将聚焦超声与铜-半胱氨酸生物复合材料结合用于糖尿病伤口愈合的可行性研究

《Ultrasound in Medicine & Biology》：The feasibility of combining focused ultrasound and copper-cystine biohybrid for diabetic wound healing

　　阿尼克·卡兰（Anik Karan）|阿比鲁普·萨马达尔（Abhirup Samaddar）|普拉卡什·阿迪卡里（Prakash Adhikari）|马德胡米特拉·苏布拉马尼安·卡蒂克什（Madhumitra Subramanian Karthikesh）|马克·A·德科斯特（Mark A. DeCoster）|杨新梅（Xinmai Yang）
美国堪萨斯大学劳伦斯分校机械工程系

**摘要**
慢性伤口愈合，尤其是糖尿病伤口的愈合，由于缺乏有效的治疗手段而仍然具有挑战性。药物治疗往往受到物理副作用的限制，而外科手术则存在感染风险。本研究旨在通过结合聚焦超声（FUS）和局部铜-半胱氨酸生物杂交材料（CuHARS），提供一种全面的治疗方案，以加速糖尿病伤口的愈合。

**方法**
在本研究中，我们探讨了在1 MPa压力、2500次循环、10%占空比、20 Hz脉冲重复频率下，每隔一天进行15分钟治疗（共14天），与局部铜-半胱氨酸生物杂交材料（CuHARS）联合使用的可行性。CuHARS是一种金属-有机生物杂交材料，能够促进血管生成并对伤口愈合具有杀菌作用。我们使用三组治疗方式对患有手术诱导皮肤伤口的糖尿病小鼠进行了疗效评估：CuHARS-FUS组合组、仅CuHARS组以及仅FUS组，分别观察7天和14天的效果。

**结果**
结果显示，CuHARS-FUS组合治疗14天后实现了伤口完全闭合，而仅CuHARS组、仅FUS组和对照组则仅表现出部分愈合或未愈合。

**结论**
CuHARS-FUS的协同治疗支持了快速的大血管结构形成和适当的细胞分化，从而在糖尿病伤口愈合的整个过程中提供了可控的组织重塑机制。这得益于CuHARS通过Cu2?离子催化S-亚硝基硫醇分解为一氧化氮（NO）的血管生成增强作用及其杀菌效果，以及FUS治疗促进的一氧化氮生成作用。

**引言**
慢性伤口通常由于糖尿病、血液循环不良或免疫系统较弱等潜在原因，无法通过正常过程及时愈合，成为医疗保健领域的一大负担。仅在美国，每年就有650万人受到慢性伤口的影响[1]。尽管已经有多种策略帮助慢性伤口患者，但在大多数情况下，恢复效果不明显且愈合过程缓慢[2,3]。血管化不良是严重影响愈合进程的主要因素之一。血管化在伤口愈合的增殖和重塑阶段起着关键作用[4,5]；如果该区域缺乏适当的血管化，组织结构将受到破坏[6,7]。因此，能够促进血管生成并加速血管结构形成的治疗方法可能有助于加快伤口愈合速度。此外，加速的愈合过程还能降低细菌菌落引起的感染风险，这也是慢性伤口愈合的另一个主要障碍[8]。

聚焦超声（FUS）技术是一种将声能非侵入性地传递到目标组织以产生所需治疗效果的方法[9]。过去几十年中，FUS已在多种医疗应用中显示出有效性，包括肿瘤治疗、组织修复和药物递送[10, [11], [12], [13]]。尽管FUS已被用于慢性伤口治疗并在深层组织愈合中显示出效果[14,15]，但尚未有完全康复的报道。此外，脉冲FUS疗法很少被用于治疗糖尿病伤口，也未证明其作为独立疗法的有效性。在一项小型动物研究中，超声疗法被用于糖尿病伤口愈合模型中，以促进外泌体的靶向递送，从而改善了愈合效果[16]。然而，基于外泌体的治疗方法可能因患者个体差异而有所不同[17, [18]]。另一项早期研究表明，超声刺激可通过激活Rac1来逆转糖尿病患者的皮肤伤口愈合延迟[19]。此外，超声疗法在动物模型（如兔子）中显示出提高一氧化氮（NO）水平的潜力，从而促进伤口愈合过程中的血管化[15]，尽管其在组织再生方面的潜力仍需进一步探索。观察到，与超声相关的空化现象可能对内皮细胞的结构重组产生不利影响，因此低于空化阈值的超声治疗对于伤口部位的早期血管化至关重要[20,21]。超声引起的空化会增加内皮细胞的通透性，但同时也会导致新形成的血管结构出现水肿和炎症反应，从而造成微血管损伤[22]。低强度治疗性超声已被证明能显著改善内皮功能，提高一氧化氮的产生水平[15, [23], [24], [25], [26]]。另一方面，高强度聚焦超声可作为清创工具，通过空化诱导细菌细胞破裂发挥杀菌作用[27,28]，还有研究表明高强度聚焦超声能够调节体外人类真皮成纤维细胞的增殖[29]。尽管有这些有希望的发现，但超声疗法在开放性伤口和深层组织损伤中的应用仍需进一步研究。

我们最近开发了一种新型铜-半胱氨酸生物杂交材料——基于铜和半胱氨酸的高纵横比结构（CuHARS）[30,31]。CuHARS是一种独特的铜与氨基酸L-半胱氨酸的结合物。最新研究表明，CuHARS显著增强了内皮细胞迁移和血管腔形成，这主要归因于它从血液中的S-亚硝基硫醇中生成的一氧化氮[31]。CuHARS在水介质中的降解速度非常慢，但在细胞环境中降解速度较快[30]。在生理条件下，CuHARS在组织培养中的缓慢降解提示这种材料可以整合到可降解或不可降解的基质中，以实现Cu2?离子的受控体内释放。降解后的Cu2?离子可以催化S-亚硝基硫醇（RSNOs）生成一氧化氮，从而产生出色的血管再生和抗菌效果[31,32]。RSNOs是一氧化氮的前体，存在于人血液中，包括血红蛋白和白蛋白两种类型。一氧化氮的生成通过NOS酶（NOS3和内皮型一氧化氮合酶eNOS）的酶促作用实现[33, [34], [35]]，这些酶由血管内皮细胞产生。eNOS的酶促作用释放一氧化氮，激活sGC-cGMP-PKG信号通路，从而促进血管生成。一氧化氮具有很高的反应性，半衰期极短（仅几毫秒）。一氧化氮在血管生成中起重要作用，通过增强内皮细胞增殖和减少凋亡来促进血管内皮生长因子的表达[35], [36], [37]]，同时还能上调内皮细胞中的eNOS水平。一氧化氮还能通过引导血管内皮生长因子向目标位置的迁移来调节内皮细胞的迁移[38]。组织再生的关键步骤之一是该区域的完全血管化，而内皮细胞的调节是这一过程的首要步骤，最终导致新生血管和微血管的形成。CuHARS还具有一定的初始抗菌效果[31]。然而，由于其可降解性，CuHARS的增强愈合效果和抗菌效果仅限于最初的几天或几周。

在本研究中，我们首次证明了将FUS疗法与CuHARS结合用于促进伤口愈合的可行性。其原理是FUS和CuHARS都能提高一氧化氮水平，这对适当的血管化至关重要。虽然CuHARS的治疗效果可能因生物降解性而在伤口愈合的初期阶段有限，但FUS可能有助于维持更长时间的愈合反应，从而改善治疗效果。我们的长期研究目标是开发一种组织再生平台，通过整合CuHARS和FUS疗法来调节与一氧化氮相关的通路，从而在整个愈合过程中支持血管化。

**材料与方法**
在动物实验之前，我们测量了CuHARS在FUS超声处理下的降解速率及一氧化氮的释放情况。CuHARS的合成方法基于先前报道的工艺[30,31,39]。由于CysNO的半衰期短且对光和温度敏感，因此在每次实验前都会重新合成CysNO。具体方法是将17.56毫克（0.1毫摩尔）半胱氨酸与12微升（0.1毫摩尔）叔丁基亚硝酸盐（Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）混合在1毫升无菌水中，并置于避光容器中。CysNO被视为模拟的RSNO形式，其浓度与血液中的RSNO浓度相当，用于体外实验中的一氧化氮来源。该混合物在冰上持续振荡30分钟后，得到浓度为0.1 M的CysNO储备液。

CuHARS的降解在三种条件下进行评估：10微克/毫升CuHARS在HMEC1培养基中、10微克/毫升CuHARS在1× PBS中，以及10微克/毫升CuHARS与10微摩尔CysNO共同存在于HMEC1培养基中。样品通过我们先前发表的方法[30,31]中的图像分割技术进行量化。量化基于使用光学显微镜在明场模式下测量的CuHARS覆盖面积的变化。使用MATLAB R2022b（MathWorks，美国马萨诸塞州纳蒂克）对降解前后的样本图像进行分割，并将侵蚀部分与剩余部分分离。内置的MATLAB函数numel或bwrea用于计算样本部分的像素总数。通过监测5小时和30小时内的像素数量来计算降解速率。这一量化过程对所有三种CuHARS混合物重复进行，这些混合物分别接受了0.25 MPa、0.5 MPa或0.75 MPa的FUS处理，或者未接受FUS处理的CuHARS溶液。

每个暴露于FUS的CysNO-CuHARS-HMEC1混合物样本中CysNO的分解及随后生成的一氧化氮量通过Greiss Reagent NO试剂盒（Thermo Fisher Scientific Inc., 美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）进行定量，具体操作按照提供的协议进行。使用Agilent Biotek Cytation5板读数仪在548纳米波长下测量吸光度，分别对5小时和30小时的实验进行重复测量。

**小鼠糖尿病伤口模型**
本研究的体内实验使用了杰克逊实验室（Jackson Laboratories）提供的B6.BKS(D)-Leprdb/J型2型糖尿病小鼠（体重32–51克）。所有动物处理过程均遵循堪萨斯大学机构动物护理和使用委员会（IACUC协议编号AUS 188-17，负责人杨新梅博士）批准的方案。每只小鼠的背部皮肤通过手术制造深层皮肤伤口。手术当天，小鼠被转移到诱导室中，使用5%异氟醚在氧气中麻醉约2分钟。麻醉后，小鼠被转移到37°C的加热垫上以维持体温，并在手术过程中通过鼻罩持续给予1%异氟醚维持麻醉。麻醉深度通过足部触觉反应消失来评估。随后使用电动剪修剪背部皮肤，并用脱毛膏化学脱毛2分钟。修剪后的皮肤及周围区域用碘棉签和70%乙醇棉签清洁。使用4毫米直径的活检针（McKesson Argent，美国德克萨斯州欧文）在脊柱的左右两侧背部皮肤上制造全层皮肤伤口（用于伤口愈合研究），每只小鼠共制造两个伤口。使用皮肤专用粘合剂将硅胶伤口夹板（Grace Bio-Labs Silicone Isolators，CultureWell Sheet Material，厚度0.5毫米）固定在皮肤上，防止伤口收缩。硅胶夹板外部尺寸约为1厘米，中心有一个直径6毫米的凹槽，形成环绕伤口的环形夹板。夹板用不可吸收缝线（如丝线或聚丙烯缝线，例如Sharpoint Polypropylene，5-0号）以间隔模式缝合约六针。夹板设计不会妨碍或限制动物的正常活动。术后使用丁丙诺啡作为止痛剂。在手术后，如果观察到动物出现疼痛或与疼痛相关的痛苦症状，根据澳大利亚批准的动物实验方案，将0.05–0.1 mg/kg浓度的丁丙诺啡皮下注射到动物体内，每12小时注射一次。该模型与之前发表的研究[41]中使用的模型非常相似。这些缝线在整个研究期间都保持原位，研究终点分别为7天和14天，之后被移除。治疗组（仅CuHARS和CuHARS+FUS）在放置夹板后立即将1 mg/mL的CuHARS溶液10 μL滴在伤口处，而对照组则没有在伤口处施加任何处理。然后，所有组（包括治疗组和对照组）的伤口都覆盖一层半封闭、半透明的敷料（3M Tegaderm），以创建一个隔离区域，直到预定的研究结束时间。手术完成后，关闭异氟醚，待小鼠从麻醉中恢复后将其转移到常规饲养笼中。

**FUS系统设置**
本研究中使用的FUS系统的示意图如图1所示。在此设置中，使用了一个球形治疗性FUS换能器（曲率半径：63.2毫米），中心频率为0.5 MHz（H-107，Sonic Concepts，Bothell，WA，USA），将FUS波传递到目标区域。FUS换能器的孔径为64毫米，中间孔径为22.6毫米，沿轴向的焦距为21.42毫米，沿横向的焦宽为3.02毫米（在半高压力全宽处测量）。原始的0.5 MHz信号由函数发生器（33250A，Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA）生成，产生2500个正弦周期的声波脉冲，脉冲重复频率（PRF）为20 Hz，用于体内研究。函数发生器的输出通过阻抗匹配网络（Impedance matching network，Sonic Concepts，Bothell，WA，USA）传输到功率放大器（2100 L，Electronics & Innovation Ltd，Rochester，NY，USA），然后再将功率放大器的输出传递到FUS换能器。

**体外实验程序**
在体内治疗之前，使用与图1b类似的设置体外测试了CuHARS的稳定性。在此设置中，使用了一个装有脱气去离子水的水箱来代替圆锥形锥体，以提供FUS传播的耦合。为了防止水泄漏并允许声波正常传播，在锥体的顶点覆盖了一层弹性膜。FUS的焦点位于锥体尖端前方5毫米处。在体内治疗过程中，在小鼠背部隆起处创建了直径为4毫米的圆形糖尿病伤口，并使用微量移液器将生物混合材料（CuHARS）精确地施加到伤口位置。FUS波聚焦在伤口位置，使FUS换能器的锥体顶点完全覆盖伤口区域。FUS换能器沿轴向的焦距为21.42毫米，沿横向的焦宽为3.02毫米，能够覆盖伤口区域。

**体内治疗程序**
在预定的时间点进行体内FUS和CuHARS治疗。对于对照组，不进行CuHARS或FUS治疗。对于仅CuHARS组和CuHARS+FUS组，将CuHARS溶解在0.9%的无菌氯化钠盐水中，浓度为1 mg/ml。使用微量移液器将10 μl的CuHARS溶液滴在伤口区域。在CuHARS-FUS组中，同样量的CuHARS被施加到伤口，并且每48小时对伤口部位进行一次FUS治疗。在仅FUS组中，仅在伤口区域进行FUS治疗。本研究中的伤口大小为4毫米。因此，焦点尺寸为3.02毫米（半高压力宽度）的FUS光束会覆盖皮肤伤口，尽管伤口边缘的压力相对较弱。FUS换能器还会绕其轴旋转，使其尖端覆盖整个伤口。FUS治疗期间，应用了2500个周期、10%占空比、1 MPa压力和20 Hz PRF的FUS脉冲，持续15分钟。每天测量伤口的大小，并根据组别在手术后7天或14天对小鼠实施安乐死。切除伤口区域及其周围真皮边缘的皮肤样本，并在1x PBS中的4%甲醛中固定，以便进行后续的组织病理学分析。

**组织病理学分析**
进行组织病理学分析，以确认收集的皮肤样本中表皮组织和真皮细胞的再生情况。所有皮肤样本均进行了标准的苏木精和伊红（H&E）染色。染色后，将皮肤样本放入Histo-clear? II中准备装片，并使用Permount?装片介质。使用Nikon Eclipse LV100D-U复合明场立式显微镜进行切片成像。图像使用Q Capture Pro Version 6.0.0.412和Q Imaging MicroPublisher 5.0 RTV相机捕获，像素分辨率为2560 × 1920，采用Plan Flour 5X/0.15NA空气物镜。

**统计分析**
统计分析使用位于加利福尼亚州圣地亚哥的IBM公司的SPSS软件进行。结果以平均值±标准误差的形式呈现。使用RM双因素方差分析（RM two-way ANOVA）和Geisoor-Greenhouse校正以及Tukey多重比较测试（适用于n = 3）来确定统计显著性。对于不同实验条件下CuHARS降解的实验数据，统计显著性水平表示如下：“***”，P值< 0.005；“**”，P值< 0.05；“NS”，P值=不显著或> 0.05。在体内伤口愈合模型中，使用Mann Whitney U检验和Wilcoxon秩和检验（适用于治疗组n = 3：仅CuHARS、仅FUS和CuHARS+FUS，以及非治疗组n=4）来测量统计相关性。H1的统计显著性值表示如下：“****”，P值< 0.0005；“***”，P值< 0.005；“**”，P值< 0.05；“NS”，P值=不显著或> 0.05。研究显示，样本降解率的趋势与5小时研究不同，尤其是对于CuHARS在HMEC1培养基中的测试组以及添加了CysNO的CuHARS在HMEC1培养基中的测试组，这是因为之前已有报道指出CuHARS在被动生物条件下会自然降解[31]。与5小时研究相比，CuHARS-HMEC1和CysNO-CuHARS-HMEC1组中的样本降解程度明显高于CuHARS-PBS组中的对照样本。在CuHARS-HMEC1和CysNO-CuHARS-HMEC1组中，当使用0.25 MPa、0.5 MPa和0.75 MPa的FUS处理时，样本的降解速率随时间保持稳定，并且与CuHARS-PBS组在相同压力下的降解速率存在统计学上的显著差异。然而，在CuHARS-HMEC1和CysNO-CuHARS-HMEC1组中，无论是否经过FUS处理，样本之间的降解速率没有显著差异，这表明FUS在给定压力下并未对CuHARS的降解产生额外影响。

图4. 不同实验条件下CuHARS的降解率（绝对面积），持续时间为30小时。分别以0.25 MPa、0.5 MPa和0.75 MPa的压力应用了2500周期、占空比为10%的脉冲聚焦超声。误差条代表三次测量的标准偏差。N = 3。*** p < 0.005。CuHARS-HMEC1；CuHARS-PBS；CysNO-CuHARS-HMEC1。

图5. 显示了在Cu2+离子辅助下CysNO化合物降解后NO释放量的量化结果。结果表明，在5小时和30小时的研究中，CuHARS-HMEC1培养基中均未检测到NO的释放（浓度水平为零）。然而，在CysNO-CuHARS-HMEC1组中，无论是经过超声处理还是未处理，样本在5小时和30小时内的NO生成量都高于CuHARS-HMEC1培养基组。随着FUS压力幅度的增加（从0.25 MPa到0.75 MPa），NO的生成量稳定上升，这可能是由于脉冲FUS产生的机械效应所致。在0.75 MPa的FUS波作用下，CysNO-CuHARS-HMEC1培养基组中的样本在5小时和30小时内的NO浓度分别达到了3.26 μM和5.17 μM。在所有CuHARS嵌入溶液中，经过5小时和30小时处理的样本之间观察到了统计学上的显著差异。

基于体外空化阈值检测实验，选择了1 MPa的FUS峰值压力用于体内治疗，治疗参数为2500周期、10%占空比、20 Hz的脉冲重复频率（PRF）和15分钟的治疗时间。在体内治疗过程中，FUS换能器的放置方式使得换能器焦点与伤口表面之间的距离为2毫米，这是由于在伤口区域覆盖了夹板和Tegaderm。这种峰值压力的微调用于补偿波传播过程中的能量损失，从而使作用在伤口区域的压力约为0.75 MPa，这与体外实验中使用的情况相同。

图6. 显示了使用CuHARS单独处理、FUS单独处理以及CuHARS与FUS联合处理7天和14天的伤口愈合效果。未处理的对照组也进行了展示。未接受任何处理的伤口在7天和14天的治疗周期内没有显示出愈合效果（如图6(b)和(c)所示）。仅使用CuHARS溶液或仅使用FUS处理的伤口显示出部分愈合效果，表皮有部分再生（如图6(f)和6(i)所示），而几乎没有表皮愈合效果（如图6(e)和6(h)所示）。然而，将FUS以1.0 MPa的压力应用于伤口部位，并结合CuHARS溶液进行周期性7天的治疗，显示出良好的愈合效果，表现为形成了薄层的再生表皮和真皮组织（如图6(k)所示）。在14天的CuHARS-FUS治疗中观察到了完全愈合效果，表现为伤口区域覆盖了一层厚厚的表皮（如图6(l)所示），并且由于真皮层增厚，再生区域失去了透明度。

图6 (m & n) 显示了不同组别小鼠糖尿病伤口在治疗7天和14天后的伤口尺寸变化。FUS脉冲以0.5 MHz的频率、1.0 MPa的压力、2500周期、10%的占空比、50毫秒的脉冲持续时间进行了15分钟的处理。N = 6（未处理组）；N = 4（未处理对照组）。**** p < 0.0005；*** p < 0.005；** p < 0.05。NS表示无显著差异。

图6 (m & n) 显示了治疗后的伤口尺寸变化。对照组（未处理）在7天和14天后的伤口尺寸变化微乎其微，平均伤口尺寸分别减少了3.6毫米和3.3毫米。仅使用CuHARS处理的伤口在7天和14天后的平均伤口尺寸分别减少了3毫米和1.5毫米。仅使用FUS处理的伤口也显示出中等程度的愈合效果，平均伤口尺寸分别减少了3.3毫米和2.5毫米。联合使用FUS和CuHARS处理的伤口显示出显著的愈合效果，7天后的平均伤口尺寸减少了2毫米，而在14天后的治疗效果最佳，平均伤口尺寸减少到了不到0.5毫米。

图7. 显示了未愈合伤口和愈合伤口（CuHARS+FUS组）的组织病理学切片。对于愈合的伤口，图7显示了真皮和表皮的整体再生和增厚，表明真皮组织随着时间的推移得到了增强。在14天时还观察到表皮和真皮层变得平坦，整个真皮层分布均匀，表明伤口完全愈合。未愈合的伤口则表现出表皮层破裂，这是由于真皮组织再生不完全所致。

讨论
当前的研究展示了一种新的技术方法，通过结合FUS和CuHARS来诱导完整的伤口愈合过程，与仅使用CuHARS、仅使用FUS或正常愈合过程相比。虽然CuHARS最初可以促进真皮组织的再生，但由于其可生物降解性，可能无法长期持续催化NO的生成，而且真皮层的不完全再生表明再生过程出现了问题。相比之下，FUS可以通过产生剪切应力来刺激内皮细胞生成更多的NO[42]。这可能促进微血管和宏观血管的形成，从而在整个愈合过程中加速血管的再生。FUS与CuHARS的结合可能延长了NO的生成时间，并有助于内皮细胞的迁移和结缔组织的重塑。这不仅完成了表皮的再生，还在14天的连续治疗中完成了真皮层的再生，尽管体外研究表明CuHARS在治疗的最初7天内已经显著降解。这种FUS与CuHARS的联合疗法相辅相成，保持了治疗平衡，使得真皮层在14天内实现了超过95%的再生。与其他传统治疗方法相比，这在糖尿病伤口愈合领域是一个显著的改进。

当前研究的一个局限性是空化效应的作用。由于惯性空化可能会破坏研究中使用的生物材料，我们的目标是在实验中完全避免空化现象。体外空化测量确定了在不产生惯性空化的情况下可以使用的最大声压。我们利用这个值来限制研究中应用的FUS压力。然而，空化对伤口愈合的确切影响取决于空化的类型。惯性空化可能会阻止新生血管结构的形成，导致组织再生失败，而非惯性空化产生的微流可能会增强内皮中的NO生成[43]。目前的研究无法完全排除非惯性空化的影响，这种空化可能自发地出现在溶液中或由于预先存在的核团而产生。在未来工作中，通过系统地监测动物实验中的空化现象，将有助于更好地理解FUS暴露、空化活动与伤口愈合效果之间的关系。

另一个需要关注的是可能的热效应。我们使用Parker [44] 提出的分析公式估算了FUS引起的温度升高：T(t)=μIρC(β4D)ln(1+4Dtβ)，其中μ是介质的强度吸收系数，ρ是介质的密度，C是介质的比热，β是声束的高斯分布度量（假设I(r)=I0e?r2/β），D是热扩散率。在此公式中，μ=0.5 dB/cm/MHz，ρ=1000 kg/m3，C=4184 J/(Kg K)，D=0.11 mm2/s，β=1.6 mm2（适用于3.02 mm的超声束宽度）。由于每个伤口部位的治疗时间为15分钟，t设为15分钟。在0.5 MHz、1 MPa和10%占空比的情况下，温度升高约为0.94 °C。

值得注意的是，焦点区域的超声压力分布从来不是均匀的，而是遵循高斯分布。在当前研究中，焦点处的最大压力为1 MPa。在4毫米直径处，压力幅度会降至0.3 MPa。这种非均匀的超声分布可能会影响治疗效果，未来需要对此进行研究。由于在实际操作中无法实现完全均匀的压力分布，因此需要一个优化过程来研究伤口大小、FUS束大小和治疗结果之间的关系。

作为一种新型材料，CuHARS的性质仍在研究中，其临床应用还需获得FDA的批准。当前研究使用了一个小的浅表皮肤伤口模型来展示FUS与CuHARS结合的概念。然而，当应用于弥漫性、深度较大的伤口时，这项技术可能会遇到挑战。在这种情况下，需要改进递送方法以确保CuHARS能够有效到达伤口部位。此外，由于该技术依赖于CuHARS和FUS之间的协同效应，因此FUS在CuHARS应用后的时机也需要进一步研究。

结论
我们的体内实验表明，FUS与CuHARS的联合治疗显著加速了伤口愈合过程，在14天内实现了完全闭合。相比之下，单独使用CuHARS或FUS在同一时间段内仅实现了部分愈合。这种协同治疗方式可能通过调节整个伤口愈合过程中的内源性一氧化氮（NO）水平来促进血管生成。这有助于加速大血管的形成和细胞的正常分化，从而支持肉芽组织的发育。总体而言，FUS为愈合的第二阶段提供了一种可控的组织重塑机制，显著缩短了糖尿病伤口愈合过程中常见的漫长恢复期。