GVs的E.coli和不表达GVs的E.coli表明，只有携带基于GV的遗传结构的细菌才能产生强烈的非线性声学对比度，而不表达GVs的对照组则没有可检测到的非线性信号[19]。这证实了观察到的空化活动源于基因工程，而不是细菌本身的特性。值得注意的是，GVs-E.coli的分数次谐波为4f0/3和5f0/3，而UCAs中的次谐波为3f0/2和5f0/2（例如，Sonovue）。这种差异可能与GVs-E.coli的不规则形态有关。

**5. GVs-E.coli浓度依赖的SCD和ICD**
在PNP为2.0 MP时，研究了GVs-E.coli浓度（OD600值变化，其中OD600 = 0对应于PBS）与SC活性之间的关系，该压力不足以破裂GV蛋白壳（见图8）。在低浓度下（例如，OD600 < 1），谐波和次谐波剂量都较低，表明SC活性有限，并存在一个引发空化的浓度阈值。超过这个阈值后，谐波能量持续增加，而次谐波能量最初上升，然后在OD600超过约1.75时趋于平稳。这种饱和和受限的增加可能是由于GVs-E.coli内部存在完整的蛋白壳。相比之下，谐波能量的持续增加可能是由于溶液中GV的数量较多，从而增强了声散射。

**讨论**
GVs作为超声成像和超声介导疗法中的空化核的生物分子对比剂显示出巨大潜力。GVs-E.coli的空化效应在某些超声治疗策略中起着重要作用，包括用于实体肿瘤的HIFU消融、止血和基因/药物输送。空化阈值和适当的剂量对于确保治疗效果和安全性至关重要。在本研究中，使用PCD评估了在不同细菌浓度和声学PNP下GVs-E.coli的空化特性和剂量。我们的测量结果与磷脂壳UCAs[21]有显著差异。在GV-E.coli中观察到的周期三倍频空化特征和升高的压力阈值归因于细胞内的GVs，而不是细菌本身的声散射或阻尼。不含气体的细菌表现为充满液体的弹性壳，在亚波长范围内其散射截面遵循瑞利散射，与(a/λ)4成正比，其中a是细胞半径，λ是声波波长。它们与MHz频率超声的相互作用本质上是线性的且较弱，这一特性与产生分数次谐波发射不兼容[22]。此外，直接比较表达GVs的E.coli和不表达GVs的E.coli表明，只有携带基于GV的遗传结构的细菌才能产生强烈的非线性声学对比度，而不表达GVs的对照组则没有可检测到的非线性信号[19]。这证实了观察到的空化活动源于基因工程，而不是细菌本身的特性。值得注意的是，GVs-E.coli的分数次谐波为f0/3和2f0/3，而MBs（微泡）的次谐波通常为f0/2。这种独特的光谱特征表明，GVs的刚性蛋白壳与MBs的弹性脂质壳在非线性振荡方面存在本质差异[19]。因此，GVs的蛋白壳发生屈曲而不是弹性膨胀/压缩，这在特定声压下引入了不同的非线性恢复力，并可能倾向于周期三倍频分叉[23]。此外，GVs在E.coli内的限制调节了有效阻尼、共振频率以及随后囊泡的动态和空化特性。

**6. GVs-E.coli的ICD和SCD**
在PNP为2.0 MP时，研究了GVs-E.coli浓度（OD600值变化）与SCD和ICD之间的关系（见图9）。当OD600 < 1时，GVs-E.coli的宽带噪声仅比PBS略有增加（OD600 = 0），表明GV的数量较少不足以引发显著的空化活动。随着OD600的增加，宽带噪声稳步上升，表明GVs-E.coli浓度与IC剂量之间存在正相关。较高的GVs-E.coli浓度可能增强GV破裂和塌陷的概率，从而加剧IC。值得注意的是，在测试的浓度范围内没有观察到饱和现象，表明通过增加焦点区域的GVs-E.coli浓度可以进一步放大IC。

**讨论**
GVs作为超声成像和超声介导疗法中的空化核的生物分子对比剂显示出巨大潜力。GVs-E.coli的空化效应在某些超声治疗策略中起着重要作用，包括用于实体肿瘤的HIFU消融、止血和基因/药物输送。空化阈值和适当的剂量对于确保治疗效果和安全性至关重要。在本研究中，使用PCD评估了在不同细菌浓度和声学PNP下GVs-E.coli的空化特性和剂量。我们的测量结果与磷脂壳UCAs[21]有显著差异。在GV-E.coli中观察到的周期三倍频空化特征和升高的压力阈值归因于细胞内的GVs，而不是细菌本身的声散射或阻尼。不含气体的细菌表现为充满液体的弹性壳，在亚波长范围内其散射截面遵循瑞利散射，与(a/λ)4成正比，其中a是细胞半径，λ是声波波长。它们与MHz频率超声的相互作用本质上是线性的且较弱，这一特性与产生分数次谐波发射不兼容[22]。此外，直接比较表达GVs的E.coli和不表达GVs的E.coli表明，只有携带基于GV的遗传结构的细菌才能产生强烈的非线性声学对比度，而不表达GVs的对照组则没有可检测到的非线性信号[19]。这证实了观察到的空化活动源于基因工程，而不是细菌本身的特性。值得注意的是，GVs-E.coli的分数次谐波为f0/3和2f0/3，而MBs的次谐波通常为f0/2，这与SC相关。这种独特的光谱特征表明，GVs的刚性蛋白壳与MBs的弹性脂质壳在非线性振荡方面存在本质差异[19]。因此，GVs的蛋白壳发生屈曲而不是弹性膨胀/压缩，这在特定声压下引入了不同的非线性恢复力，并可能倾向于周期三倍频分叉[23]。此外，GVs在E.coli内的限制调节了有效阻尼、共振频率以及囊泡的动态和空化特性。

**7. GVs-E.coli的空化阈值**
发现诱导GVs-E.coli空化所需的声压阈值显著高于SonoVue，SC阈值为1.6 MPa（而SonoVue为0.4 MPa），IC阈值为2.2 MPa（而SonoVue为0.8 MPa）[21]。这种差异源于纳米级GVs和SonoVue微泡（1–10 μm）之间的尺寸差异[24]、[25]。较小的气泡受到更高的拉普拉斯压力，通常具有更高的共振频率[26]，因此需要更高的声压来引发空化。此外，细菌细胞质的粘度可能对细菌内GVs的振荡产生机械阻尼[27]、[28]。商业化的磷脂壳UCAs在低至中等压力下会发生显著振荡，显著增强谐波和次谐波发射，从而改善了对比增强超声（CEUS）成像。然而，在高压力下，壳层破裂和气体泄漏导致气体溶解、气泡耗尽和空化活性降低[29]。因此，SonoVue通常在其SC活动中表现出峰值分布[21]。相比之下，GVs的纳米级尺寸远离激发频率的共振范围，降低了气泡剧烈破裂的可能性[18]。高压下从GVs释放的气体聚集成MBs，而E.coli膜防止气体溶解和气泡破裂。因此，GVs-E.coli的SC活动呈现单调上升并最终饱和。这些特性使GVs-E.coli具有比传统UCAs更高的持久性和稳定性，能够持续、实时监测目标组织（例如肿瘤）中的细菌积累（在携带肿瘤的小鼠中约14天）[30]。尽管GVs-E.coli的空化阈值远高于SonoVue，但这些值仍处于已建立的治疗用聚焦超声系统的操作压力范围内。临床HIFU平台通常使用的PNP超过10 MPa，足以激活GVs-E.coli的空化[31]。GVs-E.coli的升高空化阈值导致空化活动在焦点区域内具有高度的空间选择性，大大降低了脱靶激活的风险。

**8. GVs-E.coli的SCD和ICD**
GVs-E.coli的SCD和ICD都随着细菌浓度的增加而单调增加。具体来说，GVs-E.coli的谐波能量持续上升，而次谐波能量逐渐增加，然后达到一个明显的饱和水平。这种行为与SonoVue显著不同，SonoVue的SCD在MBs浓度增加时呈现峰值分布，而ICD在整个浓度范围内持续上升[21]。声学阴影效应——即高浓度下MBs的大散射截面减弱入射声脉冲，屏蔽了远端气泡——可能是SonoVue中这种“上升和下降”趋势的原因[[32]这种屈曲行为表现出与叉形分叉一致的突然偏离线性响应的现象；值得注意的是，屈曲压力阈值与GV体积成反比，这意味着在几何约束下的细胞内GV在机械边界条件改变时与自由悬浮的GV相比表现出不同的行为[35]。这些周期为3的分叉动力学与微气泡中观察到的周期为2的参数共振不同，直接解释了在4f0/3和5f0/3处产生f0/3倍频超谐波的现象。此外，GvpC这种外部增强GV壳并提高其机械刚度的次级支架蛋白已被证明可以减少非线性谐波输出[36]，从而证实了壳的刚性是非线性频谱特征的主要决定因素。细菌膜限制对GV-E.coli施加的额外粘弹性载荷预计将进一步改变有效的阻尼和刚性，从而有利于周期为3的分叉路径相对于周期为2的分叉路径更加稳定。尽管超快摄影提供了GV动态的直接证据，但PCD更适合于实时、无创的体内 cavitation 活动监测。PCD 已与超声治疗系统集成，能够建立“cavitation 反馈”控制回路，以优化超声暴露参数，从而改善治疗效果[37]。然而，这种方法只能监测超声焦点处的 cavitation 活动，无法识别来自单个GV振荡、细菌簇内的气泡-气泡相互作用或GV释放的气体聚集成较大瞬态气泡的源头。高速摄影将能够直接实时观察GV-E.coli簇内和周围的气泡动态，这将为这里测量的周期三倍特征和 cavitation 阈值提供重要的机制解释。此外，被动声学映射（PAM）、被动 cavitation 映射（PCM）或被动 cavitation 成像（PCI）通过使用阵列换能器和空间滤波算法接收和分析 cavitation 事件的发射信号来生成 cavitation 图谱[38]。这种策略旨在提高GV-E.coli 介导的超声治疗的安全性、精度和转化潜力。数值模拟对于理解 cavitation 机制和优化超声参数至关重要。大多数现有模型依赖于 Rayleigh-Plesset (RP) 或修改后的 Keller-Miksis 方程来描述牛顿流体介质中单个球形气泡的非线性振荡[39]。它们只能描述单个MB的行为，无法考虑它们之间的散射和耦合效应。尽管取得了有希望的进展，但在阐明GV和GV-E.coli的 cavitation 活动方面仍存在重大挑战。纳米级GV嵌入细菌膜和细胞质中引入了复杂的气泡-细菌相互作用条件。此外，细菌内GV分布不均匀导致破裂阈值范围广泛。在实验观察中，仅使用高速成像定量分析了单个或少数气泡在超声暴露下的膨胀和坍塌。这样的直接证据对于验证理论模型和提高其精确预测能力至关重要。然而，基于 cavitation 的应用需要大量气泡。多气泡系统中的气泡行为与单个气泡的行为有很大不同，主要是因为它们不仅对入射超声有响应，还通过声散射或次级辐射力相互作用，导致复杂的动态。虽然气泡-气泡相互作用显著影响单个气泡的动态（即径向脉动），但对于聚集配置中的GV的研究却非常有限。本研究存在几个局限性。首先，GV-E.coli的 cavitation 特性是在血管模型流动系统中测量的。GV-E.coli在体内的声学行为要复杂得多，受到细菌聚集（生物膜形成）、周围粘弹性组织以及肿瘤微环境等因素的影响。这些血流动力学因素可能会影响GV-E.coli的分布、聚集状态和在血管或血管周围肿瘤区室中的有效 cavitation 活动。因此，cavitation 可能具有广泛的分布和复杂的振荡模式。其次，每次超声处理都使用了新鲜样本，并收集了100次脉冲的声学发射数据进行分析。与传统的UCAs相比，GV-E.coli在体内表现出更好的持久性和稳定性。因此，需要长期监测GV-E.coli的 cavitation 活动。最后，需要确定 cavitation 剂量与体内生物效应（如肿瘤细胞膜通透性增强、药物输送提升和消融效率）之间的定量相关性，以评估GV-E.coli作为治疗 cavitation 剂的临床转化潜力。5. 结论使用PCD在时间和频率域确定了GV-E.coli的独特 cavitation 特性。与表现出周期加倍行为的传统脂质壳MB不同，GV-E.coli显示出以周期三倍（f0/3和2f0/3）为特征的独特非线性响应。这种特定的频谱特征为在背景组织存在的情况下进行高特异性检测提供了一种潜在的监测策略。此外，GV-E.coli在SC（1.6 MPa）和IC（2.2 MPa）方面的阈值显著更高，这可能归因于其坚硬的蛋白质壳和细菌内的限制。关于浓度依赖性，GV-E.coli的 cavitation 剂量单调增加，而没有通常在SonoVue中观察到的显著声学阴影效应，表明其在声学性能方面的可持续性更优。总体而言，这些独特的声学特性——包括高机械稳定性、特定的频谱响应和可预测的剂量-浓度行为——突显了GV-E.coli作为超声成像和治疗的强大生物剂的潜力。

作者贡献声明：
Feng Gao：撰写——原始草稿、软件、方法论、调查、形式分析、概念化。
Haiyan Yang：撰写——原始草稿、软件、方法论、数据管理、概念化。
Xiaoqing Luo：可视化、验证。
Ting Gong：可视化、调查。
Jianzhong Zou：资源、方法论。
Dui Qin：资源、方法论。
Yufeng Zhou：撰写——审阅与编辑、监督、项目管理、资金获取。