超声辅助的疏水性深共晶溶剂萃取与纯化方法用于从Cornus officinalis中提取熊果酸和橄榄酸：工艺优化及机理研究

《Ultrasonics Sonochemistry》：Ultrasound-assisted hydrophobic deep eutectic solvent extraction and purification of ursolic acid and oleanolic acid from Cornus officinalis: Optimization and mechanistic insights

　　杨腾腾|谭超|王若良|史一轩|刘俊海|梁银库|任晨阳|王永飞|姚媛
秦巴生物资源与生态环境国家重点实验室（孵化器），陕西理工大学化学与环境科学学院，中国汉中723001

**摘要**
本研究旨在解决传统方法从 Cornus officinalis 果实中提取熊果酸（UA）和欧亚酸（OA）时存在的提取效率低和环境影响大的问题。提出了一种使用具有良好生物相容性的疏水性溶剂 DES（DL-薄荷醇：异丙醇）有效提取和纯化 UA 和 OA 的方法。在固液比为 1:21 g/mL、超声处理时间为 40 min、功率为 300 W、温度为 29°C 的条件下，通过单因素实验和响应面优化，UA 和 OA 的总提取产量达到 9.38 ± 0.17 mg/g，是使用 70% 乙醇提取量的 2.43 倍。随后使用 AB-8 大孔树脂进行纯化，发现其吸附行为遵循伪二级动力学和 Freundlich 模型。扫描电子显微镜（SEM）显示超声空化作用破坏了 Cornus officinalis 的细胞壁，促进了 DES 的渗透。量子化学计算表明 DES 通过氢键和范德华力与 UA/OA 相互作用，并具有有利的结合能，阐明了提取机制。本研究为疏水性三萜酸 UA 和 OA 的绿色提取和纯化提供了实验依据和技术指导。

**1. 引言**
Cornus officinalis，又称红枣皮或药用枣，广泛分布于中国，是陕西省秦巴山区的重要植物资源 [1]。其果实富含多种生物活性物质，包括环阿特诺醇类、三萜酸、黄酮类、多糖、有机酸酯等，具有显著的治疗价值 [2]、[3]。熊果酸（UA）和欧亚酸（OA）是五环三萜酸，是 C. officinalis 中丰富的异构化合物，通常以游离酸或三萜皂苷的非糖苷形式存在，在天然产物提取过程中常同时分离出来 [4]。UA 和 OA 具有多种药理作用，如抗炎、抗氧化、降血糖和心脏保护作用，并广泛应用于食品、制药和农业领域 [5]、[6]、[7]、[8]、[9]、[10]、[11]、[12]。然而，由于 UA 和 OA 在水中的溶解度低，从天然来源中提取它们需要大量挥发性有机溶剂，导致提取产量低，且该过程不符合绿色化学的原则。因此，迫切需要开发一种绿色、高效、环保的提取方法来分离 UA 和 OA。
传统的提取方法（如索氏提取和热回流提取）具有溶剂回收和操作简便等优点，但耗时较长且溶剂经济性差，仅适用于热稳定的化合物，限制了其在绿色和可持续发展中的应用 [13]、[14]、[15]。由于传统有机溶剂的高挥发性、毒性和环境不友好性，离子液体（ILs）和深度共晶溶剂（DESs）等绿色溶剂受到了关注。尽管离子液体被认为环保，但合成复杂且成本高，生物降解性差，毒性相对较高。相比之下，DESs 具有可调的物理化学性质、低毒性和低挥发性，在分离 [16]、[17]、生物催化 [18]、[19] 和电化学 [20]、[21] 方面得到了广泛研究和应用，最初由 Abbott 等人在 2003 年提出。它们通常通过加热和混合氢键受体（HBAs）与氢键供体（HBDs）制备而成，可灵活调节组成比例以实现目标化合物的高选择性提取。
通过优化提取溶剂并结合微波辅助提取（MAE）和超声辅助提取（UAE）等物理方法，可以进一步提高从天然来源中提取的效率。UAE 通过超声空化在液体中产生微小气泡，导致剧烈内爆，产生极端温度、压力和强烈冲击波，显著增强传质 [22]、[23]，同时破坏植物细胞壁和基质，增加目标化合物与溶剂之间的接触，从而提高提取速率 [24]。与传统方法相比，UAE 显著缩短了提取时间，减少了溶剂消耗，并提高了产量。

**2. 实验**
2.1. 化学品和材料
详细信息见支持材料文本 S1。
2.2. DES 的筛选和生物相容性
2.2.1. DES 的制备和筛选
制备了十一种不同的 DES（见补充材料文本 S2）。将 0.5 g（40 目）的干燥 C. officinalis 粉末放入 15 mL 离心管中，然后加入不同浓度的 DES（15 mL），将每个离心管放入超声清洗器中，在 50°C 下处理 30 min（超声功率：600 W）。之后使用 HPLC 检测 UA 和 OA 的总含量。
2.2.2. DES 的生物相容性
选择人脐静脉内皮细胞（HUVECs）作为生物相容性评估模型，使用 Cell Counting Kit-8（CCK-8）试剂盒评估 DES 系统的生物相容性。对六个浓度的 DES 进行离心处理。仅含培养基的组作为空白组，含培养基和细胞的组作为对照组，含培养基、细胞和不同浓度 DES 的组作为实验组。使用 Microplate Reader 测量 450 nm 处的吸光度（OD）。通过以下公式计算细胞存活率来确定生物相容性：
(1)
细胞活力 = (As - Ac) / (Ab - Ac) × 100%
其中 As、Ab 和 Ac 分别代表实验组、空白组和对照组的 OD 值。
2.3. UPLC 方法
使用高效液相色谱（HPLC）和 Agilent ZORBAX XDB C18 柱（4.5 × 250 mm, 5 μm）测定目标化合物的含量。采用等度洗脱程序，流动相为乙腈和氨水的 75:25 (v/v) 混合物；通过磷酸调节氨水的 pH 至 7.8。目标化合物 OA 和 UA 的保留时间分别为约 12 分钟和 13 分钟，检测波长为 210 nm，流速为 1.2 mL/min，柱温为 30°C，进样量为 20 μL。制备不同浓度的 UA 和 OA 标准溶液以绘制校准曲线，Y 轴表示峰面积，X 轴表示浓度。每个样品重复分析三次以减少误差。
2.4. 单因素实验
利用 UA 和 OA 的总提取产量（Y），通过单因素分析优化以下四个因素：
XA（1:15、1:20、1:25、1:30 和 1:35 mg/mL），XB（20、30、40、50 和 60 min），XC（240、300、360、420、480 W），XD（20、30、40、50、60°C）。各因素的表格见补充材料中的表 S1。
2.5. 响应面优化（RSM）
为了进一步优化，以总提取产量（Y）为响应变量，使用 Box-Behnken 设计（BBD）在 Design Expert 软件中进行了四因素、三水平的实验，共 29 个子部分。
2.6. SEM
使用扫描电子显微镜（Hitachi Regulus 8100，日本）观察提取前后 C. officinalis 粉末的表面形态。未经处理的样品和 UAE-DES 提取的样品在 60°C 下真空烘烤 12 h 至重量恒定。将适量的干燥粉末均匀分布在导电粘合剂涂层的样品架上，用橡胶吸球仔细去除边缘的松散粉末。为了提高导电性，使用离子溅射镀膜机（E-1010，Hitachi，日本）在 5.00 kV 的加速电压下进行溅射镀金 60 s。
2.7. DES 形成的验证
使用 FTIR 和 1H NMR 光谱确认 DES 的成功合成。1H NMR 光谱在氘代二甲基亚砜（DMSO-d6）中记录，以四甲基硅烷（TMS）作为化学位移标准。
2.8. 分子动力学模拟
使用 Materials Studio 2020（MS2020）中的 Forcite 模块进行分子动力学（MD）模拟，使用 Amorphous Cell（AC）模块构建非晶模型。系统由欧亚酸和熊果酸按 2:3 的质量（或摩尔）比例组成，评估了五种组成情况。溶剂为甲醇、乙醇和甲醇/乙醇二元混合物（1:1；体积或摩尔比如模型中定义）。每个模拟箱中的分子总数设置为 1500 个。在 MD 之前，先进行几何优化以达到能量最小化。然后在 NPT 集合下模拟 400 ps，之后在 NVT 集合下平衡 100 ps 以收集数据。温度控制使用 Nosé 温度计实现，所有其他参数保持 MS2020 的默认设置。
使用 Materials Studio（MS 2020）中的 Dmol3 模块计算复合系统的结合能。首先构建复合体的结构模型，然后使用 Dmol3 进行结构优化。选择的交换-相关功能为 GGA-PBE，基组为 DNP，应用了 DFT-D 分散校正。自洽场的收敛标准，以及几何优化的能量、力和位移收敛标准，都设置为它们的默认值。最后，计算了能量，并使用以下公式确定了结合能：(2)Ebind=Ecomplex-EA-EB。Ecomplex是优化后A–B复合物的总能量；EA和EB分别是有机分子A和B的能量。

2.9. 净化过程
2.9.1. 选择最佳树脂
按照Liu等人的描述[30]对六种树脂进行了预处理。将六种预处理的树脂D101、AB-8、DM130、S-8、X-5和NKA-9（2.0克，M）放入锥形烧瓶中，然后加入40毫升提取液（V1），在25°C和115 rpm下搅拌12小时以进行吸附。吸附后，测定了UA和OA的浓度，并用蒸馏水洗涤大孔树脂，然后用甲醇解吸。经过12小时的振荡后，使用方程（3）、（4）、（5）、（6）测定了解吸液（V2）中UA和OA的浓度：
(3)吸附容量=(C0-C1)×V1/M
(4)吸附速率=(C0-C1)/C0×100%
(5)解吸速率=C2×V2/(C0-C1)×V1×100%
(6)回收率(%)=C2×V2/C0×V1×100%
其中C0、C1和C2分别代表提取液、吸附平衡时的上清液和解吸液的浓度。

2.9.2. UA和OA在AB-8大孔树脂上的吸附动力学分析
将2克AB-8树脂加入含有40毫升处理后提取液的锥形烧瓶中，然后在25°C和120 rpm的水浴振荡器中连续搅拌12小时。每30分钟取出1毫升上清液以测定UA和OA的质量浓度。使用以下动力学模型方程分析了准一级、拟二级和颗粒内扩散模型以阐明吸附机制：
(7)ln(qe-qt)=lnqe-k1t
(8)qt=(1/k2)qe^2+tqe
(9)qt=kit^0.5+C
其中k1和k2分别代表拟一级和拟二级模型的吸附速率常数；ki表示扩散速率常数；qe和qt分别代表吸附平衡时和t时间点的吸附容量（mg/g）。

2.9.3. UA和OA在AB-8大孔树脂上的吸附等温线
准备了五种不同浓度梯度的提取液。将2克AB-8大孔树脂准确称重到三个锥形烧瓶中，然后向每个烧瓶中加入不同浓度的提取液。将这三组溶液分别放入保持在15°C、25°C和35°C的水浴振荡器中，以120 rpm的速度搅拌12小时以实现吸附。达到吸附平衡后，测定了上清液中的总UA和OA浓度。使用Freundlich和Langmuir方程进一步研究了树脂的吸附性能。
Langmuir模型：
(10)Ceqe=1/KLqm+Ceqm
Freundlich模型：
(11)lnqe=1/nlnCe+lnKF
其中qm表示树脂的最大吸附容量（mg/g）；Ce表示平衡浓度（mg/mL）；KL（L/mg）是Langmuir方程常数；KF[(mg/g)^(mL/mg)^1/n]是Freundlich方程常数；1/n表示吸附指数。

2.9.4. 静态吸附条件的优化
为了确定适当的静态纯化条件，分别对吸附和解吸过程进行了单因素实验。吸附实验在不同的pH值（2.5–6.5）下进行，而解吸实验使用了不同的解吸溶剂（甲醇、乙醇和二氯甲烷），洗脱体积为3 BV。吸附和解吸都在25°C下进行。

2.9.5. 动态吸附和解吸
将预处理的AB-8大孔树脂采用湿法装载到色谱柱上。当提取液的pH值调整到5.5时，将样品装载到柱子上，然后研究了流速对树脂吸附和解吸的影响。使用甲醇溶液作为洗脱剂，其解吸速率最高，洗脱体积为3 BV。装载和洗脱分别在1、2、3、4和5 mL/min的流速下进行。收集洗脱液和洗脱剂后测定了其浓度。

2.10. 统计分析和数据处理
所有实验都进行了三次独立重复（n = 3）。p < 0.05被认为是统计学上显著的。数据分析使用Design Expert 13和SAS 8.0.1软件进行，图表使用Origin软件绘制。

3. 结果与分析
3.1. 溶剂的筛选和生物相容性的评估
3.1.1. 最佳溶剂的选择
在筛选实验之前，进行了初步实验以证明改变提取条件不会影响各种DES的相对有效性。因此，为了确保实验的简单性、结果的可靠性和数据的可比性，筛选使用了固定条件。使用提取后的总产率作为评估标准，比较了亲水性DES、疏水性DES和传统溶剂70%乙醇从C. officinalis中提取UA和OA的效率。基于亲水性DES，氯化胆碱：醋酸（1:1）显示出最高的提取产率1.26 ± 0.16 mg/g（图1a），这明显低于使用70%乙醇作为溶剂时获得的值（2.59 ± 0.25 mg/g）。这种差异可能是由于亲水性DES的强极性及其高粘度限制了目标化合物在提取过程中的溶解度和传质效率。在疏水性DES中，DL-menthol：异丙醇（IPA）（1:1）系统对OA和UA的提取效率显著提高，大约是70%乙醇的2.43倍。根据“相似相溶”的概念，这种较高的提取率归因于DL-menthol和IPA之间的协同作用，通过氢键形成了强疏水性网络[31]，从而提高了像UA和OA这样的水不溶性低极性化合物的溶解度。

3.2. DES的生物相容性
在HUVECs中检测了不同DES浓度的潜在细胞毒性，使用CCK-8测定法测量细胞增殖（图1b）。在建立的浓度梯度下，所有组在24小时处理后的细胞存活率没有显著差异，超过97%，与阴性对照组相比（p < 0.05）。这些发现表明，在测试条件下，DL-menthol：IPA（1:1）DES对HUVEC细胞没有表现出细胞毒性，支持其后续体外生物活性测定的生物相容性。

3.2. 单因素测试结果的分析
提取产率随着固液比的增加而逐渐增加（图2a），在1:20 g/mL时达到峰值。随着固液比的进一步增加，提取产率逐渐降低，这严重影响了传质效率。提取系统在低比例时迅速达到饱和，导致传质梯度和固体与液体之间的浓度梯度减小。目标组分的溶解伴随着其他杂质的溶解[32]。因此，选择1:20 g/mL的固液比作为进一步优化和分析的响应面因素。

3.3. 响应面结果分析
使用响应面方法进行了二十九次实验，以研究四个关键变量对提取产率的单独和交互效应。模型适用性分析和线性、二次项及交互项的显著性评估结果显示在表1中。表S4中展示了每个水平下预测值和实际值的比较。使用Design-Expert软件为实验数据建立了二次回归模型。根据方差分析（ANOVA）结果，模型在p < 0.0001时具有统计学显著性（表1），而“不适应”的P值不显著（p > 0.05），表明模型的统计显著性非常高。回归系数R2 = 0.9761，表明模型对响应值的拟合度为97.61%。R2Adj值为0.9523，表明模型对四个独立变量的拟合非常好[38]。变异系数为1.15%，表明实验设计的稳健性以及实验误差最小。因此，模型能够准确预测UA和OA的提取产率，最终回归方程为：

表1. 方差分析（ANOVA）对于二次响应面模型。
来源
平方和
自由度
均方
F值
P值
显著
Model 5.5300
140.39
48
0.90
< 0.0001
显著
XA 0.22
33
10.22
33
23.13
0.0003
a
XB 0.11
10
10.11
10
11.50
0.0044
a
XC 0.20
51
10.20
51
21.25
0.0004
a
XD 0.20
75
10.20
75
21.49
0.0004
a
XA × XB 0.02
02
10.02
22.09
0.1704
XA × XC 0.14
10
10.14
10
14.61
0.0019
a
XA × XD 0.02
04
10.02
04
2.12
0.1676
XB × XC 0.09
18
10.09
18
9.51
0.0081
a
XB × XD 0.03
06
10.03
06
3.17
0.0966
XC × XD 0.01
12
10.01
12
1.16
0.2989
XA 21.57
00
11.57
00
16
2.14
< 0.0001
a
XB 22.76
00
12.76
00
28
5.95
< 0.0001
a
XC 21.76
00
11.76
00
18
2.55
< 0.0001
a
XD 20.35
02
10.35
02
36.28
< 0.0001
a
残差 0.13
52
140.0097
不适应 0.12
13
100.0121
3.50
0.1191
不显著
纯误差 0.01
38
40.0035
Cor Total 5.6628
R2 = 0.9761
R2Adj = 0.9523
R2Pred = 0.8728
C.V. %=1.15
注意：a = 非常显著的差异，对应于p < 0.01。
Y = 9.31 + 0.1364
*XA + 0.0962
*XB ? 0.1308
*XC ? 0.1315
*XD ? 0.0710
*XA*XB ? 0.1877
*XA*XC + 0.0715
*XA*XD + 0.1515
*XB*XC ? 0.0875
*XB*XD ? 0.0530
*XC*XD ? 0.4912
*XA2 ? 0.6524
*XB2 ? 0.5212
*XC2 ? 0.2324
*XD2
3D响应面图（图3）和等高线图（图S3）的分析清楚地表明了各种因素之间的相互作用。响应面图中等高线的形状表示两个因素之间相互作用的强度。椭圆形等高线表示显著的相互作用，而近似圆形等高线表示弱或可忽略的相互作用。此外，XA和XC之间以及XB和XC之间的相互作用对实验结果有显著影响（p < 0.05），表明固液比、超声时间和超声功率之间的关系。当其中一个因素发生变化时，其他参数会相应调整以确保高提取率。

图3. (a) 至 (f) 是响应面图，展示了固液比和超声时间、固液比和超声功率、固液比和超声温度、超声时间和超声功率、超声时间和超声温度对总提取产率的影响。
模型预测的最佳提取过程为：XA = 1:20.71 g/mL，XB = 40.34 min，XC = 299.22 W，XD = 28.54°C，最佳提取率为9.36 mg/g。在实际应用中，参数修改为以下值：XA = 1:21 g/mL，XB = 40 min，XC = 300 W，XD = 29°C。在上述条件下，进行了五次连续提取重复实验进行验证。平均提取产率为9.38 ± 0.17 mg/g。最佳组合（29°C，300 W，40 min，1:21 g/mL）基本上代表了提取动力学和热力学之间的平衡点。具体来说，29°C平衡了溶剂渗透性和超声空化强度；300 W提供了适当的超声空化效应，能够产生有效的冲击波来破坏植物材料中的细胞壁；40 min是溶质从细胞扩散到溶剂中并达到传质平衡所需的动力学时间。实验结果与模型预测非常吻合，偏差仅为0.21%，因此可以将其应用于实际过程中UA和OA的提取指导。杨等人使用超声辅助的超临界CO2提取法从冬青中提取了OA和UA，产量分别为2.3毫克/克和2.6毫克/克[39]。李等人使用疏水性DES从苹果皮中提取了UA，产量为1.544%[40]。J?ger等人使用加速溶剂提取法从C. officinalis叶子中提取了UA，产量为1.5毫克/克[41]。与上述研究相比，本研究的提取产量显著提高，这突显了该技术在提取过程中的优势。

3.4 提取方法比较
为了评估本研究采用的提取方法是否能显著提高C. officinalis中UA和OA的提取产量，将其与DES提取、乙醇提取、UAE-EtOH和MAE-DES进行了比较。与DES提取和乙醇提取方法相比，超声辅助显著提高了提取产量，分别提高了2.75倍和2.31倍（图4）。MAE-DES过程的提取产量为6.45±0.22毫克/克，而UAE-DES过程的产量比MAE-DES过程高出45.4%。尽管微波辅助提取通过加速质量传递提高了提取效率，但超声辅助提取在破坏细胞壁方面更为有效，从而促进了目标化合物的洗脱。此外，UAE-DES是一种简单且有效的提取方法，因为超声设备成本较低且更安全。

3.5 扫描电子显微镜（SEM）分析
为了研究超声辅助对提取过程的影响，使用SEM观察了C. officinalis粉末在DES提取前后的表面微观结构（图5）。未经处理的样品表面光滑且结构完整。经过UAE-DES处理后，表面变得粗糙，出现了许多裂纹、孔洞和塌陷的细胞壁。随着放大倍数的增加，损伤程度更加明显，这可以归因于超声诱导的空化作用，在提取溶液中形成了大量微小气泡，这些气泡破裂会产生瞬态高压和冲击波。这一过程破坏了细胞壁，使DES能够进入细胞内部并释放生物活性物质。此外，气泡破裂产生的机械效应以及气泡振荡引起的植物材料周围的局部湍流可以扩大异质反应界面，增强溶剂与原材料之间的接触。超声波产生的能量部分转化为热能，提高了整个系统的温度并降低了DES的粘度，从而增强了溶剂内的质量传递。这与定量提取产量结果一致，超声处理后的产量为9.38毫克/克，而未经处理时仅为3.41毫克/克。超声处理使提取产量提高了2.75倍，证实了超声辅助提取对提取效率的显著提升作用。SEM图像证实了DES和超声剪切力之间的协同作用，有效破坏了C. officinalis的细胞壁，并提供了该方法提高提取效率的微观结构证据。

3.6 DES形成的验证
DL-menthol、IPA及其形成的DES的红外光谱显示在图6a中。DES的形成通过特征官能团区域的显著位移得到了证实。DL-menthol中的–OH基团的伸缩振动峰位于3327.1 cm?1，而IPA中的相应峰位于3329.1 cm?1。在DES光谱中，吸收峰变宽并向蓝端移动，最终在3346.4 cm?1处形成一个宽峰，证实了DES系统中形成了新的氢键[42][43]。DL-menthol的环己烷骨架振动峰和C-O伸缩振动峰在IPA中发生了位移，表明DES中存在氢键，这是由于IPA的–OH基团与DL-menthol的–O-基团之间形成了分子间氢键（O-H•••O）。

3.7 分子动力学
3.7.1 动态空间分布分析
从微观角度来看，通过研究不同溶剂系统中UA和OA的溶解行为，比较了乙醇、甲醇和DES在模拟初始状态（100 ps）和平衡状态（400 ps）下的分子空间分布（图7）。在初始模拟阶段，三个系统中均未观察到明显的溶质分子聚集现象。达到平衡后，溶质之间出现了显著差异：乙醇中的聚集现象明显，甲醇中的聚集现象相对较轻，而DES系统中几乎均匀分散且无聚集现象，这可以归因于UA和OA与DES之间的氢键相互作用。均匀的空间分布同时增加了溶质与溶剂之间的有效接触面积，为溶质溶解创造了有利条件。甲醇和乙醇中的聚集差异可能是由于它们无法完全溶解UA和OA的疏水性五环三萜骨架，导致溶质分子自组装，阻碍了有效提取。DES表现出优异的扩散性能，为目标溶质提供了化学兼容的溶解环境，有效抑制了溶质聚集，并显著增加了溶质-溶剂接触面积。这种多维度协同作用是有效提取的结构基础。

3.7.2 径向分布函数（RDF）
RDF（g(r)）描述了在无限薄的球形壳层内，从参考原子距离“r”处找到相邻原子的概率[47]。通常在1.5–3.5 ?范围内观察到的特征峰表示氢键相互作用，而在3.5–5.0 ?范围内的峰表示范德华力[48][49]。如图8a所示，IPA中的羟基在DES中与UA和OA的羟基及羧基分别在2.1 ?和2.2 ?处形成峰。在3.5–5.0 ?范围内，UA和OA都显示出宽的次级峰，证实了范德华力的贡献。与氢键的尖锐峰相比，范德华力表现为较宽且强度较低的峰，表明其次要性质。DES主要通过与UA和OA的氢键相互作用，并通过范德华力得到增强。这些多种力的协同作用构成了DES实现高效提取的微观机制。

3.7.3 均方位移（MSD）
MSD通过统计分析粒子随时间的位移来定量评估分子扩散。较高的MSD值表示分子流动性更强，从而有助于溶质从基质向溶剂中的转移，可能提高提取效率。为了评估UA和OA对提取效率的影响以及DES的扩散能力，计算了这两种化合物在甲醇、乙醇和DES系统中的MSD值。如图8b所示，UA和OA在三种溶剂系统中的MSD值存在显著差异，甲醇系统中的MSD值分别为38.3 ?2和22.1 ?2，DES系统中的MSD值分别为9.38 ?2和4.12 ?2。乙醇系统的MSD值最低，分别为8.23 ?2和4.11 ?2。DES中的最高MSD值可能与UA和OA与DES组分的分子间相互作用有关。根据RDF分析结果，DES与目标化合物形成了以氢键为主的强相互作用。这些相互作用涉及与目标化合物的结合并减少了扩散，导致MSD值低于甲醇。这些结果与研究表明一致：虽然强相互作用会增加溶解度，但通常会降低扩散速率[50][51]。

3.7.4 平均氢键数量
氢键的形成是评估系统内分子相互作用的关键指标。在100–400 ps的时间范围内，甲醇、乙醇和DES分别与UA和OA形成了氢键。如图9所示，DES与UA和OA之间的平均氢键数量始终高于甲醇与乙醇之间的氢键数量，表明DES具有更强的效果，更有利于提取。

3.7.5 结合能分析
结合能结果进一步阐明了溶质与溶剂之间的分子相互作用（图10）。与甲醇和乙醇相比，DES系统与UA和OA的结合能较低。系统的稳定性随着自由能负值的增加而提高，表明DES与目标分子的结合更加牢固，降低了整个系统的自由能。这进一步证实了DES与UA和OA形成了更稳定的结合，从而提高了系统的稳定性。

3.8 UA和OA的纯化
3.8.1 最优大孔树脂的选择
大孔树脂的极性、孔径和比表面积是决定其吸附和解吸性能的关键因素。在选择用于纯化的大孔树脂时，需要考虑目标化合物的极性和分子量[52][53][54]。根据“相似相溶”的原则，树脂的极性越接近目标物质，其吸附能力越强[55]。因此，采用吸附率作为评估标准，选择了六种不同极性的树脂进行筛选[38][56]。如图11所示，弱极性树脂对UA和OA的最高吸附率为90.1%，这表明随着树脂极性的增加，其吸附能力有所下降。因此，选择了AB-8树脂进行进一步分析。下载：下载高分辨率图像（117KB）下载：下载全尺寸图像图11. 大孔树脂类型对UA和OA总吸附率的影响。3.8.2. AB-8树脂吸附动力学为了阐明吸附剂的吸附效率，研究了吸附过程。研究时间如何影响吸附过程至关重要[57]。实验数据通过拟一级、拟二级和颗粒内扩散模型进行了拟合，拟合结果分别显示在图12b、12c和12d中。根据吸附动力学曲线（图12a），AB-8大孔树脂在0到100分钟内的吸附速率最快，这归因于树脂表面存在大量的吸附位点。随着吸附时间的增加，吸附速率逐渐减慢，并在300分钟时达到平衡[58]。根据拟一级动力学模型，吸附速率主要受溶质初始浓度控制，而拟二级动力学模型还考虑了吸附剂表面活性位点的影响。由于AB-8树脂是一种聚苯乙烯类型的弱极性树脂，其表面含有疏水性苯环和少量的极性酯基团，UA和OA可能通过疏水相互作用与树脂结合。因此，拟二级模型在理论上更为合适。根据表2中的拟合参数，拟二级动力学模型显示出最高的R2值（0.99144），表明UA和OA在AB-8大孔树脂上的吸附可能是由于化学相互作用或多步控制机制[59]。下载：下载高分辨率图像（208KB）下载：下载全尺寸图像图12. 使用AB-8树脂纯化UA和OA的吸附动力学曲线（a），以及基于拟一级（b）、拟二级（c）和颗粒内扩散（d）模型的线性拟合。表2. UA和OA在AB-8树脂上的吸附动力学：模型拟合和参数分析。模型方程动态参数拟一级ln(qe-qt) = 1.8278 – 0.0138t K1 = -0.0138qe = 6.22019 R2 = 0.96207拟二级qt = 27.69832 + 0.20663t K2 = 0.00154qe = 4.83957 R2 = 0.99144颗粒内扩散qt = 0.23356t1/2 - 0.35746 K3 = 0.23356 C = -0.35746 R2 = 0.98775 qt = 0.03643t1/2 + 2.80361 K4 = 0.03643 C = 2.80361 R2 = 0.939763.8.3. AB-8树脂的吸附等温线为了阐明AB-8树脂与UA和OA的吸附机制和相互作用，使用Langmuir和Freundlich模型对吸附数据进行了拟合，结果如图13所示。Langmuir模型基于单层吸附，其中吸附分子在均匀的吸附位点上吸附而不相互作用。当所有活性位点都被占据时，吸附达到饱和。Freundlich模型适用于非均匀表面，认为吸附剂表面包含能量分布不均的活性位点，从而导致多层吸附。如表3所示，Freundlich模型在15、25和35°C下的R2值分别为0.988、0.991和0.993，明显高于Langmuir模型，表明吸附过程更好地可以用Freundlich模型描述，并证实了存在非均匀多层吸附。Freundlich常数1/n的范围为0.255–0.358（0 < 1/n < 1），进一步证明了该吸附过程相对简单。KF值在25°C时最高，表明具有显著的吸附能力。在15°C和35°C时KF值较低，这可能是由于在较低温度下分子扩散较慢，而在较高温度下质量传递加快，但也增加了已吸附分子的解吸倾向。下载：下载高分辨率图像（143KB）下载：下载全尺寸图像图13. 使用AB-8树脂在15、25和35°C下纯化UA和OA的Langmuir（a）和Freundlich（b）模型拟合。表3. UA和OA在AB-8大孔树脂上的吸附等温线：模型拟合和参数分析。空单元LangmuirFreundlichT/℃方程KLqm R2方程KF1/n R215Ceqe = 0.004 + 0.343Ce9 1.9262.9180.877lnqe = 0.303lnCe + 1.7485.7440.3030.98825Ceqe = 0.003 + 0.277Ce107.6293.6080.904lnqe = 0.358lnCe + 2.2329.3140.3580.99135Ceqe = 0.002 + 0.336Ce135.5482.9800.953lnqe = 0.255lnCe + 1.6965.4530.2550.9933.8.4. 静态吸附条件的优化为了进一步提高大孔吸附树脂对目标化合物的纯化效率，基于初步实验分析了两个关键因素：样品溶液的pH值和脱附溶剂的类型。溶液的pH值通过改变分子的电离状态显著影响了目标分子与树脂之间的相互作用力。如图14a所示，随着pH值从2.5升至5.5，AB-8树脂对UA和OA的吸附能力持续增加，在pH 5.5时达到最大值。随后，随着pH值的增加，吸附能力下降，可能是因为UA和OA提取物的pH值约为5.5，在pH值升高时会发生脱质子化形成离子，从而降低吸附能力。因此，确定最佳吸附pH值为5.5。然后研究了脱附溶剂对洗脱效率的影响。如图14b所示，甲醇的脱附效率明显高于乙醇和二氯甲烷。因此，在后续步骤中使用了甲醇作为脱附溶剂。下载：下载高分辨率图像（126KB）下载：下载全尺寸图像图14. 样品溶液pH值（a）和洗脱溶剂（b）对吸附能力的影响。3.8.5. 动态吸附条件的优化为了进一步优化动态吸附过程，研究了流速对AB-8树脂吸附UA和OA的影响。随着流速的增加，吸附能力先增加后下降，在2 mL/min时达到峰值（图15a），表明2 mL/min的流速提高了流动相中的质量传递效率，并改善了目标分析物向树脂表面的扩散。过高的流速显著减少了样品在柱中的停留时间，导致UA和OA在未与树脂活性位点充分接触之前就洗脱出来，从而降低了吸附能力。因此，在后续实验中使用了这一条件。下载：下载高分辨率图像（142KB）下载：下载全尺寸图像图15. 采样流速（a）和洗脱流速（b）对AB-8树脂脱附产率的影响。为了研究甲醇流速在脱附阶段对洗脱效率的影响，在1–5 mL/min的范围内评估了动态脱附性能。脱附速率随流速的增加而显著下降，在1 mL/min时达到峰值（图15b）。在较低流速下，甲醇与树脂的接触时间延长有助于目标化合物从吸附位点完全脱附并扩散到洗脱液中。过高的流速虽然缩短了脱附时间，但可能会削弱内部扩散过程，导致脱附不足。综合考虑脱附效率和操作时间，选择2 mL/min作为甲醇脱附阶段的最佳流速。3.8.6. 最佳纯化条件的验证使用AB-8树脂、甲醇作为洗脱溶剂、pH值为5.5、样品加载流速为2 mL/min和洗脱流速为2 mL/min进行了优化纯化协议的实验，并通过三组平行实验进行了验证。UA和OA的平均回收率为79.2 ± 2.86%，证明了该纯化方法的优异效率和重复性。3.9. DES的重复使用为了研究DES的重复使用性，在最佳条件下提取UA和OA后，将混合物真空干燥以回收DES相。为了确认其重复使用性，再次提取了回收的DES。如图16所示，使用回收的DES至少提取五次C. officinalis粉末后，UA和OA的提取产量超过了最大提取产量的80%，表明DES在连续提取和回收过程中性能稳定，至少可重复使用五次。作为一种高效且可持续的溶剂，它具有广泛的应用前景。下载：下载高分辨率图像（99KB）下载：下载全尺寸图像图16. 使用回收的DES连续提取五次后获得的产量。4. 结论本研究建立了一种环保且有效的UAE-DES提取方法，用于从C. officinalis粉末中提取UA和OA。DL-menthol: IPA（1:1）被确定为最佳提取溶剂。DES系统使用HUVEC细胞表现出优异的生物相容性，可以直接应用而无需分离。通过单因素实验结合响应面方法优化后的总提取产量为9.38 ± 0.17 mg/g，显著优于传统溶剂。SEM分析显示UAE-DES显著破坏了C. officinalis粉末的细胞壁结构，增加了目标成分的释放。FTIR和1H NMR分析证实DES中形成了氢键网络。MD模拟显示UA和OA与DES形成了多种类型的相互作用，主要是氢键，辅以范德华力，为观察到的有效提取提供了微观机制解释。在纯化阶段，AB-8大孔树脂表现出出色的吸附性能，吸附率达到90.1%，与Freundlich等温线和拟二级动力学模型一致，表明这是一个非均匀多层吸附过程。与MAE-DES过程相比，实现了相对较高的提取率45.4%，并且经过六次重复提取后产量没有显著下降。此外，由于DL-menthol和IPA的成本效益高、毒性低且可生物降解，它们适用于工业提取。本研究为超声波辅助提取植物来源中的UA和OA提供了参考框架。CRediT作者贡献声明杨腾腾：写作 - 审稿与编辑、撰写 - 原稿、可视化、软件、资源、方法学、研究、形式分析、数据管理、概念化。谭超：方法学、研究、形式分析、数据管理。王若良：验证、研究、数据管理。史一轩：验证、研究、数据管理。刘俊海：写作 - 审稿与编辑、验证、项目管理、资金获取、形式分析、概念化。梁银库：写作 - 审稿与编辑、验证、项目管理、资金获取、形式分析、概念化。任晨阳：监督、研究。王永飞：监督、研究。姚远：监督、研究。