在老年人中，接种Comirnaty或Spikevax JN.1改良型mRNA疫苗后，能够产生强效的交叉中和抗体反应，但细胞免疫反应存在差异

《Urology Video Journal》：Robust cross-neutralizing antibody responses but variable cellular immunity following either Comirnaty and Spikevax JN.1-adapted mRNA vaccination in the elderly

　　云尚堂|陈春珂|吕慧斌|孙元欣|谭志华|袁秀|袁强玲|陈建昌|莫志鹏|许大卫
香港中文大学医学院公共卫生与初级保健学院，香港特别行政区

**摘要**
**背景**
SARS-CoV-2的快速进化持续挑战着疫苗的有效性，尤其是在患重病风险较高的老年人中。自2024年4月以来，世界卫生组织建议使用针对JN.1谱系的单价疫苗抗原来更新COVID-19疫苗。确定这些针对JN.1的疫苗是否能诱导对新兴变种（包括KP.2、KP.3、XEC、XDV、LP.8.1和NB.1.8.1）的交叉保护性免疫仍然至关重要。

**方法**
研究了一组62名参与者（中位年龄63.5岁；41名接种了Comirnaty疫苗，21名接种了Spikevax疫苗），在接种JN.1 mRNA疫苗前后分别进行检测。中和抗体滴度通过替代病毒中和试验（sVNT）或斑块减少中和试验（PRNT）进行评估。T细胞反应通过细胞内细胞因子染色分析，S2特异性抗体水平通过ELISA定量。

**结果**
两种JN.1疫苗均显著增强了针对野生型、JN.1及多种亚型的中和抗体。针对S2的抗体也显著增加，表明能够识别保守的刺突区域。大约一半的参与者体内产生了IFNγ+CD8+或CD4+ T细胞。

**结论**
单价JN.1 mRNA疫苗在老年人中引发了广泛的交叉中和和针对S2的体液免疫反应，尽管细胞反应仍存在异质性。为了持续抵御未来的变种，有必要继续监测并在下一代疫苗设计中纳入保守的T细胞表位。

**1. 引言**
在COVID-19时代之后，SARS-CoV-2病毒的流行仍然是公共卫生问题，尤其是对儿童和老年人而言。奥密克戎变种不断进化并分化为不同的亚型，这些亚型能够逃避人群通过先前感染或疫苗接种获得的群体免疫。虽然源自奥密克戎BA.4变种的XBB变种（包括XBB.1.5、XBB.1.16和EG.5）在2024年初逐渐消失，但新的JN.1变种（BA.2.86的后代）出现了并成为主要流行株[1]。JN.1病毒含有L455S突变（“SLip”突变），该突变已被证明足以增强免疫逃逸能力[2]。此位置的突变此前在EG.5谱系中发现，该谱系还携带FLip突变（F455L + L456F），导致对多种单克隆抗体的免疫逃逸，并表现出更强的ACE2结合亲和力[1]、[3]、[4]、[5]。随后，JN.1病毒继续进化为不同的后代变种，包括KP.2、KP.3、XEC和LP.8.1。值得注意的是，2025年初在香港传播的KP.2和KP.3变种在其刺突上适应了FLiRT突变（L455S + F456L + R346T），这可能增强了抗体的逃逸能力和传播性[6]、[7]。这些变种后来被XDV和NB.1.8.1两种新变种取代，后者是JN.1病毒与XBB后代之间的重组结果[8]。序列分析显示，NB.1.8.1变种获得了V445H突变，这有助于增强受体结合能力，而A435S/T478I突变可能有助于抗体的逃逸[9]、[10]。
截至2026年2月，虽然JN.1仍然是世界卫生组织列出的关注变种（VOI），但有四种变种被列为监测中的变种（VUM），即KP.3.1.1、NB.1.8.1、XFG和BA.3.2[8]。类似于季节性流感疫苗的策略，COVID-19疫苗也在不断更新以应对病毒的进化挑战。自2024年4月以来，世界卫生组织建议使用针对JN.1谱系的单价疫苗抗原作为疫苗成分，尽管最新的疫苗抗原目标是LP.8.1株[11]。这种新的COVID-19 mRNA疫苗主要由两家制药公司提供：Comirnaty（辉瑞，每剂30毫克）和Spikevax（Moderna，每剂50毫克）单价JN.1 mRNA疫苗。我们和其他人之前的研究表明，尽管最新一代的单价XBB.1.5疫苗仍能对JN.1变种产生中和作用，但这种中和作用比祖先野生型（WT）株和XBB.1.5疫苗株要弱[12]、[13]、[14]、[15]、[16]。然而，多项研究表明，作为加强剂的JN.1适应疫苗对JN.1相关后代病毒具有保护作用。Happle及其同事发现，接种Comirnaty JN.1 COVID-19疫苗的受试者对JN.1、KP.2、KP.2.3和LB.1具有增强的中和作用[17]。Aroora及其同事也表明，JN.1 COVID-19疫苗对KP.3.1.1和XEC具有中和作用，尽管其中和作用比针对JN.1时减弱[18]。
尽管研究表明JN.1 mRNA COVID-19疫苗可以预防住院和发病率[19]、[20]、[21]、[22]，但其对老年人（感染后疾病严重程度和死亡率最高的年龄组）的保护效果尚未完全评估。特别是，接种JN.1加强剂后的细胞免疫反应也尚未得到充分研究。在香港，自2024年11月以来，JN.1 COVID-19疫苗已提供给高风险人群，包括老年人和有合并症的人[23]。在这项研究中，我们旨在评估JN.1 mRNA疫苗是否能诱导对JN.1及其亚型的交叉反应性体液和细胞免疫反应。此外，我们还比较了市场上两种现有JN.1 mRNA疫苗的免疫原性和安全性。

**2. 方法**
**2.1. 研究队列设计和参与者招募**
研究队列由接种了Comirnaty（辉瑞）或Spikevax（Moderna）单价mRNA JN.1疫苗的受试者组成。没有年龄或疫苗接种史的限制，但参与者应符合香港特别行政区卫生保护中心的定义，即免疫功能正常。参与者于2025年1月15日至5月9日期间从香港中文大学医学中心和香港特别行政区的威尔士亲王医院招募。每位捐赠者在接种前一天和接种后一个月分别采集10毫升肝素化血液。通过标准化问卷收集包括基础健康状况和疫苗接种史在内的人口统计数据。

**2.2. 伦理声明**
本研究获得了香港中文大学-新界东校区联合临床研究伦理委员会的批准（提案编号2020.229.2.2）。

**2.2.1. 血浆和PBMC分离**
血液样本按照已发表的协议[24]、[25]、[26]进行处理。首先将样本在室温下以3000g离心10分钟以分离血浆。使用Ficoll-Paque Plus培养基（Cytiva）根据制造商的协议分离外周血单核细胞（PBMCs）。PBMCs重新悬浮在含有10%二甲基亚砜（DMSO）的胎牛血清（FBS）中。血浆和PBMCs分别保存在-80°C和液氮中直至使用。

**2.2.2. 通过细胞因子染色和流式细胞术检测T细胞反应**
T细胞刺激使用了由GL Biochem（上海）化学合成的肽库。本研究使用了两个肽池：“JN.1 S”池包含覆盖整个JN.1刺突（S）的肽，以及从https://covariants.org/variants提取的定义突变；“Common SMNE”池包含仅覆盖刺突蛋白保守区域的肽，以及覆盖膜（M）、核衣壳（N）和包膜（E）蛋白的肽。肽以20个残基的形式合成，每个肽有十个重叠的氨基酸残基。首先通过细胞内细胞因子染色来评估T细胞反应。首先将106个冻存的PBMCs解冻，并分三份置于96孔圆底板中。两份等量的细胞分别与300 nM（相当于约0.7 μg/mL）[12]、[24]、[25]的重叠肽池或阴性对照（0.5% DMSO溶于RPMI-1640培养基）在37°C、5% CO2条件下孵育16–24小时。为了增强信号，细胞随后在37°C、5% CO2条件下用GolgiPlug和GolgiStop（BD Biosciences，最终浓度1%）处理4–6小时。表面标记物和细胞因子染色使用以下抗体进行：Zombie NIR-APC/Cy7、anti-human CD3-PE/Dazzle 594、CD4-BV605、CD8-AlexaFluor700、CCR7-PerCP/Cy5.5、CD45RA-APC、CD19-BV510、NCAM1-BV510、CD14-BV510和IFNγ-FITC（Biolegend，美国加州圣地亚哥）。使用BD Biosciences的细胞激活试剂盒作为阳性对照。染色后的细胞在AttuneNxT流式细胞仪（ThermoFisher Scientific）上进行检测和计数。代表性门控策略见补充图2。所有数据在进一步分析前均用相应的DMSO背景值进行了校正。仅分析细胞存活率在80%或以上的样本。机器的检测限在背景校正后设定为0.001%。

**2.2.2. 替代病毒中和试验（sVNT）**
本研究中测试的RBD如下：Wuhan-hu-1（WT）、JN.1、KP.2、KP.3、XDV、XEC和LP.8.1。蛋白质使用Expi293F细胞（ThermoFisher）按照推荐协议表达和纯化。蛋白质在镍亲和层析柱（ThermoFisher）上纯化，然后使用Superdex 200 10/300 GL层析柱（Cytiva）进行大小排阻层析。RBD蛋白使用HRP结合试剂盒（Abcam）按照制造商的协议酶联辣根过氧化物酶（HRP）。纯化的人类ACE2蛋白以100 ng/孔的量涂覆在96孔ELISA微孔板上过夜。微孔板在室温下用2.5%脱脂奶粉封闭1小时。同时，将10 μL测试血清从1:10稀释到1:100000，并与等体积的HRP-RBD结合物混合，然后在37°C下孵育30分钟。每种混合物的100 μL加入涂覆并封闭的ACE2微孔板中，进一步密封并在室温下孵育15分钟。然后用洗涤液（磷酸盐缓冲PBS，含0.1% Tween-20，PBST）洗涤微孔板并干燥，随后向每个微孔中加入100 μL 3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）溶液，在室温下暗处孵育15分钟。通过向每个微孔中加入50 μL 1 M H2SO4来终止反应。在微孔读数仪上测量450 nm处的吸光度值。每种血清的抑制百分比计算如下：抑制百分比（(1 - 样品OD值/阴性对照OD值) × 100%。抑制百分比达到20%或以上的结果被视为阳性。使用GraphPad Prism 8.0拟合剂量反应曲线得到每种样本的50%中和滴度（NT50）。

**2.2.4. 酶联免疫吸附测定（ELISA）针对ORF8和S2蛋白**
ORF8和S2蛋白均来自Expi293F。将100 ng/孔的抗原（ORF8或S2）涂覆在96孔ELISA板（NUMC）上过夜。每个微孔在实验前用100 μL ChonBlock缓冲液封闭1小时。测试血清按1:100稀释（用于ORF8 ELISA）或1:10至1:100000稀释（用于S2 ELISA）。测试血清加入涂覆并封闭的微孔板中，在37°C下孵育2小时。然后去除血清，并用PBST洗涤微孔板三次。加入HRP结合的抗人IgG二次抗体（Beyotime，中国）以1:5000稀释，每孔100 μL。在37°C下再孵育1小时后，用PBST洗涤微孔板四次，然后按照sVNT中的相同程序进行比色分析。对于S2 ELISA，使用GraphPad prism中的内置公式计算曲线下面积（AUC）。

**2.2.5. 斑块减少中和试验（PRNT）**
SARS-CoV-2活病毒实验在香港中文大学的BSL3核心设施中进行，遵循机构指南和批准程序。血清中和试验使用PRNT方法进行。Vero-ACE2-TMPRSS2细胞系（BEI Resources）过表达人类ACE2受体和TMPRSS2蛋白酶，该细胞系在含有10% FBS（Gibco）、1%青霉素-链霉素（Gibco）和10 μg/mL嘌呤霉素（InvivoGen）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM，Gibco）中培养。细胞在PRNT实验前一天接种。测试血清（10 μL，热灭活）从1:10稀释到1:100000，并与等体积的HRP-RBD结合物（约6 ng）混合，在37°C下孵育30分钟。每种混合物的100 μL加入涂覆并封闭的ACE2微孔板中，进一步密封并在室温下孵育15分钟。然后用洗涤液（磷酸盐缓冲PBS，含0.1% Tween-20，PBST）洗涤微孔板并干燥，随后向每个微孔中加入100 μL 3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）溶液，在室温下暗处孵育15分钟。通过向每个微孔中加入50 μL 1 M H2SO4来终止反应。在微孔读数仪上测量450 nm处的吸光度值。每种血清的抑制百分比计算如下：抑制百分比（(1 - 样品OD值/阴性对照OD值) × 100%。抑制百分比达到20%或以上的结果被视为阳性。使用GraphPad Prism 8.0拟合剂量反应曲线得到每种样本的50%中和滴度（NT50）。

**2.2.6. 针对ORF8和S2蛋白的酶联免疫吸附测定（ELISA）**
ORF8和S2蛋白均来自Expi293F。将100 ng/孔的抗原（ORF8或S2）涂覆在96孔ELISA板（NUMC）上过夜。每个微孔在实验前用100 μL ChonBlock缓冲液封闭1小时。测试血清按1:100稀释（用于ORF8 ELISA）或1:10至1:10000稀释（用于S2 ELISA）。测试血清加入涂覆并封闭的微孔板中，在37°C下孵育2小时。然后去除血清，并用PBST洗涤微孔板三次。加入HRP结合的抗人IgG二次抗体（Beyotime，中国）以1:5000稀释，每孔100 μL。在37°C下再孵育1小时后，用PBST洗涤微孔板四次，然后按照sVNT中的相同程序进行比色分析。对于S2 ELISA，使用GraphPad prism中的内置公式计算曲线下面积（AUC）。

**2.2.7. 流式细胞术检测T细胞反应**
T细胞刺激使用了由GL Biochem（上海）化学合成的肽库。本研究使用了两个肽池。“JN.1 S”池包含覆盖整个JN.1刺突（S）的肽，以及从https://covariants.org/variants提取的定义突变；“Common SMNE”池包含仅覆盖刺突蛋白保守区域的肽，以及覆盖膜（M）、核衣壳（N）和包膜（E）蛋白的肽。肽以20个残基的形式合成。首先进行细胞内细胞因子染色以评估T细胞反应。首先将106个冻存的PBMCs解冻并分三份置于96孔圆底板中。两份等量的细胞分别与300 nM（相当于约0.7 μg/mL）[12]、[24]、[25]的重叠肽池或阴性对照（0.5% DMSO溶于RPMI-1640培养基）在37°C、5% CO2条件下孵育16–24小时。为了增强信号，细胞随后在37°C、5% CO2条件下用GolgiPlug和GolgiStop（BD Biosciences，最终浓度1%）处理4–6小时。表面标记物和细胞因子染色使用以下抗体进行：Zombie NIR-APC/Cy7、anti-human CD3-PE/Dazzle 594、CD4-BV605、CD8-AlexaFluor700、CCR7-PerCP/Cy5.5、CD45RA-APC、CD19-BV510、NCAM1-BV510、CD14-BV510和IFNγ-FITC（Biolegend，美国加州圣地亚哥）。百分比抑制率计算公式为：(1 - 样本斑块数量/阴性对照斑块数量) × 100%。通过使用GraphPad Prism 8.0.2.6软件拟合剂量反应曲线，获得了每个样本的50%斑块减少中和滴度（PRNT50）。分类人口统计数据以整体队列或两个疫苗组的百分比显示。T细胞反应和抗体水平（百分比中和或50%中和滴度）以中位数（四分位数范围）报告。分类数据通过卡方检验或费希尔精确检验进行分析。连续数据通过Mann-Whitney检验（非配对比较）或Wilcoxon符号秩检验（配对比较）进行分析。P值小于0.05被视为显著。

3. 结果
3.1. 队列特征和副作用描述
在2025年1月至2025年5月期间，共招募了62名参与者（36名男性，26名女性）。其中，41人（66.1%）接受了Comirnaty单价JN.1 mRNA疫苗作为加强针，而21人（33.9%）接受了另一种mRNA疫苗（Spikevax）。队列的中位年龄为63.5岁（IQR：60–67.75岁）。队列的人口统计数据总结在表1中。虽然41名（66.1%）参与者报告至少一次SARS-CoV-2感染，但使用ORF8 [27]、[28]蛋白的血清学检测显示60名（96.8%）参与者呈阳性，这表明队列中的大多数参与者在参与研究之前已有感染史。所有参与者在第一剂至第三剂中分别接受了原始WT灭活病毒（12人，19.4%）、单价WT刺突mRNA（40人，64.5%）或两者的组合（10人，16.1%）。参与者之前的疫苗剂量中位数为5剂（IQR：5–6剂），其中51人（82.3%）在参与研究前至少接种了五剂疫苗。55名（88.7%）参与者在研究前接受了单价XBB.1.5 mRNA疫苗作为最后一剂加强针。加强针与JN.1疫苗之间的中位间隔时间为356.5天（IQR：323–385.75天）。

表1. 参与者的人口统计特征。

3.2. 两种疫苗组的比较
连续变量使用t检验（参数检验）或Mann-Whitney检验（非参数检验）在两组之间进行比较。如果卡方检验的假设被违反，则使用费希尔精确检验。IQR：四分位数范围。百分比指的是整体队列或分层组中的相应总数。
参与者需要报告接种后的局部（疼痛、红斑、瘙痒、肿胀）和全身（发热、疲劳、腹泻、肌肉疼痛、恶心、头痛、咳嗽、食欲不振、感觉减退、头晕、腹部膨胀、腹痛、呕吐、嗜睡、关节疼痛、皮疹、心悸）反应（表2）。Comirnaty组和Spikevax组之间在局部或全身反应的发生上没有显著差异。最常见的局部反应是注射部位疼痛（Comirnaty组56.1%，Spikevax组52.4%；p = 0.7943），其次是肿胀（Comirnaty组9.8%，Spikevax组23.8%；p = 0.2514），以及瘙痒（Comirnaty组2.4%，Spikevax组0%；p > 0.9999）。36.6%的Comirnaty组和38.1%的Spikevax组参与者没有出现这些局部反应。全身反应在两组中都不常见。75.6%的Comirnaty组和66.7%的Spikevax组参与者没有出现任何十八种全身反应。最常见的全身反应是疲劳（Comirnaty组14.6%，Spikevax组14.3%；p > 0.9999），其次是肌肉疼痛（Comirnaty组9.8%，Spikevax组19.0%；p = 0.4259）。

3.3. 单价JN.1 mRNA疫苗的免疫原性
为了评估JN.1疫苗的效果，我们首先检测了参与者血浆样本中对原始WT病毒和JN.1疫苗株的抗体水平。在接种JN.1疫苗之前，队列中针对WT和JN.1的中位NT50分别为320.2（IQR：99.7–758.6）和74.9（IQR：45.4–94.3），这是通过sVNT试验确定的。值得注意的是，11名（26.8%）参与者的JN.1抗体水平低于1:10。接种后1个月，两种菌株的中和抗体水平显著升高（WT的中位NT50为760.6（IQR：315.4–1382.8），JN.1的中位NT50为353.4（IQR：107.9–736.3）。当分为Comirnaty组和Spikevax组时，两种JN.1疫苗均显著提高了针对WT和JN.1疫苗株的中和抗体水平（图1A–B）。在Comirnaty组，接种前和接种后1个月针对WT和JN.1的中位NT50分别为300.5（WT，p < 0.0001）和78.1（JN.1，p < 0.0001）。在Spikevax组，两种菌株的中位NT50分别为387.9（WT，p < 0.0001）和69.3（JN.1，p < 0.0001）。两种疫苗诱导的接种后抗体水平没有显著差异。

随后，我们通过用JN.1刺突肽池处理参与者的PBMCs，然后计数JN.1特异性IFNγ+CD8+或CD4+ T细胞来检测JN.1疫苗是否能诱导T细胞反应（图1C–D）。Comirnaty疫苗在接种后1个月增加了JN.1特异性CD8+ T细胞反应，但CD4+ T细胞反应没有增加（p = 0.0049）。在Spikevax组，接种后没有观察到JN.1特异性CD8+或CD4+ T细胞的显著增加。在Comirnaty组中，46.3%（CD8+）和48.8%（CD4+）的参与者显示出JN.1特异性T细胞的诱导。同样，在Spikevax组中，57.1%（CD8+）和57.1%（CD4+）的参与者也显示出JN.1特异性T细胞的诱导。两种疫苗组之间的CD8+（p = 0.5921）或CD4+反应者百分比没有显著差异（图1D）。因此，JN.1特异性T细胞仅在部分队列中得到诱导，这表明T细胞反应存在表型异质性。

3.3. 单价JN.1 mRNA疫苗对JN.1衍生病毒的交叉保护作用
由于SARS-CoV-2病毒迅速进化，我们研究了JN.1疫苗是否能对可能成为下一个主要毒株的变体产生交叉保护作用。我们进一步研究了JN.1疫苗对不同衍生亚型的交叉保护作用（图2）。Comirnaty和Spikevax疫苗均显著提高了KP.2（两组均p < 0.0001）、KP.3（两组均p < 0.0001）、XDV（Comirnaty组p < 0.0001，Spikevax组p = 0.0008）、XEC（两组均p < 0.0001）和LP.8.1（Comirnaty组p < 0.0001）的中位NT50。我们还测试了对新临床分离株NB.1.8.1的保护作用，这是一种来自JN.1和XBB谱系的重组病毒（图2F）。两种疫苗均能增强针对该病毒的中和抗体水平，如斑块减少中和试验（PRNT）所示（p < 0.0001）。Comirnaty疫苗将中位PRNT50从17.2（IQR：5.0–52.0）提高到228.3（IQR：85.2–823.6），而Spikevax疫苗将中位PRNT50从15.0（IQR：5.0–85.9）提高到543.8（IQR：115.8–3055.0）。接种后，Comirnaty组和Spikevax组之间的中和抗体水平没有统计学差异。

我们还测试了JN.1疫苗是否诱导针对S2茎区的抗体，因为S2茎区是大多数SARS-CoV-2变体共有的区域（图3A）。使用稳定的S2蛋白进行的ELISA结果显示，两种疫苗在接种前后均诱导了针对S2的抗体（图3B）。Comirnaty组的中位曲线下面积（AUC）从88,326（IQR：71,735–106,933）增加到129,255（IQR：101,801–178,802）（p < 0.0001），而Spikevax组的中位曲线下面积从77,342（IQR：64625–101,555）增加到149,290（IQR：115247–190,654）（p < 0.0001）。接种后两组之间的S2抗体水平没有统计学差异。针对SARS-CoV-2刺突蛋白S2茎区的抗体水平。(A) 刺突三聚体中的一个原聚体（绿色），其中与我们保守肽池覆盖的区域相对应的序列用红色标出。入口表格显示RBD区域是最易变异的区域，而NTD和S2区域则更为保守。(B) 通过ELISA测量的针对S2区域的抗体水平，并以曲线下面积表示。数据以中位数表示，误差条显示相应的四分位数范围。同一疫苗组内的数据通过成对Wilcoxon秩和检验进行比较。Mann-Whitney U检验用于比较两个疫苗组之间的差异。N.S.表示P > 0.05，定义为统计学上不显著。****：p < 0.0001。（关于此图例中颜色的解释，请参阅本文的网页版本。）由于大多数参与者都曾感染过SARS-CoV-2，且一些人接种了灭活的全病毒疫苗，因此针对保守表位的T细胞反应可能在感染变异病毒时提供交叉保护。为了研究该群体是否能够对未来的变异病毒产生T细胞反应，我们调查了针对刺突蛋白和表面蛋白上保守区域的T细胞反应，因为即使在未来的变异病毒中，T细胞表位的变化也较为有限。因此，我们的T细胞检测包括了覆盖刺突蛋白、膜（M）、核衣壳（N）和包膜（E）蛋白保守区域的肽池。结果显示，无论是Comirnaty还是Spikevax JN.1疫苗，总体而言在受到保守肽池刺激时都不会产生更高水平的交叉反应性T细胞（图4A）。然而，与JN.1特异性反应类似，部分群体仍表现出阳性T细胞反应。Comirnaty组的34.1%（CD8+）和51.2%（CD4+）参与者，以及Spikevax组的28.6%（CD8+）和57.1%（CD4+）参与者对保守肽池产生了T细胞反应。两个疫苗组之间CD8+（p = 0.7775）或CD4+反应者的比例没有显著差异（图4B）。下载：下载高分辨率图像（150KB）下载：下载全尺寸图像图4. 接种Comirnaty或Spikevax JN.1 mRNA疫苗的个体对SARS-CoV-2 S/M/N/E保守区域的T细胞反应。(A) 在接种Comirnaty或Spikevax JN.1加强针前后的PBMCs用仅覆盖SARS-CoV-2刺突（S）、膜（M）、核衣壳（N）和包膜（E）蛋白保守区域的肽池进行刺激。通过流式细胞术测量这些保守区域的IFNγ+CD8+或IFNγ+CD4+ T细胞的比例。数据以箱线图表示，误差条表示最小值和最大值。背景（DMSO）减除后的检测限由虚线表示。(B) 每组中显示对S/M/N/E保守区域有IFNγ+CD8+或IFNγ+CD4+ T细胞反应增加的阳性参与者比例。对于(A)和(B)，同一疫苗组内的数据使用成对Wilcoxon秩和检验进行比较。跨疫苗亚组比较使用Mann-Whitney U检验。对于(B)，比例比较使用Fisher精确检验。NS表示统计学上不显著的比较，p > 0.05。3.4. JN.1接种后的年龄特异性疫苗反应尽管老年人是感染SARS-CoV-2后发展成重症的最高风险群体，但研究他们对JN.1疫苗的反应尤为重要。在香港，65岁及以上的老年人被列为优先接种JN.1疫苗的群体。因此，我们通过将群体分为<65岁和≥65岁两组，比较了两种JN.1疫苗的体液和细胞反应（表3）。Comirnaty或Spikevax JN.1疫苗都能显著提高大多数测试变异体的NT50值，但在≥65岁组中，Spikevax疫苗未能显著提高对XDV和LP.8.1的NT50值（两种菌株均为p = 0.0625）。有趣的是，与接种Comirnaty疫苗的同一年龄组相比，Spikevax疫苗在≥65岁组中的增强倍数更高（56.88倍对比13.16倍）。然而，在<65岁或≥65岁年龄组中，两种疫苗之间没有显著差异。表3. 根据年龄划分的两组疫苗的效果。空单元格<65岁年龄分层的NT50几何平均倍数变化及其相应的p值（接种前 vs. 接种后）按年龄分层的疫苗组间比较（接种后时间点）。空单元格Comirnaty <65岁（n = 20）Spikevax <65岁（n = 14）Comirnaty ≥65岁（n = 21）Spikevax ≥65岁（n = 7）Comirnaty vs. Spikevax接种后（<65岁）Comirnaty vs. Spikevax接种后（≥65岁）sVNTNT50几何平均倍数的变化（p值）P值WT+1.88（0.0004）+2.39（0.0001）+2.57（<0.0001）+3.06（0.0156）>0.05>0.05JN.1+3.90（<0.0001）+5.43（0.0002）+6.10（<0.0001）+7.01（0.0156）>0.05>0.05KP.2+3.68（<0.0001）+3.19（0.0002）+3.34（<0.0001）+4.50（0.0313）>0.05>0.05KP.3+6.46（<0.0001）+6.21（0.0001）+5.60（<0.0001）+15.65（0.0156）>0.05>0.05XDV+3.87（0.0001）+2.64（0.0269）+4.26（<0.0001）+7.59（0.0625）>0.05>0.05XEC+3.17（<0.0001）+4.70（0.0007）+3.92（<0.0001）+6.75（0.0313）>0.05>0.05LP.8.1+2.54（0.0066）+2.54（0.0156）+3.18（<0.0001）+2.88（0.0625）>0.05>0.05PRNTPRNT50几何平均倍数的变化（p值）P值NB.1.8.1+15.10（<0.0001）+17.49（0.0004）+13.16（<0.0001）+56.88（0.0156）>0.05>0.05按年龄分层的接种前和接种后JN.1特异性T细胞反应的P值比较按年龄分层的疫苗组间比较（接种后时间点）。Comirnaty <65岁（n = 20）Spikevax <65岁（n = 14）Comirnaty ≥65岁（n = 21）Spikevax ≥65岁（n = 7）Comirnaty vs. Spikevax接种后（<65岁）Comirnaty vs. Spikevax接种后（≥65岁）CD8+0.05470.28130.06450.125>0.05>0.05CD4+0.62550.5625>0.99990.1406>0.050.0175对于JN.1特异性T细胞免疫，两种疫苗在<65岁或≥65岁组中均未能诱导CD8+/CD4+ T细胞反应。接种后时间点的CD8+ T细胞水平在两组疫苗中没有显著差异。然而，≥65岁且接种了Spikevax的参与者其接种后的CD4+ T细胞水平高于同龄但接种了Comirnaty疫苗的参与者。4. 结论与讨论在这项研究中，我们描述并比较了接种了Comirnaty或Spikevax单价JN.1 mRNA加强针的老年疫苗者的体液和细胞免疫反应。这两种疫苗都显著增强了针对原始野生型株JN.1疫苗株以及包括KP.2、KP.3、XEC、XDV、LP.8.1和NB.1.8.1在内的JN.1衍生变异体的中和抗体滴度。这些结果表明，基于JN.1的疫苗接种具有广泛的体液交叉反应性，这与最近报告显示的对循环中的Omicron谱系的增强中和能力一致。相比之下，只有大约一半的参与者表现出可检测到的IFNγ+CD8+或CD4+ T细胞的诱导，这意味着JN.1特异性T细胞反应存在表型异质性，无法普遍得到增强。我们进一步证明，两种JN.1疫苗都显著增加了针对刺突蛋白S2区域的抗体。鉴于S2区域的相对进化保守性及其在介导抗体依赖性效应功能（如细胞毒性和吞噬作用）中的作用，这些发现意味着对未来SARS-CoV-2变异体具有潜在的交叉保护作用。然而，疫苗接种仅在29%–57%的参与者中增强了针对保守刺突或非刺突区域（M、N和E蛋白）的T细胞反应，这突显了需要下一代疫苗设计来更好地维持或增强针对保守病毒目标的细胞免疫。由于队列规模和免疫背景的多样性，进一步将数据细分为更精细的年龄组或之前的疫苗剂量或类型并不实际。为了更深入地了解观察到的免疫原性和T细胞反应的可能主导因素，我们使用SPSS通过多元线性回归进一步分析了sVNT和T细胞反应数据，以年龄、性别、JN.1疫苗类型（Comirnaty与Spikevax）、之前的接种剂量次数以及距离最后一次接种的天数为预测变量（补充表）。除了两种情况外，我们没有发现上述任何预测变量能够混淆sVNT反应：JN.1中和抗体水平可能与年龄（p = 0.031，标准化Beta = 0.283）和之前的接种剂量次数（p = 0.012，标准化Beta = ?0.405）相关。然而，我们对这种关联持谨慎态度，因为整个模型的ANOVA p值为0.050，仅具有边际显著性。XDV中和抗体水平可能与年龄相关（p = 0.037，标准化Beta = 0.287），但整个模型的ANOVA p值为0.347，统计上不显著。总体而言，抗体水平与年龄之间缺乏关联可能归因于我们队列中年龄分布的偏斜，该队列主要由老年人组成。在T细胞反应方面，整个队列观察到了多样化的反应模式。这一模式反映了先前的观察结果，即基于JN.1的疫苗在人类中引发了不同的T细胞激活[35]，[36]，这表明细胞免疫不仅受更新的刺突抗原本身影响，还受到个体免疫背景的强烈影响，例如个体参与者的感染或接种历史，尽管计算分析预测JN.1刺突中的主要T细胞表位可能已经丢失或改变[37]，这也可能解释了此处观察到的有限增强效应。基于多元线性回归，JN.1特异性肽池或保守肽池引起的T细胞反应与年龄、性别、JN.1疫苗类型、之前的接种剂量次数以及距离最后一次接种的天数之间没有强烈关联，除了IFNγ+CD4+ T细胞对JN.1肽的反应可能与年龄相关（p = 0.016，标准化Beta = 0.326，ANOVA p值 = 0.135）。这与我们的实验观察结果一致，即在<65岁和≥65岁组中，疫苗均未诱导T细胞反应（表3）。与年龄相关的免疫衰老似乎不能完全解释近一半参与者中T细胞刺激的缺乏。尽管如此，再次强调，多元线性回归中观察到的缺乏关联可能是由于队列中年龄分布的偏斜。考虑到队列的感染历史，超过96%的参与者ORF8血清呈阳性，这意味着他们几乎都曾接触过COVID-19。因此，即使在接种前，我们的队列也具有相当水平的基线T细胞反应。因此，考虑混合免疫对观察到的T细胞反应异质性的可能贡献也很重要。许多研究表明，加强接种和感染可以诱导持久的刺突或MNE特异性T细胞反应，其中交叉反应性T细胞反应可能在接种三剂野生型mRNA疫苗后的6-18个月内被诱导[42]、[43]、[44]、[45]。同时，也有报告指出从第四次抗原暴露开始T细胞反应达到平台期，无论是通过感染还是接种[44]、[45]、[46]、[47]。值得注意的是，Martinez-Perez及其同事报告了接种前刺突特异性CD4+水平与接种后T细胞频率之间的负相关[47]。尽管我们未能显示出之前的接种剂量次数与CD4+反应之间的强烈关联，但应该注意的是，所有参与者都至少接种了三剂疫苗（中位数5剂），并且在JN.1疫苗接种前在不同阶段接触过COVID-19，这意味着他们已经多次暴露于刺突，可能导致较高的基线T细胞水平。这种对多次接种的偏向可能有助于回归分析中的偏差。此外，已有研究表明突破性感染显著增强了非刺突T细胞反应，从而导致较高的基线[49]，这也可能部分解释了我们的S/MNE肽池未能增强T细胞免疫的原因。针对新兴SARS-CoV-2变异体的交叉保护可以通过多种免疫机制实现。一个重要机制涉及诱导针对刺突蛋白受体结合域（RBD）内保守表位的中和抗体。我们的发现支持这一观点，表明JN.1疫苗接种产生了能够识别多种JN.1衍生变异体RBD的中和抗体。然而，鉴于RBD的高突变率和进化可塑性[38]及其在介导抗体依赖性效应功能（如细胞毒性和吞噬作用）中的作用[39]、[40]、[41]，这些发现意味着对未来SARS-CoV-2变异体具有潜在的交叉保护作用。然而，疫苗接种仅在29%–57%的参与者中增强了针对保守刺突或非刺突区域（M、N和E蛋白）的T细胞反应，这突显了需要下一代疫苗设计来更好地维持或增强针对保守病毒目标的细胞免疫。由于队列规模和免疫背景的多样性，进一步将数据细分为更精细的年龄组或之前的疫苗剂量或类型并不现实。为了进一步阐明观察到的免疫原性和T细胞反应的可能主导因素，我们使用SPSS通过多元线性回归进一步分析了sVNT和T细胞反应数据，以年龄、性别、JN.1疫苗类型（Comirnaty与Spikevax）、之前的接种剂量次数以及距离最后一次接种的天数为预测变量（补充表）。我们没有发现上述任何预测变量能够混淆sVNT反应，除了两种情况。JN.1中和抗体水平可能与年龄（p = 0.031，标准化Beta = 0.283）和之前的接种剂量次数（p = 0.012，标准化Beta = ?0.405）相关。然而，我们对这种关联持谨慎态度，因为整个模型的ANOVA p值为0.050，仅具有边际显著性。XDV中和抗体水平可能与年龄相关（p = 0.037，标准化Beta = 0.287），但整个模型的ANOVA p值为0.347，统计上不显著。总体而言，抗体水平与年龄之间缺乏关联可能归因于我们队列中年龄分布的偏斜，该队列主要由老年人组成。在T细胞反应方面，整个队列观察到了多样化的反应模式。这种模式反映了先前的观察结果，即基于JN.1的疫苗在人类中引发了不同的T细胞激活[35]、[36]，这表明细胞免疫不仅受更新的刺突抗原本身影响，还受到个体免疫背景的强烈影响，例如个体参与者的感染或接种历史，尽管JN.1刺突中的主要T细胞表位可能已经丢失或改变，正如计算分析所预测的[37]，这也可能有助于解释此处观察到的有限增强效应。基于多元线性回归，JN.1特异性肽池或保守肽池引起的T细胞反应与年龄、性别、JN.1疫苗类型、之前的接种剂量次数以及距离最后一次接种的天数之间没有强烈关联，除了IFNγ+CD4+ T细胞对JN.1肽的反应可能与年龄相关（p = 0.016，标准化Beta = 0.326，ANOVA p值 = 0.135）。这与我们的实验观察结果一致，即在<65岁和≥65岁组中，疫苗均未诱导T细胞反应（表3）。与年龄相关的免疫衰老似乎不能完全解释近一半参与者中T细胞刺激的缺乏。尽管如此，再次强调，多元线性回归中观察到的缺乏关联可能是由于队列中年龄分布的偏斜。当我们考虑队列的感染历史时，超过96%的参与者ORF8血清呈阳性，这意味着他们几乎都曾接触过COVID-19。因此，我们可以预期我们的队列在接种前就具有相当水平的基线T细胞反应。因此，考虑混合免疫对观察到的T细胞反应异质性的可能贡献也很重要。许多研究表明，加强接种和感染可以诱导持久的刺突或MNE特异性T细胞反应，其中交叉反应性T鉴于S2在免疫学上的重要性和进化稳定性，我们设计的保守刺突肽库覆盖了该区域的80%以上，以评估这种交叉反应性T细胞免疫。尽管Comirnaty和Spikevax JN.1疫苗都以JN.1刺突蛋白作为抗原，并且预期不会诱导非刺突蛋白相关的T细胞反应，但研究组中混合免疫现象的普遍存在表明，这些受试者可能已经对膜（M）、核衣壳（N）和包膜（E）等保守的非刺突蛋白具有预先存在的T细胞记忆。理想情况下，针对保守刺突序列以及M、N、E蛋白的T细胞反应将在新型变体出现时提供防止疾病进展的最后一道防线。然而，在接种JN.1疫苗后，针对S保守序列或M/N/E特异性T细胞反应的增强效果并未观察到，这突显了高风险人群需要接种更新版本的疫苗以维持足够的抗体介导的保护。

需要注意的是几个限制因素：首先，尽管几乎所有参与者的ORF8血清阳性结果都证实了他们之前曾暴露于SARS-CoV-2，但无法确定具体的感染株，因此无法准确评估免疫印记效应；其次，按年龄和疫苗类型进行的亚组分析受样本量较小的限制，从而影响了统计功效；第三，PBMC（外周血单核细胞）是在接种疫苗一个月后采集的，此时T细胞反应可能已经减弱。尽管如此，这一标准的时间点仍允许对不同疫苗配方进行可靠的对比，并与我们之前的疫苗研究结果保持一致；最后，免疫功能低下的受试者被排除在本研究之外。

**作者贡献**：
Y.S.T.、D.S.H.和C.K.P.M.提出了研究思路并设计了研究方案；K.Y.、K.C.L.和K.K.P.C负责协调和招募受试者；Y.S.T.、C.C.、H.L.和C.K.P.M.分析了数据；Y.S.T.、C.C.、H.L.、Y.S.和C.W.T.实施了实验；Y.S.T.、C.K.P.M.和D.S.H.撰写了论文。

**数据比较**：
使用配对Wilcoxon秩和检验对接种前后的时间点进行了比较；使用Mann-Whitney U检验对不同疫苗组之间的差异进行了比较；P值小于0.05的差异被认为具有统计学意义。

**作者贡献声明**：
Yun Sang Tang：撰写原始草稿、进行研究；
Chunke Chen：进行研究；
Huibin Lv：负责方法学设计；
Yuanxin Sun：进行研究；
Chee Wah Tan：负责方法学设计；
Karen Yiu：进行研究；
Kwun Cheung Ling：进行研究；
Ken K.P. Chan：进行研究；
Chris Ka Pun Mok：撰写并审阅稿件、撰写原始草稿、提出概念框架；
David S. Hui：撰写原始草稿、负责资金筹集。