重组AcHERV-杆状病毒疫苗能够引发针对人类诺如病毒的强烈免疫反应

《Urology Video Journal》：Recombinant AcHERV-baculovirus vaccine elicits robust immune responses against human norovirus

　　

杜永允（Doyoung Yoon）| 李贤东（Hyeondong Lee）| 李英植（Youngjik Lee）| 春正民（Jungmin Chun）| 洪瑞允（Seo-Yun Hong）| 吴正元（Jong-Won Oh）| 金英邦（Young Bong Kim）| 李熙贞（Hee-Jung Lee）

摘要

人类诺如病毒（HuNoV）是全球急性病毒性胃肠炎的主要致病因素，对儿童和老年人群体的影响尤为严重。尽管在诺如病毒疫苗研发方面取得了显著进展，包括基于病毒样颗粒（VLP）的候选疫苗的临床试验，但至今尚未有任何疫苗获得监管机构的批准。在本研究中，我们开发了一种重组杆状病毒疫苗AcHERV-HuNoV，该疫苗旨在表达人类诺如病毒（HuNoV）的VP1蛋白。该疫苗采用了AcHERV平台，该平台由Autographa californica多核多聚hedrovirus（AcMNPV）与人类内源性逆转录病毒（HERV）的包膜蛋白组成，以提高疫苗的递送效率。AcHERV-HuNoV疫苗在杆状病毒包膜上整合了来自HERV-W的Syncytin-1蛋白，并包含了GII.4或GII.17基因型的VP1基因，以代表韩国流行的病毒株。这一系统能够增强基因向哺乳动物细胞的递送，并防止病毒在体内复制。诺如病毒VLPs在昆虫细胞中生产并纯化，用作对照疫苗和比较抗原。通过肌肉注射和鼻内给药的方式，在BALB/c小鼠中评估了AcHERV-HuNoV的免疫原性。最终免疫后，血清IgG的几何平均滴度（GMTs）达到14,132（95% CI: 9080–21,979），IgA水平为262（95% CI: 70–982），且具有针对GII.4的特异性；同时，通过猪胃黏蛋白（PGM）阻断试验验证了其强大的中和活性。此外，该疫苗还诱导了强烈的细胞免疫反应，表现为Th1、Th2和Th17细胞因子的增加分泌。这些结果表明AcHERV-HuNoV作为一种基因疫苗候选者，具有诱导针对诺如病毒感染的体液和细胞免疫反应的巨大潜力。

引言

诺如病毒是全球急性胃肠炎的主要原因，每年估计导致6.85亿例病例，对所有年龄段的人群都造成显著的发病率和死亡率[1]、[2]、[3]、[4]。诺如病毒感染既可引起散发病例，也可引发大规模暴发，尤其是在学校、医院、游轮和养老院等集体环境中，这些环境有利于病毒传播[5]。该病毒具有高度传染性，所需感染剂量极低，并且在环境中具有较长的稳定性，这进一步增加了感染控制和预防的难度[6]、[7]、[8]。

尽管存在这些挑战，包括医疗成本、生产力损失和疫情管理费用，据我们所知，目前尚无获许可的诺如病毒疫苗或特定的抗病毒治疗方法[9]。目前的预防措施主要限于对症治疗和严格的卫生规范，这些措施往往不足以防止病毒的大范围传播，尤其是在疫情期间。因此，开发安全有效的诺如病毒疫苗是世界卫生组织和其他国际卫生机构的关键和紧迫的公共卫生优先事项[10]、[11]、[12]。

诺如病毒是一种无包膜的单链正链RNA病毒，属于Caliciviridae家族；其形状为二十面体，直径约为27–40纳米[13]。病毒基因组长度约为7.5 kb，由三个开放阅读框（ORFs）组成。其中，ORF1编码病毒复制所需的非结构蛋白，ORF2编码主要衣壳蛋白VP1，ORF3编码次要衣壳蛋白VP2[14]、[15]。诺如病毒之间的遗传和抗原多样性主要由VP1区域及RNA依赖性RNA聚合酶区域的序列变异决定，因此它们被分为至少十个基因组群（GI–GX）。其中，GI和GII基因组群主要引起人类感染，其中GII.4株在全球暴发中最为普遍[16]。这种由频繁突变和重组事件驱动的显著遗传多样性，给广谱疫苗的开发带来了重大挑战[17]。为了解决这些问题，研究人员正在探索新的疫苗接种平台。

分子病毒学、逆向遗传学和疫苗技术的最新进展加速了诺如病毒疫苗的研发[3]、[18]。一种值得注意的方法是使用病毒样颗粒（VLPs），这些颗粒由重组表达的VP1蛋白自组装而成。VLPs展示出与天然病毒高度相似的抗原表位，但不包含病毒基因组，使其成为一种有吸引力且安全的疫苗平台。基于VLP的诺如病毒疫苗的临床前和临床研究表明，它们具有良好的免疫原性，能够引发强烈的体液和黏膜免疫反应以及细胞免疫激活[19]、[20]、[21]、[22]。

在此，我们开发了AcHERV-HuNoV，这是一种表达人类诺如病毒（HuNoV）VP1蛋白的重组杆状病毒疫苗。该疫苗采用了AcHERV平台，该平台由Autographa californica多核多聚hedrovirus（AcMNPV）与人类内源性逆转录病毒（HERV）的包膜蛋白组成。通过促进有效的细胞进入和强烈的转基因表达，该平台旨在显著增强体液和细胞免疫反应。这一平台有可能诱导强烈的体液和细胞免疫反应，并已成功应用于针对多种病毒病原体的疫苗开发，包括流感和MERS-CoV[23]、[24]、[25]。通过在AcHERV载体中编码诺如病毒的主要抗原，我们的疫苗旨在引发全身性和局部免疫反应，从而提供广泛而持久的保护。

在这项研究中，我们旨在评估AcHERV-诺如病毒疫苗的免疫原性。这包括测量血清免疫球蛋白（Ig）G和黏膜IgA的产生情况，以及通过细胞因子分泌谱分析来表征细胞免疫反应。这种综合方法旨在克服诺如病毒疫苗开发中的现有挑战，并为设计针对这种强效病毒病原体的有效广谱保护疫苗提供新的见解。

章节片段

细胞培养

Spodoptera frugiperda 9（Sf9；Invitrogen，美国）和High Five?（Hi5；Thermo Fisher Scientific，美国）昆虫细胞在27°C下培养。Sf9细胞在添加了1%抗生素-抗真菌剂的Sf-900? II无血清培养基（Gibco，美国）中培养，而Hi5细胞在含有18 mM L-谷氨酰胺（Gibco）和1%抗生素-抗真菌剂的Express Five? SFM培养基中培养。人类293TT细胞（ATCC，美国）在37°C下，在添加了...

HuNoV VP1的表达

构建了一种重组杆状病毒AcHERV-NoVII4，其中包含了在CMV启动子控制下的HuNoV GII.4 Sydney株的完整VP1基因（图1A）。另一种重组杆状病毒AcHERV-NoVII17则包含了最近在韩国流行的GII.17基因型的VP1基因（图1B）。同时，通过杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达了GII.4株的VP1基因，以生产GII.4 VLPs。

讨论

在这项研究中，我们证明了AcHERV系统作为诺如病毒新型且强大的疫苗平台的潜力。通过在杆状病毒颗粒表面展示内源性逆转录病毒包膜蛋白Syncytin-1，AcHERV显著增强了其在哺乳动物细胞中的感染性和抗原递送效率[25]、[30]、[31]。这种自来源蛋白的整合也可能带来独特的免疫学优势，例如促进耐受性和减少载体...

CRediT作者贡献声明

杜永允（Doyoung Yoon）：撰写——初稿、可视化、验证、方法学、正式分析。李贤东（Hyeondong Lee）：资源提供、概念构思。李英植（Youngjik Lee）：验证、正式分析。春正民（Jungmin Chun）：正式分析。洪瑞允（Seo-Yun Hong）：验证、正式分析。吴正元（Jong-Won Oh）：撰写——审阅与编辑、验证。金英邦（Young Bong Kim）：撰写——审阅与编辑、正式分析、概念构思。李熙贞（Hee-Jung Lee）：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、监督、正式分析，

伦理声明

所有动物实验程序和方案均获得了韩国国民大学（Konkuk University）动物护理和使用委员会的批准（批准编号：KU24137）。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了食品与药品安全部和韩国健康技术研发项目通过韩国健康产业发展研究所（KHIDI）的资助（资助编号：韩国卫生与福利部（RS-2023-KH143167）。本手稿的图形摘要使用BioRender.com创建。