在一种由高能量饮食引起的瘤胃功能障碍实验模型中，使用口腔-胃采样方法来替代进行瘤胃造口的泌乳奶牛

《Veterinary and Animal Science》：Oral-stomach sampling to replace rumen-fistulated lactating dairy cows in an experimental model of rumen dysfunction from high energy diet

　　安妮·布东（Anne Boudon）|迪米特里·克维亚特科夫斯基（Dimitri Kwiatkowski）|文森特·尼德科尔恩（Vincent Niderkorn）|埃维琳·福拉诺（Evelyne Forano）|皮埃尔·诺齐埃尔（Pierre Nozière）|马蒂厄·西尔伯伯格（Mathieu Silberberg）
法国国家农业食品与环境研究院（INRAE）农业研究所PEGASE，地址：16 Le Clos，35590 Saint Gilles

**摘要**
利用瘘管反刍动物的研究为确定饲料效率提供了工具，但其伦理合理性仍存在争议。我们的目的是验证口腔-胃采样（OSS）是否可以作为通过瘤胃套管采样的替代方法，以表征由产酸饲料引起的瘤胃液成分的变化。在三个为期四周的阶段（P1、P2、P3）中，六头装有瘤胃瘘管的奶牛分别被喂食标准饲料（P1和P3阶段）或富含淀粉的饲料（P2阶段）。每周上午8:30（晨喂前）以及每个阶段每三周一次下午1:30，通过套管在三个位置（网胃、腹侧囊或两者混合）收集瘤胃液，并通过OSS方法采集样本。无论采样位置如何，使用OSS方法获得的瘤胃液pH值均高于套管采样（上午8:30时高0.44个单位，下午1:30时高0.56个单位，P < 0.001）；而瘤胃液中挥发性脂肪酸（VFAs）的浓度较低，VFAs的摩尔比例要么不受采样方法/位置的影响（丁酸、异构VFAs，P > 0.10），要么虽然受影响但变化幅度有限（P < 0.05）。我们的实验设计无法通过OSS方法检测到产酸条件与对照组之间的瘤胃VFAs浓度差异，而套管采样则能检测到这种差异。结果表明，目前关于在实验设计中使用OSS的程序和建议仍需进一步完善。

**引言**
近一个世纪以来，装有瘤胃瘘管的反刍动物一直被用于研究，这些研究有助于预测饲料的营养价值并建立反刍动物饲料配方的原则（Mould, 2002; Doreau, 2008; Phillips, 2021）。这些研究结果使得能够制定出既能优化动物生产性能又能保持动物健康并减少环境污染的饲料配方（INRA, 2018）。这种动物在全球广泛使用的一个原因是，手术完成后可以将其长期饲养在畜群中（Durand et al., 2021）。这是因为瘤胃壁与皮肤缝合后感染风险极低，且对动物的干扰很小（Doreau, 2008）。然而，使用这类动物仍存在争议（Pagella et al., 2018; Phillips, 2021）。当考虑到这些研究的目的是提高动物生产力或资源利用效率时，争议更加明显。除了装有瘤胃瘘管的反刍动物外，关于实验动物使用的争论也在欧洲持续存在，并且迫切需要寻找替代方案、减少实验动物的使用并改进现有方法（MacArthur Clark, 2018; Veissier and Deiss, 2022）。然而，鉴于气候问题，提高农场动物的饲料效率、减少肠道甲烷排放以及评估新型食物资源的营养价值变得越来越重要。因此，就瘤胃瘘管动物的替代方案达成共识比以往任何时候都更为重要（Mould, 2002; Doreau, 2008; Pagella et al., 2018）。

某些类型的测量需要使用装有瘤胃瘘管的反刍动物，例如测量饲料在瘤胃中的降解情况、消化通过时间、体外发酵器的接种、瘤胃内容物的物理化学性质动态表征或微生物群分析。对于后三种测量，需要直接接触瘤胃内容物。口腔-胃采样（OSS）是一种被证明可以替代通过瘤胃瘘管采样的方法。大量研究表明，与通过瘘管采样的参考方法相比，OSS可能导致测量偏差（Geishauser and Gitzel, 1996; Duffield et al., 2004; van Gastelen et al., 2019; de Assis Lage et al., 2020; Larsen et al., 2020）。这种偏差主要体现在OSS会导致样本稀释，可能是由于探针通过食道时被唾液污染（Duffield et al., 2004），或者是因为采样位置位于瘤胃的颅侧背区而非中央腹侧区，导致探针未能穿过瘤胃中的纤维层（Shen et al., 2012; Larsen et al., 2020）。不过，一些作者认为通过优化探针设计、调整管长以控制采样位置或丢弃可能被唾液污染的前150-200毫升样本可以减少偏差（Duffield et al., 2004; Shen et al., 2012）。尽管存在偏差，但OSS仍能提供相对准确的测量结果。

然而，除了需要评估这种方法对动物福利的影响外，推广OSS并放弃瘤胃瘘管采样还需要充分评估OSS本身的偏差及其对未来实验设计可能产生的影响。上述关于OSS与瘤胃瘘管采样的比较均未基于旨在诱导特定参数变化的实验设计。因此，我们的目标是验证一种优化的OSS方法，以其在模型实验中区分不同处理组之间的能力，研究产酸饲料对哺乳期奶牛瘤胃成分动态的影响。由于文献中已广泛描述了亚临床酸中毒对瘤胃pH值和发酵过程的影响，所选的处理组为产酸饲料和对照组（Humer et al., 2018）。

**材料与方法**
本研究于2020年1月4日至3月26日在法国国家农业食品与环境研究院（INRAE）的IE PL部门（地址：35650 Le Rheu，法国；网址：https://doi.org/10.15454/yk9q-pf68，协议编号L2018）进行。实验设计和程序已获得地区伦理委员会和法国研究部的批准（批准编号：APAFiS #26894-2020081715322100_v2）。

**动物与饲料**
本研究共涉及六头处于哺乳早期的多胎荷斯坦奶牛。实验开始时，这些奶牛的产奶时间为93 ± 10天，日均产奶量为35.0 ± 12.2公斤，体重为686 ± 72.4公斤。所有奶牛都被安置在牛舍中，每头牛单独饲养，可自由获取水和纯盐块。每个牛舍面积为1.4 × 2.0米，并配备了橡胶垫。实验前一周，所有奶牛都适应了这种环境，并通过观察标准产奶饲料的日摄入量来确定其最大摄入能力（每日拒绝摄入量约为饲料总量的10%）。为避免产酸饲料引起的日摄入量波动，并确保瘤胃采样时间能代表整个周的情况，实验期间每天分配给每头奶牛的饲料量设定为其最大摄入能力。

实验期间，奶牛连续四个星期分别接受两种饲料：
- **第一阶段（P1）**：喂食与实验前相同的对照饲料，即该实验设施常规使用的产奶饲料。该饲料中浓缩物的含量较低（干物质基础12%，淀粉含量为21.6%）。
- **第二阶段（P2）**：喂食高能量饲料（干物质基础55%，其中浓缩物含量较高，淀粉含量为25.8%）。这种高淀粉饲料在10天内逐渐引入，以防止急性瘤胃酸中毒。尽管高能量饲料通常用于提高产奶量，但由于淀粉含量高，也存在亚急性瘤胃酸中毒的风险。
- **第三阶段（P3）**：在经过两天的逐步过渡后，奶牛恢复到实验开始时使用的对照饲料。奶牛每天分别在上午9:00和下午5:30接受两次饲料（每次60%的TMR）。为确保饲料能引起亚急性瘤胃酸中毒，奶牛被要求在限定时间内吃完饲料。它们在晨喂后有4小时、晚喂后有5小时的进食时间。这些时间安排也确保了饲料的完全摄入。每次喂食后都会收集未被摄入的饲料，并每天称重，以便计算三个实验阶段的平均日摄入量（DMI）。

**饲料组成**
表1列出了喂给奶牛的饲料组成（饲料为自由采食的混合饲料；标准饲料在P1和P3阶段喂食；产酸饲料在P2阶段喂食）。

**采样程序与测量**
每种饲料成分及混合饲料（TMR）每周均进行采样，并储存于-20°C条件下直至分析。饲料的营养价值计算依据INRA（201）的标准方法：
1. **粗蛋白**：使用Leco Corp.（St. Joseph, MI）的Dumas方法进行测定。
2. **纤维含量（NDF和ADF）**：使用Fibersac提取单元和α-淀粉酶处理，结合Van Soest方法进行测定，并进行灰分校正（Ankom Technology Corp., Fairport, NY）。
3. **淀粉含量**：根据欧盟委员会法规15/2009采用极谱法测定。
4. **牛奶产量与成分**：每天两次挤奶（06:45和17:00），使用Tru-Test牛奶计量仪记录每头奶牛的产奶量。牛奶中的脂肪和蛋白质含量由外部实验室（MyLab, Chateaugiron, France）通过红外光谱法测定。

**瘤胃液采样**
瘤胃液通过套管采用三种不同方法采集：
- （i）直接在网胃中采样，得到网胃液样本（RCn）；
- （ii）在腹侧囊中采样，得到腹侧囊液样本（VSCn）；
- （iii）将网胃液和腹侧囊液按50/50比例混合后采样，得到混合样本（MCn）。

**结论**
尽管OSS存在测量偏差，但在评估其对动物福利的影响以及推广其应用之前，仍需充分了解这些偏差及其对未来实验设计的影响。目前关于OSS与瘤胃瘘管采样的比较均未基于旨在诱导特定参数变化的实验设计。因此，我们的目标是验证一种优化的OSS方法，以其在模型实验中区分不同处理组的能力，研究产酸饲料对哺乳期奶牛瘤胃成分动态的影响。由于文献中已详细描述了亚临床酸中毒对瘤胃pH值和发酵过程的影响，所选处理组为产酸饲料和对照组。样品每周在0830小时、1330小时和1630小时从每头牛身上采集一次。网胃-瘤胃液也在P1周3天、P2周3天和P3周3天的0830小时通过OSS方法采集。这样在整个实验期间，每头牛只需每天被采样两次。每次OSS采样都是在前面提到的套管采样后立即对6头牛进行的。对于这6头牛来说，从套管采样开始到OSS采样之间的时间始终少于15分钟。OSS采样是通过一个专用的冲洗/采样泵（Ammerlaan Import，Longnes，法国）完成的，该泵连接着一根半柔性的300厘米长的软管（直径20毫米，由聚氯乙烯PVC制成，RS Pro，英国），软管与泵之间有一个收集瓶（1升Duran硼硅酸盐玻璃瓶）（Popova等人，2022年），如图1所示。软管直径为20毫米，插入长度为200厘米，末端装有不锈钢过滤器（24个孔，直径10毫米）。在实验前（0830小时）手动检查了软管是否能够到达6头牛的瘤胃腹侧囊。为了防止唾液污染，在每次采样时都会系统地丢弃前500毫升的瘤胃液。

所有网胃-瘤胃样本的pH值都是使用实验室pH电极（Electrode pH - SI Analytics - BlueLine 25 pH）即时测量的，该电极连接到一个pH计（pH3310，WTW，Xylem Analytics，Weilheim，德国）。然后样本通过尼龙织物（400微米）过滤，过滤后的瘤胃液在液氮中冷冻后储存在2毫升的Eppendorf管中，以备后续的矿物质浓度分析。只有每周0830小时以及每三周1330小时收集的样本被用于挥发性脂肪酸（VFA）和氨（NH3）的分析。对于矿物质（Ca、K、Mg、Na、P），只有每周0830小时以及每三周1330小时收集的样本被分析。对于VFA分析，将800微升瘤胃液加入到500微升0.5 N HCl中，其中含有2%（重量/体积）的偏磷酸和0.4%（重量/体积）的巴豆酸。对于NH3分析，将500微升瘤胃液加入到5% H3PO4中。所有样本管都储存在-20°C直到实验室分析。

所有数据处理和统计分析都是使用R3.2.3软件进行的，该软件结合了以下包：ggplot2、lubridate、tidyr、dplyr、lmerTest和emmeans。在整个实验期间每天或每周多次收集的所有变量（日采食量、产奶量、牛奶脂肪和蛋白质含量、瘤胃pH值）都按每头牛和每周的平均值进行了处理，以便绘制图表。为了分析采样方法对测量的影响以及动物对饮食变化的适应动态，统计个体是指每个周期最后两周内每头牛分析的参数的平均值（n=18头牛×周期），除了那些仅在第三周测量一次的参数。统计模型是以下混合模型：
yijk = μ + Pi + Sj + (P × S)ij + bk + εijk
其中yijk是使用采样方法或地点j在周期i期间测量的动物k的响应变量，μ是响应变量的总体平均值，Pi是周期（P1、P2和P3三个水平）的固定效应，Sj是采样方法或采样地点的固定效应，有四个水平（OSS、RCn、VSCn和MCn），(P × M)ij是周期和采样方法或地点之间交互作用的固定效应，bk是牛（k在1到6之间）的随机效应，考虑了同一动物内的重复测量，假设其呈正态分布，均值为0，方差为σ2animal，εijk是残差误差项。

为了评估每种采样方法量化周期效应的能力，还对来自OSS和VSCn采样的数据进行了单独的统计分析，使用了仅包括周期的固定效应和牛的随机效应的简化模型。当P < 0.05时认为差异显著，当0.05 ≤ P < 0.10时认为存在趋势。使用Tukey检验进行了事后分析，以比较按周期和/或测量方法调整后的平均值。计算了OSS（预测值）和VSCn采样之间的均方根预测误差（RMSPE），因为VSCn在进食和反刍咀嚼过程中不太可能受到唾液的即时和短暂稀释（Shen等人，2012年）。RMSPE被分解为中心趋势误差（ECT）、回归误差（ER）和分散误差（Bibby和Toutenburg，1977年所述）。

参与实验的六头动物中有两头在P2期（高淀粉期）初期出现了蹄部病变和冠状带肿胀。这些临床症状迅速消失，因此我们将所有动物保留在实验中。每个周期最后两周参数平均值的最小二乘均值作为补充文件提供（表S1-S6）。

考虑到每个周期最后两周的平均值，日采食量（DMI）不受周期影响，而产奶量在P2期比P1期和P3期更高（图2，P2期为39.2千克/天，而P1期和P3期平均为34.6千克/天，PPeriod < 0.05）。牛奶脂肪含量在P1期和P2期之间从33.1克/千克显著下降到15.8克/千克，并在P3期上升到29.0克/千克，但仍低于P1期（PPeriod < 0.001）。牛奶蛋白质含量在P2期比P1期或P3期高，但大小效应有限（P2期为29.3克/千克，而P1期和P3期平均为27.9克/千克，PPeriod < 0.01）。因此，与牛奶脂肪含量一样，牛奶脂肪和蛋白质含量之间的比率在P1期和P2期之间显著下降，然后在P3期上升（表S1，周期效应PPeriod < 0.001）。

无论采用哪种采样方法或地点，P2期的瘤胃pH值在1330小时和1630小时都低于P1期和P3期（图3，表S2，PPeriod < 0.001）。在P1期和P2期之间，1330小时下降了0.64个单位（P1期为6.21，P2期为5.57），1630小时下降了0.17个单位（P1期为6.34，P2期为6.17）。在0830小时，P1期的瘤胃pH值低于P2期和P3期（-0.22个单位，PPeriod < 0.001），但在三个周期内都保持在6.81到7.04之间。

无论采用哪种采样方法或地点，通过OSS获得的瘤胃pH值在1330小时和1630小时都高于通过套管获得的pH值（PPeriod < 0.001）。0830小时时，OSS获得的pH值比RCn、MCn和VSCn获得的pH值高0.44个单位（OSS平均为7.28，RCn、MCn和VSCn平均为6.84），1330小时时高0.56个单位（OSS平均为7.28，RCn、MCn和VSCn平均为6.38）。考虑到所有个体测量数据，OSS和VSCn之间的pH值差异为-0.48。

在0830小时，P2期的瘤胃VFA浓度较低（图4，表S3，PPeriod < 0.001），为79.1毫摩尔/升，而P1期和P3期为90.3毫摩尔/升。乙酸和丁酸的摩尔比例以及乙酸/丙酸的摩尔比率在P1期和P2期之间显著下降（分别下降了-10.3和-3.20毫摩尔/100毫摩尔，以及-1.89毫摩尔/毫摩尔；PPeriod < 0.001），而丙酸和次要VFA的摩尔比率显著增加（分别增加了+3.84和+1.06毫摩尔/100毫摩尔；PPeriod < 0.001）。在P3期，乙酸、丙酸、次要VFA和iso-VFA的摩尔比例以及乙酸和丙酸的比率恢复到与P1期观察到的值无显著差异的水平。只有丁酸的摩尔比例恢复到略低于P1期的水平（PPeriod < 0.001）。在1330小时，瘤胃VFA浓度在P1期（149毫摩尔/升）和P2期（188毫摩尔/升）之间也有所增加，但在P2期和P3期之间没有差异（P2期和P3期平均为184.7毫摩尔/升）。对于VFA的摩尔比例（图4、图5、表S3和S4），1330小时与0830小时相比，P1期和P2期之间的相对变化相同，但乙酸的摩尔比例和乙酸与丙酸的摩尔比率的变化幅度较小，而丙酸的摩尔比例和次要VFA的摩尔比例的变化幅度较大（丙酸的摩尔比例增加了+5.7毫摩尔/100毫摩尔，次要VFA的摩尔比例减少了-4.23毫摩尔/100毫摩尔）。在1330小时，iso-VFA的摩尔比例在P1期和P2期之间下降，而在0830小时增加。在P3期，乙酸、丙酸、丁酸和iso-VFA的摩尔比例也恢复到与P1期观察到的值无显著差异的水平。然而，次要VFA的摩尔比例恢复到略低于P1期的水平（PPeriod < 0.001），而乙酸和丙酸的比率在1330时恢复到略高的水平（PPeriod < 0.001）。小写字母表示不同时间段内均值之间存在显著差异，大写字母表示不同采样方法或地点之间均值之间存在显著差异。当P < 0.05时，认为存在统计学差异。图中仅包含具有显著P值（P < 0.10）的时期、地点或交互作用效应。t: 0.05 < P ≤ 0.10, *: 0.01 < P ≤ 0.05, **: 0.001 < P ≤ 0.01, ***: P ≤ 0.001。

图5. 实验过程中1330小时时瘤胃中挥发性脂肪酸（VFAs）和氨的浓度动态以及VFAs的摩尔比例（平均值±标准差）。统计分析的单位是每个时期每头牛的最后两周的平均值，lsmeans在表S3中提供：第1时期包括第1至第4周，第2时期包括第5至第8周，第3时期包括第9至第12周）。小写字母表示不同时间段内均值之间存在显著差异，大写字母表示不同采样方法或地点之间均值之间存在显著差异。当P < 0.05时，认为存在统计学差异。图中仅包含具有显著P值（P < 0.10）的时期、地点或交互作用效应。t: 0.05 < P ≤ 0.10, *: 0.01 < P ≤ 0.05, **: 0.001 < P ≤ 0.01, ***: P ≤ 0.001。在0830小时和1330小时，通过OSS方法获得的瘤胃VFAs浓度低于通过套管采样获得的浓度（PSite < 0.001）。在0830小时，两种采样方法之间的差异为27.0 mmol/L；在1330小时，差异为40.0 mmol/L。根据所考虑的VFAs类型和采样时间，VFAs的摩尔比例受采样方法或地点的影响不同。在0830小时，通过OSS方法获得的瘤胃液中乙酸的摩尔比例略高于通过套管采样获得的瘤胃液中的摩尔比例（+ 1.22 mol/100 mol，PSite < 0.001），而丙酸和其他次要VFAs的摩尔比例略低（- 0.8，PSite < 0.05；- 0.20，PSite < 0.01）。在1330小时，通过OSS方法获得的瘤胃液中乙酸的摩尔比例高于通过套管采样获得的瘤胃液中的摩尔比例（+ 2.1，PSite < 0.01）。乙酸/丙酸比率也有类似的变化（+ 0.22，PSite < 0.05）。在1330小时，通过OSS方法获得的瘤胃液中丁酸的摩尔比例倾向于低于通过套管采样获得的瘤胃液中的摩尔比例（PInteraction < 0.10）。考虑到所有单独的测量结果，OSS和VSCn之间观察到的VFAs摩尔比例的差异相对较小：C2为2.04%，C3为4.18%，C4为3.72%，而pH值（7.14%）和总VFAs浓度（25.7% mmol/L）的差异较大。

在0830小时，通过套管采样获得的瘤胃液中的VFAs浓度略高于通过网状囊采样获得的瘤胃液中的VFAs浓度（VSCn为99.8 mmol/L，RCn为91.3 mmol/L，PSite < 0.001），并且第1时期瘤胃VFAs浓度的差异倾向于比第2和第3时期更大（PInteraction < 0.10）。

在0830小时（图4），瘤胃中的氨浓度在两个时期之间保持稳定，而在第2和第3时期之间增加（+ 0.55 mmol/L，PPeriod < 0.05）；而在1330小时（图5），氨浓度在第1和第2时期之间显著下降（-3.42 mmol/L，PPeriod < 0.001），并在第3时期恢复到接近第1时期的水平。在0830小时，VSCn中的氨浓度高于RCn或OSS样本中的氨浓度（PSite < 0.05），而在1330小时，氨浓度不受采样方法或地点的影响（P > 0.10）。

从OSS分析预测腹侧囊的发酵参数（pH、VFAs和NH3）的结果见图6。对于所有参数（pH、氨和所有VFAs的摩尔比例），决定系数范围为r2 = 0.69至r2 = 0.95。VFAs的摩尔比例的RMSPE较低，而pH、VFAs浓度和氨的RMSPE相对较高。由于回归造成的RMSPE成分（ER）对于所有参数都非常低，范围从乙酸和氨的摩尔比例为0%到异构VFAs的摩尔比例为11%。所有预测斜率要么与bisector重合，要么呈现平行偏移：对于瘤胃pH为+1.97，对于瘤胃VFAs为-0.32。对于pH和VFAs浓度，RMSPE的主要成分是ECT，分别占pH的80%和VFAs的69%。对于所有VFAs的摩尔比例，RMSPE的主要成分是随机误差（EC），范围从异构VFAs的57%到丁酸的摩尔比例为84%。

图6. 不同采样方法（OSS与VSCn）之间发酵参数（pH、总VFAs、主要VFAs、次要VFAs和氨）的线性回归。线性回归调整系数为r2，RMSPE表示每个参数的预测总误差；ECT、ER和EC分别表示中心趋势误差、回归误差和随机误差成分。

当分别对OSS和VSCn采样获得的数据进行统计分析时，发现除了0830小时的乙酸/丙酸摩尔比例外，OSS的SEM始终高于VSCn的SEM。对于乙酸/丙酸摩尔比例，两种采样方法识别时期效应的能力没有显著差异。然而，对于瘤胃pH或VFAs浓度，OSS的时期P值系统性地高于VSCn。此外，OSS采样未能检测到13:30时第2和第3时期之间pH的显著增加（这一现象在VSCn中也观察到），也未检测到0830时时期对瘤胃VFAs浓度的显著影响（这一现象在VSCn中也观察到）。关于OSS和VSCn获得的数据的其他参数的单独统计分析结果见表S7和S8。

表2. 不同时间点（08:30和13:30）瘤胃pH和VFAs浓度以及摩尔比例受时期影响的情况，取决于瘤胃液是通过套管还是通过口胃采样收集的（统计单位是每个时期每头牛的最后两周的平均值，给出了lsmeans，对每个时间和采样方法进行了独立分析，包括参与实验的6头牛）。

时间 位置 1 2 3
SEM 3 P 3
08:30 VSCn 6.66 6.91 6.92 0.03 6 <0.001
OSS 7.11 7.35 7.39 0.06 5 0.017
13:30 VSCn 5.94 5.42 5.98 0.08 0 <0.001
OSS 6.63 6.06 6.46 0.11 8 0.009

08:30 VSCn 110.2 89.3 99.9 4.3 <0.001
OSS 68.9 34.7 35.5 5.8 NS
13:30 VSCn 170.3 20 2.6 19 6.9 8.2 <0.001
OSS 124.0 16 5.7 14 8.9 0.01 2

08:30 乙酸/丙酸（mmol/mmol） VSCn 3.68 1.9 3.64 0.10 2 <0.001
OSS 4.0 2.0 2.0 3.8 0.10 0 <0.001
13:30 VSCn 2.8 2.1 3.1 0.08 1 <0.001
OSS 3.2 2.3 5.1 0.1 2 0.001

1. 瘤胃采样方法：VSCn通过套管；OSS：口胃采样。
2. 第1和第2时期：饲料中浓缩物的比例较低（12% DM）且淀粉含量较低（18% DM）；第2时期：饲料中浓缩物的比例较高（55% DM）且淀粉含量较高（29% DM）。所有时期持续4周。
3. VFAs：挥发性脂肪酸；SEM：均值的标准误差；PPeriod：时期效应的P值；NS：不显著。统计模型将时期作为固定效应，将牛作为随机效应。

0830小时时，瘤胃中Mg和P的浓度在第1和第2时期之间增加，在第3时期降低到接近第1时期的水平（图7和表S5，PPeriod < 0.001）。K的浓度在第1和第2时期之间保持稳定，在第2和第3时期之间增加（PPeriod < 0.01）；而Na的浓度在第1和第2时期之间降低，在第2和第3时期之间没有变化（PPeriod < 0.01）。通过OSS方法获得的瘤胃液中的Mg浓度低于通过套管采样获得的瘤胃液中的Mg浓度（PSite < 0.01），而Na的浓度较高（PSite < 0.01）。Ca的浓度不受时期或采样方法或地点的影响（P > 0.10）。

图7. 实验过程中1330小时时瘤胃中矿物质（Ca、Mg、P、K和Na）的浓度动态（平均值±标准差）。小写字母表示不同时间段内均值之间存在显著差异，大写字母表示不同采样方法或地点之间均值之间存在显著差异。当P < 0.05时，认为存在统计学差异。图中仅包含具有显著P值（P < 0.10）的时期、地点或交互作用效应。t: 0.05 < P ≤ 0.10, *: 0.01 < P ≤ 0.05, **: 0.001 < P ≤ 0.01。在1330小时，与0830小时一样，Mg的浓度在第1和第2时期之间增加，在第3时期降低到接近第1时期的水平（图8和表S6，PPeriod < 0.001）。通过OSS方法获得的瘤胃液中的Mg浓度低于通过套管采样获得的瘤胃液中的Mg浓度（PSite < 0.01），而Na的浓度较高（PSite < 0.01）。然而，其他分析元素的浓度都受到时期和采样方法交互作用的影响。在第1和第2时期，通过OSS方法获得的瘤胃液中的Ca浓度明显低于通过套管采样获得的瘤胃液中的Ca浓度，而在第3时期两种采样方法之间没有差异（PInteraction < 0.001）。K的浓度变化趋势也相同（PInteraction < 0.10）。与0830小时一样，P的浓度在第1和第2时期之间明显增加，在第3时期降低到接近第1时期的水平，但通过套管采样获得的瘤胃液中的P浓度增加更为明显（PInteraction < 0.05）。

在本研究中，基于高能量饲料分布的营养挑战成功地在第2时期引发了酸中毒（Sauvant和Peyraud，2010）。这一点特别体现在乙酸/丙酸比率降至3以下（Sauvant和Peyraud，2010）。牛奶产量和质量的显著下降以及脂肪/蛋白质比率的降低与实验奶牛在酸中毒期间常见的情况一致（Silberberg等人，2024）。瘤胃pH值主要在1330小时喂食后发生变化，而在0830小时没有变化，这与Villot等人的描述一致（2017），他们认为酸中毒期间瘤胃pH值不一定降低，而是在一天中变化较大（Villot等人，2017）。我们的结果显示，与通过套管采样相比，通过OSS采样获得的瘤胃pH值较高，VFAs浓度较低。这一结果与其他许多进行相同比较的研究一致（Duffield等人，2004；Shen等人，2012；van Gastelen等人，2019；Larsen等人，2020），尽管有些研究没有观察到这种差异（Geishauser和Gitzel，1996；Shen等人，2012）。我们观察到的OSS和套管采样之间的系统pH偏差也在几位作者观察的范围内：在我们的案例中为+0.48，而Duffield等人（2004）为+0.34，Shen等人（2012）为+0.32，van Gastelen等人（2019）为+0.55，在类似的采样条件下。然而，我们观察到在OSS采样中乙酸的比例较高，而丙酸和其他次要挥发性脂肪酸（VFAs）的比例较低，这与VSCn采样结果不同，这是我们研究中的特定现象。实际上，多项研究表明采样程序并未影响VFAs的摩尔比例（Lodge-Ivey等人，2009年；van Gastelen等人，2019年；de Assis Lage等人，2020年）。我们在瘤胃腹侧囊中观察到的较高VFAs浓度与文献数据一致（Duffield等人，2004年；Shen等人，2012年）。比较采样部位的目的是为了考虑不同团队之间插管采样程序的差异，尽管推荐在瘤胃腹侧囊进行采样（Geishauser和Gitzel，1996年）。在我们的实验中，尽管差异显著，但数值上很小。我们的结果表明，与OSS相比，在网胃或瘤胃腹侧囊采样对瘤胃液成分的影响很小。

我们对瘤胃矿物质含量的分析表明，唾液稀释可能是OSS采样和插管采样获得的瘤胃液成分差异的一个可能原因。研究发现，唾液中的钠（Na）和磷（P）含量高于瘤胃液，而钾（K）含量较低（Bailey，1961年）。因此，在我们的实验中，0830小时和1330小时时OSS样本中的瘤胃液钠含量较高，而1330小时时钾含量较低，这表明OSS样本可能被唾液稀释了。这种稀释也解释了OSS样本中的镁（Mg）含量低于插管采样样本，以及1330小时时钙（Ca）含量的相似变化。这一结果更加合理，因为我们的实验中观察到的瘤胃液中的钙和镁水平高于哺乳动物唾液中的水平（McDougall，1948年；Riad等人，1987年；Dua和Care，1998年）。我们的结果还证实，如其他研究者所观察到的，餐后采样时唾液污染更为严重（Muizelaar等人，2020年）。

一个反复出现的问题是如何在OSS采样过程中减少唾液污染。根据对插管牛的观察，可以假设在OSS采样期间唾液分泌可能会增加。这种唾液可能在探针通过食道以及通过瘤胃最背侧层（特别是咀嚼时被大量唾液浸润的瘤胃腔）的过程中污染样本（Shen等人，2012年）。有建议称，通过丢弃最初收集的150毫升以上唾液可以减少探针通过食道和瘤胃腔时的唾液污染（Geishauser和Gitzel，1996年；Duffield等人，2004年；Shen等人，2012年），正如我们在本研究中所做的那样。然而，只有当最终采样位置位于瘤胃较深处而非瘤胃腔时，这种方法才有效。这需要确保探针插入足够深以到达瘤胃腹侧囊（Shen等人，2012年）。尽管我们小心地丢弃了最初采集的500毫升样本，并在初步测试中确认探针到达了瘤胃腹侧囊，但仍无法避免唾液污染。由于我们不想在采样过程中使用插管来检查探针位置，因此唯一增加探针通过瘤胃腔机会的方法是通过在类似瘘管牛身上做标记来确保插管长度为200厘米。

一个值得探讨的问题是，OSS采样是否可以作为替代方法，用于在没有瘘管动物的情况下获取代表性的瘤胃液样本，以评估酸生成饮食对哺乳期奶牛瘤胃成分日变化或周变化的影响。从瘤胃腹侧囊采样可以被视为研究瘤胃动态的基准方法，因为它较少受到与摄入和咀嚼相关的唾液瞬时污染的影响（Shen等人，2012年）。对于我们测量的所有参数，我们观察到OSS采样和插管采样在瘤胃腹侧囊获得的测量结果之间存在强相关性，相关系数接近1（Geishauser和Gitzel，1996年），同时pH值和VFAs浓度存在不可忽视但固定的偏差。这与所有参数的周期效应相似，无论采用何种采样方法都是一致的。这表明，尽管我们知道OSS获得的数值在绝对意义上并不完全具有代表性，但OSS采样仍可以用来比较相对差异。然而，我们的回归曲线也清楚地显示，OSS采样在pH值和VFAs浓度方面的预测性较差。对于这两个参数，如果考虑采样时间内的关系，OSS采样的预测值甚至更低。其他研究者也得出了相同的结论（Duffield等人，2004年）。这表明，对于pH值的大范围变化，OSS采样的分析预测性是有保证的，但与插管采样相比，OSS采样的平均预测误差约为pH值0.8，VFAs浓度36 mmol/L。另一方面，值得注意的是，即使在采样时间内，VFAs摩尔分数的预测也基本令人满意。我们的结果还表明，相同的统计设计在区分瘤胃pH值和VFAs浓度的周期效应方面，OSS采样的能力低于插管采样，这意味着为了获得与插管采样相似的统计功效，需要使用更多动物进行OSS采样。如果感兴趣的变量是VFAs的摩尔比例，情况可能有所不同。

令人惊讶的是，我们没有观察到OSS采样与插管采样相比氨（NH3）系统性稀释的差异。我们对此没有明确的解释。然而，鉴于我们实验中两种饮食之间的瘤胃蛋白质平衡变化有限（INRA，2018年），第二阶段酸生成饮食导致氨浓度下降的情况与同VFA组的比较结果一致（Golder等人，2023年）。我们的结果以及其他出版物的结果都表明，尽管我们尽力遵循建议（Muizelaar等人，2020年），但仍难以通过OSS获得完全具有代表性的瘤胃液样本。我们的结果还表明，动物的适应情况（例如通过医疗训练）也可能是一个需要考虑的因素。实际上，我们观察到餐后（即OSS采样最可能导致唾液稀释的时候），实验结束时这种稀释作用可能有所减弱，从瘤胃液的钾和钙含量可以看出。我们还观察到瘤胃液中镁和钠含量的数值变化，尽管由于盐块可能带来的污染来源，我们对钠的结果仍需谨慎。总体而言，操作者发现OSS比插管采样对动物的干扰更大。OSS对某些行为指标（Silberberg等人，2015年）和食道损伤的影响也需要进一步量化。在我们的实验中，我们将OSS采样的频率限制为每周两次。了解在经过医疗训练的动物中这一频率是否可以增加也将是有用的。正如我们之前所见，另一个关键点是确定探针的插入深度（Shen等人，2012年；Muizelaar等人，2020年），特别是考虑到瘤胃内容物的质地对探针穿透瘤胃的影响（Larsen等人，2020年）。在未来，如果没有瘘管动物，这一操作可能会变得复杂，因此需要确定动物体型与这一参数之间的关系，以改进该方法。本实验使用的实验设计还揭示了OSS在量化酸生成条件对微生物群影响方面的作用（Dunière等人，2025年），以及OSS在气体测试发酵剂接种物质量方面的作用（Niderkorn等人，2025年）。

我们的结果表明，OSS采样是量化VFAs摩尔比例的一个可行替代方法，尽管需要考虑唾液稀释引起的随机变化。然而，由于OSS采样的平均预测误差约为pH值0.8，VFAs浓度36 mmol/L，我们在采样时间内观察到OSS采样的分析预测性太弱，无法与插管采样相比区分酸生成条件和对照条件。我们的结果还表明，OSS的程序和建议仍需改进，特别是需要明确探针插入深度的建议，并考虑使用经过训练的动物。

伦理批准：所有程序均符合欧盟关于实验动物的法律和ARRIVE指南。实验设计和实验程序获得了区域伦理委员会和法国研究部的批准，批准号为APAFiS #26894-2020081715322100_v2。

资金来源：本研究得到了INRAE动物生理学和畜牧系统部门以及ADISSEO、CARGILL、CMI-ROULLIER、LALLEMAND、MG2MIX、PHILEO-LESAFFRE、PROVIMI公司的支持。

关于动物研究的声明：本研究在法国INRAE乳品营养与生理学研究所（IE PL，35650 Le Rheu，https://doi.org/10.15454/yk9q-pf68，协议L2018）进行，时间为2020年1月4日至3月26日。实验设计和实验程序获得了区域伦理委员会和法国研究部的批准，批准号为APAFiS #26894-2020081715322100_v2。

作者贡献声明：
Anne Boudon：撰写——初稿、监督、数据管理、概念化。
Dimitri Kwiatkowski：可视化、调查、数据管理。
Vincent Niderkorn：撰写——审稿与编辑、概念化。
Evelyne Forano：撰写——审稿与编辑、概念化。
Pierre Nozière：撰写——审稿与编辑、项目管理、概念化。
Mathieu Silberberg：撰写——初稿、数据管理、概念化。