白鼬（Vulpes lagopus）睾丸类固醇生成的芦丁剂量效应非单调性：通过整合转录组学和代谢组学分析揭示的机制

《Veterinary and Animal Science》：The non-monotonic dose-effect of resveratrol on testicular steroidogenesis in male arctic foxes (Vulpes lagopus): Mechanisms revealed by integrated transcriptomic and metabolomic analyses

　　林敏|段福文|刘子健|田宇|吴敏|魏公清
吉林农业大学动物科学技术学院，长春，130118，中国

**摘要**
北极狐是一种因其珍贵的毛皮而被广泛养殖的哺乳动物，其养殖产业在全球范围内已得到大规模发展。然而，当前的北极狐养殖仍面临诸如繁殖效率等挑战，这些挑战阻碍了该产业的可持续发展。白藜芦醇是一种天然多酚化合物，存在于葡萄和日本虎杖等植物中。由于其强大的抗氧化和抗炎特性，它受到了广泛关注，并已被证明可以通过调节类固醇激素合成途径对哺乳动物的繁殖产生保护作用。在本实验中，40只狐狸被分为四组，分别喂食含有0、10、50或100毫克/千克白藜芦醇的饲料，持续两个月。结果显示，血清中的睾酮和黄体生成素水平表现出非单调的剂量-反应关系，在50毫克/千克组达到峰值。综合转录组学和代谢组学分析表明，低剂量可能由于通路激活不足而无效；中等剂量可能通过上调HSD3B和CYP11A1等关键类固醇生成基因来促进睾酮合成；而高剂量则可能因反馈抑制和代谢加速而效果有限。

**结论**：适量白藜芦醇可以通过调节类固醇生成网络最有效地增强睾酮合成，为将其作为饲料添加剂用于繁殖管理提供了依据。

**1. 引言**
北极狐（Vulpes lagopus）作为一种具有价值的毛皮动物，由于其浓密的底毛、优雅的毛色和出色的保温性能，在国内毛皮产业中占据重要地位（Liu等人，2025年）。其养殖产业的健康发展对于满足市场需求和促进专门化经济的发展具有重要意义。然而，养殖北极狐的最终经济效益不仅取决于毛皮质量，还与种群的繁殖效率密切相关。在繁殖过程中，雄性狐狸的繁殖能力起着决定性作用。研究表明，雄性狐狸的年龄与其繁殖表现密切相关，通常2岁的雄性狐狸具有最佳的交配表现（Wang & Hua，2007年）。雄性狐狸的繁殖能力从根本上取决于其睾丸的发育状态和生理功能（Sun等人，2001年）。健康的睾丸对于维持正常的雄激素分泌和高效的精子生成至关重要（Xiao等人，2024年），直接影响精液质量和雄性狐狸的繁殖价值。然而，目前关于北极狐睾丸生物学和营养调节机制的专门研究仍然有限。现有文献主要集中在雌性狐狸的繁殖管理上，导致缺乏针对雄性狐狸的精确营养策略的理论支持。

白藜芦醇作为一种天然多酚化合物，已被证明作为饲料添加剂能够改善动物的生长表现、抗氧化状态和繁殖潜力（Wei和Zuo，2025年；Xue等人，2025年；Zheng，2025年）。例如，对公猪的研究表明，饮食中添加白藜芦醇可显著增加血清中的促卵泡激素（FSH）、黄体生成素（LH）和睾酮水平，有效提高精液体积、精子密度和活力，同时降低氧化应激和炎症标志物（Guo等人，2024年）。其作用机制与调节睾丸蛋白质表达和减轻氧化损伤密切相关。此外，研究发现白藜芦醇可以通过抑制睾丸莱迪希细胞中的AGEs-RAGE信号通路，有效缓解热应激引起的睾丸功能障碍，并改善夏季精液质量（Peng等人，2025年）。在小动物模型中，饮食中添加白藜芦醇可增加睾丸指数和精液质量，减轻睾丸氧化损伤，降低线粒体损伤和顶体异常（Li等人，2021年；Luo等人，2020年；Meydanli等人，2018年；Zhang等人，2018年）。它还通过抑制衰老莱迪希细胞中的自噬水平和线粒体功能下降，增强睾丸睾酮分泌并缓解异常精子生成（Abdelali等人，2016年；Lin，2021年）。此外，该化合物还对化学毒素引起的大鼠精子生成功能障碍具有明显的治疗效果，其机制涉及抑制生殖细胞凋亡和促进生精上皮修复（Jiang等人，2007年）。2022年发表的一篇综述系统总结了白藜芦醇对哺乳动物雄性生殖系统的有益作用，并明确指出了其作为新型功能性饲料添加剂的开发前景（Shao等人，2022年）。然而，当前研究中存在一个关键的学术争议：白藜芦醇的效果并不总是与剂量简单正相关。在脑缺血-再灌注损伤的大鼠模型和冠状动脉粥样硬化的小鼠模型中，白藜芦醇以剂量依赖的方式改善了神经功能，减少了脑梗死体积，降低了血脂，并具有抗动脉粥样硬化作用（Zhang等人，2017年；Zhu等人，2019年）。需要注意的是，这两项研究中检查的剂量范围都在白藜芦醇的安全低剂量范围内。Zhu等人使用的最高剂量为150毫克/千克·天，远低于已知的无观察到的不良反应水平200毫克/千克/天（Johnson等人，2011年），且未达到可能导致毒性、代谢饱和或效果平台期的更高剂量。因此，观察到的“正相关”是否可以推广到更高剂量范围尚不清楚。相比之下，对于产蛋鸡，中等剂量的白藜芦醇最能有效改善产蛋性能、蛋质量和繁殖激素水平（Ju等人，2025年）；同样，在育肥猪中，中等剂量组在生长表现、抗氧化功能和经济效益方面显示出最显著的改善（Liu，2025年）。尽管上述两项研究都发现了非单调的剂量-反应关系（中等剂量最佳），但仅限于描述表型指标，未进行深入的分子分析来解释这一现象的原因。在脂质代谢调节方面，Song等人（2023年）报告称，饮食中添加600毫克/千克的白藜芦醇通过PI3K-AKT途径促进了山羊的肌肉脂肪沉积；另一方面，在体外发现40微摩尔/升的白藜芦醇抑制了小鼠3T3-F442A前脂肪细胞的增殖和脂肪生成。值得注意的是，这两部分实验仅检查了一个剂量水平（山羊体内仅600毫克/千克，体外仅40微摩尔/升），没有设置剂量梯度。因此，这项研究只能证明不同剂量的白藜芦醇在不同系统中产生不同的效果，但不能得出关于剂量-反应关系或“双向调节”的任何结论。上述矛盾的效果与剂量、物种和靶组织的差异密切相关，突显了白藜芦醇作用机制的复杂性以及现有证据在剂量系统化和机制深度方面的不足。

基于上述背景，本研究旨在通过喂养试验系统地研究饮食中添加白藜芦醇对雄性北极狐睾丸功能的影响，特别关注从睾酮合成调节的角度阐明潜在的分子机制。本研究确立了两个核心目标：首先，通过设置低、中、高浓度梯度，明确白藜芦醇在雄性北极狐中的剂量-效应关系，从而确定改善繁殖表现的最佳剂量；其次，利用多组学技术深入探索白藜芦醇影响睾酮合成途径的机制。为此，本研究将整合转录组学和代谢组学分析。这种方法有望系统地揭示白藜芦醇在雄性北极狐中调节睾酮合成的分子网络，为其在该物种的高效养殖中的科学应用提供坚实的理论基础。

**2. 材料与方法**
2.1. 动物和实验设计
采用单因素多剂量设计来评估白藜芦醇对北极狐睾丸功能的影响。从哈尔滨华龙饲料发展有限公司（中国哈尔滨）获得了40只健康、7个月大的雄性狐狸，这些狐狸体型均匀且没有明显异常（如单侧隐睾）。动物被随机分为四组，每组10只：对照组（GDZZ，0毫克/千克白藜芦醇饲料）、低剂量组（GM1，10毫克/千克）、中等剂量组（GM2，50毫克/千克）和高剂量组（GM3，100毫克/千克）。白藜芦醇（纯度≥99%）由西安泽邦生物技术有限公司（中国西安）提供。所有狐狸单独饲养在户外的笼子里。每天上午9点喂食一次，喂食过程在大约两小时内完成；其他时间无人接近笼子。经过十天的适应期后开始补充白藜芦醇。该化合物与基础饲料一起单独加入每只动物的饲料槽中，以确保准确的剂量传递。试验期间任何出现异常迹象的狐狸都会立即被隔离并单独处理。

2.2. 样本收集与处理
达到性成熟后，狐狸从饲养区转移到屠宰区。使用促凝管通过后肢静脉方法收集血液样本（总共约10毫升）。立即离心后，血清样本暂时储存在干冰上。然后通过电击方式人道地安乐死狐狸（Korhonen等人，2009年），并收集和保存两个睾丸于干冰上。所有样本随后转移到-80°C的冷冻柜中长期储存。每组选取6只狐狸进行样本分析。

2.3. 激素检测
储存在-80°C的血清样本在4°C下解冻，使用酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒检测睾酮（T）、促卵泡激素（FSH）和黄体生成素（LH）（上海朗顿生物技术有限公司，中国）。所有检测严格按照制造商的说明进行。吸光度使用微孔板读取器测量，激素浓度基于标准校准品拟合的逻辑曲线计算。

2.4. 转录组测序与分析
使用Trizol试剂（Invitrogen Life Technologies）从睾丸组织中提取总RNA。使用NanoDrop光谱仪（Thermo Scientific）评估RNA浓度、纯度和完整性。每个样本提取3微克总RNA构建测序文库。在Illumina NovaSeq 6000平台上进行双端测序。原始测序数据经过过滤以获得干净的读段，然后与北极狐参考基因组对齐。基因表达水平基于对齐结果进行量化。下游分析包括差异表达分析、功能富集分析和基因集富集分析（GSEA），在Paisenor Gene Cloud平台上进行。

2.5. 非靶向代谢组学分析
使用有机溶剂系统（甲醇/乙腈/水）的液-液萃取方法从血清中提取代谢物。数据采集在Thermo Orbitrap Exploris 120质谱仪上进行，由Xcalibur软件（版本4.7，Thermo Scientific）控制，采用数据依赖性采集（DDA）模式。原始数据转换为.mzXML格式，使用ProteoWizard进行处理，包括峰对齐、保留时间校正和峰面积提取。在质量评估和统计分析之前进行代谢物鉴定和数据预处理。通过将保留时间、质量（质量误差<10 ppm）、MS/MS碎片谱、碰撞能量等信息与数据库匹配，对生物样本中的代谢物进行结构鉴定。鉴定结果随后严格手动重新检查并确认，达到2级或更高的鉴定水平。

2.6. 数据整合与统计分析
激素数据使用ELISAcalc和逻辑回归模型进行分析。转录组和代谢组数据集在Paisenor Gene Cloud平台上进行分析和可视化，包括差异分析、功能富集、GSEA和整合多组学相关性分析。除非另有说明，统计显著性设置为p < 0.05。

**3. 结果**
3.1. 黄体生成素（LH）、睾酮（T）和促卵泡激素（FSH）的水平
黄体生成素（LH）和睾酮（T）水平的变化趋势高度一致：中等剂量组的激素水平显著高于低剂量组、高剂量组和对照组（图1）。

**图1. 实验组和对照组的激素水平。**
GDZZ，对照组（0毫克/千克白藜芦醇）；GM1，低剂量组（10毫克/千克白藜芦醇）；GM2，中等剂量组（50毫克/千克白藜芦醇）；GM3，高剂量组（100毫克/千克白藜芦醇）。
蓝色条形代表黄体生成素（LH，单位mIU/mL），红色条形代表睾酮（T，单位nmol/L），绿色条形代表促卵泡激素（FSH，单位mIU/mL）。数据以平均值±标准误差（SEM）表示。不同的小写字母表示显著差异（P < 0.05），不同的大写字母表示高度显著差异（P < 0.01），相同的字母表示无显著差异（P > 0.05）。3.2. 转录组学结果所有睾丸组织样本都在Illumina平台上进行了测序。原始图像文件通过平台内置软件转换为FASTQ格式的原始数据。如表1所示，所有样本的数据质量指标都非常优秀。具体来说，平均Q20和Q30值分别超过了99%和97%，而Clean Reads（%）和Clean Data（%）均高于99.7%。这些结果表明测序数据非常可靠和准确，完全满足后续生物信息学分析的严格要求。表1. 测序数据质量评估表。样本GM1GM2GM3GDZZRaw Reads No49974662 ± 286201557242761 ± 433150146517385 ± 402900047280633 ± 3697000Clean Reads No49956492 ± 286213357218286 ± 433012746499313 ± 402300047259624 ± 3686000Raw Bases (bp)7496199300 ± 4293000008586414200 ± 6497250006977607800 ± 6038000007092094900 ± 553600000Clean Data (bp)7479165912 ± 4282000008566234900 ± 6487000006960110300 ± 6018000007073133371 ± 552000000Q30 (bp)7309399672 ± 4104000008408549906 ± 6363000006828519234 ± 5844000006942702728 ± 542600000GC (%)47.86 ± 0.1648.0033 ± 0.006747.83 ± 0.1148.34 ± 0.13Q20 (%)99.310 ± 0.02999.4267 ± 0.003399.413 ± 0.02799.4133 ± 0.0088Q30 (%)97.52 ± 0.1197.93 ± 0.0197.88 ± 0.1097.890 ± 0.032Clean Reads (%)99.9633 ± 0.003399.96 ± 0.003399.9633 ± 0.003399.9567 ± 0.0033Clean Data (%)99.7733 ± 0.003399.7633 ± 0.008899.7533 ± 0.008899.7333 ± 0.0033表注：样本：样本名称；Raw_Read_No：总读取次数；Clean Read No：高质量序列读取次数；Raw_Bases(bp)：总碱基数；Clean Data(bp)：高质量序列碱基数；Q30(bp)：碱基识别准确率≥99.9%的碱基数百分比；GC(%): GC含量；Q20(%): 碱基识别准确率≥99%的碱基数百分比；Q30(%): 碱基识别准确率≥99.9%的碱基数百分比；Clean Reads(%): 高质量序列读取次数占总读取次数的百分比；Clean Data(%): 高质量序列碱基数占总碱基数的百分比。睾丸转录组数据的差异表达分析结果显示在图2中。与对照组（GDZZ）相比，低剂量（GM1）、中剂量（GM2）和高剂量（GM3）组分别有216、770和364个差异表达基因（DEGs）。值得注意的是，DEGs的数量并非随着剂量的增加而单调增加，而是在中剂量时达到峰值，然后在高剂量时显著下降。下载：下载高分辨率图像（127KB）下载：下载全尺寸图像图2. 差异表达基因UpSet图。顶部面板中的每个垂直条形（每组中的数字）表示单次比较（处理组与对照组）中识别的差异基因总数。底部矩阵中的连接点表示多次比较之间的交集，相应的垂直条形（每个交集的数字）显示这些组中共享的差异基因数量。矩阵中的单个点表示该组的独特差异基因，而连接多个点的线表示连接组之间的共同差异基因。差异基因的筛选标准为p < 0.05和|log?(fold change)| > 1。组别包括：低剂量（GM1，10 mg/kg白藜芦醇），中剂量（GM2，50 mg/kg白藜芦醇），高剂量（GM3，100 mg/kg白藜芦醇）和对照组（GDZZ，0 mg/kg白藜芦醇）。3.3. 代谢组学结果通过叠加所有质量控制（QC）样本的总离子色谱图（TICs）确认了LC-MS/MS分析的稳定性。如图3所示，所有样本的色谱峰紧密重叠，表明仪器性能稳定，代谢物提取和分析在整个实验过程中具有高重复性。下载：下载高分辨率图像（215KB）下载：下载全尺寸图像图3. 质量控制（QC）和代表性实验样本的总离子色谱图（TICs）的叠加图。水平轴表示每个色谱峰的保留时间，垂直轴表示峰强度。对睾丸组织进行的非靶向代谢组学分析表明，不同剂量的白藜芦醇显著改变了代谢谱（图4）。与对照组（GDZZ）相比，低剂量（GM1）、中剂量（GM2）和高剂量（GM3）组分别有457、459和485个差异丰富的代谢物。差异代谢物的总数随着剂量的增加而增加。下载：下载高分辨率图像（136KB）下载：下载全尺寸图像图4. 差异代谢物UpSet图。顶部面板中的每个垂直条形（每组中的数字）表示单次比较（处理组与对照组）中识别的差异代谢物总数。底部矩阵中的连接点表示多次比较之间的交集，相应的垂直条形（每个交集的数字）显示这些组中共享的差异代谢物数量。矩阵中的单个点表示该组的独特差异代谢物，而连接多个点的线表示连接组之间的共同差异代谢物。差异代谢物的筛选标准为p < 0.05和倍数变化| > 1。组别包括：低剂量（GM1，10 mg/kg白藜芦醇），中剂量（GM2，50 mg/kg白藜芦醇），高剂量（GM3，100 mg/kg白藜芦醇）和对照组（GDZZ，0 mg/kg白藜芦醇）。3.4. GDZZ和GM2之间的转录组学和代谢组学数据的综合分析对GDZZ和GM2组进行了KEGG通路共富集分析（图5）。确定了11条关键通路，其功能主要可以分为四个方面：类固醇激素合成（醛固酮合成和分泌、皮质醇合成和分泌、胆固醇代谢和库欣综合征）、免疫特权（非洲锥虫病和胆汁分泌）、抗氧化应激反应（谷胱甘肽代谢、牛磺酸和低牛磺酸代谢以及甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢）以及神经内分泌调节（谷氨酸能突触和苯丙氨酸代谢）。下载：下载高分辨率图像（238KB）下载：下载全尺寸图像图5. GDZZ与GM2的共富集通路图。水平轴表示转录组和代谢组共有的代谢通路名称，垂直轴表示两种组学的富集分析的p-log10（p值）值。棕色条形代表代谢组，红色条形代表转录组，红色虚线表示p=0.05的位置。虚线以上的结果是p值小于0.05的通路。3.5. 睾酮合成和代谢中的关键通路和基因相关性分析表明睾丸组织中的局部类固醇代谢通路发生了变化，同时睾酮水平显著升高。为了探索系统层面的潜在机制，我们对KEGG通路“类固醇激素生物合成”进行了基因集富集分析（GSEA），该通路涵盖了完整的类固醇激素合成过程。结果显示，这条通路在所有白藜芦醇处理组中都表现出显著的富集，且富集分数随着处理浓度的增加而逐渐增加（图6）。进一步分析确定了驱动这条通路富集的核心基因（表2），包括：CYP11A1，这是类固醇合成中的限速酶，负责催化胆固醇转化为孕烯醇酮；睾酮合成通路中的关键酶HSD3B和CYP17A1；以及参与睾酮葡萄糖醛酸化代谢的关键酶UGT2A3和UGT2B31。CYP11A1和UGT2A3在GM2和GM3组中均显著上调，并被确定为核心富集基因。HSD3B在所有实验组中均显著上调并为核心富集基因。尽管UGT2B31和CYP19A1在所有组中的表达变化没有统计学意义，但UGT2B31始终被确定为核心富集基因，而CYP19A1表现出下降趋势。下载：下载高分辨率图像（402KB）下载：下载全尺寸图像图6. 睾酮生物合成通路的GSEA富集图。GSEA图由三个面板组成：（顶部）富集分数（ES）的分布曲线，其中最远离零点的峰值表示基因集的ES值；（中间）垂直线标记排名列表中的基因位置，每条线代表一个单独的基因；（底部）所有基因的总体排名分布，红色和蓝色区域分别表示处理组和对照组中上调的基因。表2. 睾酮合成和代谢通路中核心基因的富集和表达细节。基因符号处理log?FCP值调节RANK METRIC SCORE运行ES富集分数CYP11A1GM10.29P < 0.001ns0.29270.4397否GM21.43P < 0.001上调1.42850.4380是GM32.08P < 0.001上调2.08030.2251是HSD3BGM11.18P < 0.001上调1.17570.3036是GM21.85P < 0.001上调1.84970.4186是GM33.34P < 0.001上调3.33600.0908是CYP17A1GM1-0.020.4505ns-0.01990.1290否GM20.91P < 0.001ns0.90690.4843是GM31.56P < 0.001上调1.56100.5013是UGT2A3GM10.040.9547ns0.03710.2332否GM24.57P < 0.001上调4.56600.2476是GM31.70P < 0.001上调1.70170.4168是UGT2B31GM11.050.4083ns1.05120.3400是GM21.120.3528ns1.12130.4765是GM31.760.1172ns1.75720.3715是CYP19A1GM1-0.160.1535ns-0.1588-0.1081否GM2-0.55P < 0.001ns-0.5517-0.0977否GM3-0.64P < 0.001ns-0.6360-0.0289否注释：GM1：低剂量组（10 mg/kg白藜芦醇）；GM2：中剂量组（50 mg/kg白藜芦醇）；GM3：高剂量组（100 mg/kg白藜芦醇）；处理：实验处理组；log?FC：log?变换倍数变化；P值：显著性概率；调节：表达调节趋势，|log?FC| ≥ 1且P < 0.01的基因定义为差异表达基因，“up”表示显著上调，“ns”表示无显著差异；RANK METRIC SCORE：排名指标分数；运行ES：运行富集分数；核心富集：基因是否被确定为核心富集基因（“是”或“否”）。3.6. 睾酮合成和代谢中的关键代谢物代谢组学结果显示在图7中。从对照组到高剂量组，睾酮上游前体——孕烯醇酮、17α-羟基孕烯醇酮和雄烯二酮的水平逐渐增加，在高剂量组达到峰值。睾酮下游代谢物5β-二氢睾酮的水平在中剂量组和高剂量组显著高于对照组，但在高剂量组中的含量显著低于中剂量组。睾酮葡萄糖醛酸酯的水平从对照组到高剂量组逐渐增加，在高剂量组达到峰值。Cortodoxone的水平在中剂量组最高，在高剂量组略低，但仍高于对照组。此外，虽然仅在GM2中观察到雌酮水平的显著增加，但在三个剂量组中都显示出整体上升趋势。下载：下载高分辨率图像（474KB）下载：下载全尺寸图像图7. 睾酮相关代谢物含量条形图。基于睾丸组织的非靶向代谢组学数据，它显示了不同处理组中睾酮合成通路中关键物质的相对丰度。GDZZ，对照组（0 mg/kg白藜芦醇）；GM1，低剂量组（10 mg/kg白藜芦醇）；GM2，中剂量组（50 mg/kg白藜芦醇）；GM3，高剂量组（100 mg/kg白藜芦醇）。数据以平均值±SEM表示。不同的小写字母表示显著差异（P < 0.05），不同的大写字母表示高度显著差异（P < 0.01），相同的字母表示无显著差异（P > 0.05）。4. 讨论本研究首次综合分析了不同浓度膳食白藜芦醇对雄性北极狐（Vulpes lagopus）睾酮产生的影响。结果表明，血清睾酮（T）水平在中剂量组（GM2；50 mg/kg）达到峰值，而低剂量组（GM1；10 mg/kg）和高剂量组（GM3；100 mg/kg）的结果不佳。睾酮生物合成通过两条主要通路进行。Δ5通路如下：胆固醇 ? (CYP11A1) → 孕烯醇酮(Δ?) ? (CYP17A1) → 17α-羟基孕烯醇酮(Δ?) ? (CYP17A1) → 雄烯二酮(Δ?) ? (HSD3B) → 睾酮(Δ?)。Δ4通路如下：胆固醇 ? (CYP11A1) → 孕烯醇酮(Δ?) ? (HSD3B) → 孕酮(Δ?) ? (CYP17A1) → 17α-羟基孕酮(Δ?) ? (CYP17A1) → 睾酮(Δ?) (Conley & Bird, 1997; Hall et al., 1969; Zirkin & Papadopoulos, 2018)。低剂量组（GM1；10 mg/kg）：睾酮（T）水平与对照组（GDZZ；0 mg/kg）无显著差异。转录组分析显示，低剂量处理选择性地上调了类固醇生成通路中的HSD3B基因，而位于通路起始点和关键分支点的两个关键限速酶CYP11A1和CYP17A1的表达没有显著变化（表2）。在睾酮合成的Δ4通路中，CYP11A1催化胆固醇初步转化为孕烯醇酮，而HSD3B催化孕烯醇酮进一步转化为孕酮（Ye et al., 2011）。值得注意的是，尽管CYP11A1的表达没有变化，但孕烯醇酮的水平显著升高（图7）。Miller等人（2011）在《内分泌评论》中的综述中讨论了类固醇生成的复杂性，指出类固醇激素可以通过多种代谢途径合成——这与观察到的孕烯醇酮积累现象一致。总体而言，这些观察结果与低剂量下底物供应不足可能是整体通路通量的限制因素这一可能性一致，这与Payne和Hales提出的概念相符，即类固醇生成途径的总输出受到最慢步骤的限制（Payne & Hales, 2004）。需要注意的是，这种解释是基于基因表达的相关变化，未来需要直接测量酶活性和代谢流的研究来验证这些结果。

**中等剂量组（GM2；50 mg/kg）：**该处理与睾酮水平的显著升高相关，睾酮水平达到了峰值（图1）。转录组分析显示，与低剂量相比，中等剂量不仅持续上调了HSD3B的表达，还显著上调了编码初始限速酶的CYP11A1的表达（表2）。然而，CYP17A1的表达保持不变（表2）。先前的研究表明，CYP17A1的活性在决定代谢流是朝向雄激素合成还是皮质醇合成方面起着关键作用（Lee等人，2023；Yoshimoto & Auchus，2015）。在本研究中，CYP17A1表达未上调与17α-羟基孕酮和皮质酮水平的升高有关。根据已知的代谢途径，17α-羟基孕酮可以通过CYP21A2转化为皮质酮（Loke等人，2021），而皮质酮可以进一步代谢为皮质醇（Knuechel等人，2024）。我们的代谢组学分析显示中等剂量组的皮质酮水平显著增加。此外，整合的转录组学和代谢组学关联分析显示与“皮质醇合成和分泌”及“库欣综合征”相关的通路显著富集（图5）。这些结果与部分类固醇生成代谢流可能转向肾上腺皮质类固醇合成的情况一致。同时，参与激素失活的UGT2A3基因的表达显著上调。其潜在反应产物5β-二氢睾酮（Swerdloff等人，2017）和睾酮葡萄糖醛酸苷的水平也显著升高（图7）。UGT酶家族通过催化类固醇激素的葡萄糖醛酸化来促进其排泄（Chouinard等人，2006；Dang等人，2016；Meech等人，2019）。这些观察结果与睾酮代谢清除的激活状态相关。综合来看，这些发现支持这样的假设：在中等剂量的白藜芦醇处理下，可能存在一个短暂的“合成优势”——即合成速率相对超过清除速率——这与观察到的睾酮峰值方向一致。维持这种动态平衡的具体调控节点需要通过基于示踪剂的代谢流实验进一步研究。

**高剂量组（GM3；100 mg/kg）：**转录组分析显示CYP11A1、HSD3B和CYP17A1基因的表达上调。尽管有这种全局激活，但睾酮水平从中等剂量组的峰值下降，并且与对照组（GDZZ；0 mg/kg）没有显著差异（图1）。代谢组学分析表明，GM3组的雄烯二酮水平在所有处理组中最高（图7）。转录组数据显示促进雄烯二酮合成的关键基因（CYP11A1、HSD3B）表达上调（表2），而负责将雄烯二酮转化为睾酮的HSD17B3（17β-羟基类固醇脱氢酶类型3）未检测到上调（Chen，2020；Gon?alves等人，2022；Lawrence等人，2022）。这种“合成增强但转化受阻”的分子模式与观察到的雄烯二酮积累一致。一项关于恒河猴睾丸激素调节的体外研究表明，塞托利细胞可以将雄烯二酮转化为雌二醇（Wang等人，2002）。Baddela等人（2020；Vrta?nik等人，2014；Moutard等人，2023）的研究表明，过量的雄烯二酮可以通过芳香化转化为雌激素。根据类固醇代谢途径，CYP19A1催化雄烯二酮转化为雌酮。在本研究中，CYP19A1的表达呈下降趋势（不显著）（表2），而雌酮水平呈上升趋势（不显著）（表3），这可能与雄烯二酮的积累有关。雌酮可以进一步转化为更具活性的雌二醇（Andersson & Moghrabi，1997）。据报道，白藜芦醇具有类似雌激素的作用（Qasem，2020）。内源性雌激素（雌酮、雌二醇）和外源性白藜芦醇的共同存在会触发经典的内分泌负反馈：当雌激素活性超过某个阈值时，它可以抑制垂体LH的分泌，使LH水平恢复到稳态范围（Christian等人，2008；Li等人，2020；Liu，2020；Maeda等人，1996；Oduwole等人，2021；Shaw等人，2010）。本研究的激素测量结果显示，中等剂量组的LH水平显著高于对照组，而高剂量组的LH水平显著下降，回到对照组水平，这与预期的负反馈调节一致。同时，高剂量组的雌酮水平呈非显著上升趋势，睾酮水平下降，这也与负反馈下的睾酮抑制相关（Wu等人，2021）。此外，转录组数据表明，高剂量组的UGT2A3表达低于中等剂量组但高于对照组，而睾酮葡萄糖醛酸苷的水平在所有处理组中最高（图7），这与睾酮结合和代谢的持续活跃状态一致。总之，高剂量白藜芦醇处理与以下同时观察到的现象相关：雄烯二酮积累、HSD17B3未上调、雌酮水平非显著增加伴随CYP19A1的非显著下调、LH负反馈模式（中等剂量时增加随后在高剂量时回到对照组水平），以及通过UGT2A3表达和睾酮葡萄糖醛酸苷水平反映的持续结合代谢。这些现象总体上与高剂量组观察到的睾酮净生成受限的方向一致。需要注意的是，上述相关观察基于整合的转录组学、代谢组学和激素水平分析；具体的因果关系（例如，代谢流的重新定向、负反馈的相对贡献以及内源性和外源性因素之间的真正协同作用）需要通过酶活性测定、代谢流追踪、垂体LH表达检测或受体阻断实验进一步验证。

**表3. 实验组中雌酮水平的变化。**

| 组别 | 平均值 | 对照组均值 | 对数2倍变化 | P值 | 调节状态 |
|-------|--------|---------|-----------|---------|
| GM1 | 170 | 266 | 89.82 ± 129 | 425.6 | 175 |
| | | 700 | 29.89 ± 293 | 29.6 | 0.0453 |
| | | 0 | 0.1971 | 无差异 |
| GM2 | 170 | 266 | 89.82 ± 129 | 425.6 | 181 |
| | | 935 | 33.36 ± 273 | 58.5 | 0.0889 |
| | | 0 | 0.0373 | 无差异 |
| GM3 | 170 | 266 | 89.82 ± 129 | 425.6 | 184 |
| | | 835 | 35.34 ± 412 | 960.5 | 0.0918 |
| | | 0 | 0.0980 | 无差异 |

**表注：**
- **均值**：对照组（0 mg/kg白藜芦醇）的平均基因表达值。
- **处理组**：每个处理组（GM1：10 mg/kg，GM2：50 mg/kg，GM3：100 mg/kg白藜芦醇）的平均基因表达值。
- **log2倍变化**：表示处理组相对于对照组的表达变化倍数。
- **P值**：差异表达的显著性p值。
- **调节状态**：“Up”表示显著上调（p值< 0.05且log2倍变化> 0），“无差异”表示无显著差异。

**5. 结论与展望**
本研究的发现表明，适当剂量的白藜芦醇（50 mg/kg）处理提高了雄性北极狐的睾酮水平，这与参与睾酮生物合成途径的关键基因（包括HSD3B和CYP11A1）的表达上调一致。基于相关性分析提出的关于高剂量白藜芦醇暴露下负反馈调节的假设，需要通过功能实验（如雌二醇测量、受体阻断测定、垂体LH表达检测或代谢流追踪）进一步验证。此外，仍需要系统和深入的研究来确定有效增强净睾酮生成的最佳剂量窗口，同时避免与库欣综合征相关的皮质醇合成途径的过度激活。

**伦理声明**
实验方案得到了吉林农业大学动物科学技术学院及其伦理委员会（20241022）的批准。

**关于写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明**
在准备本手稿期间，作者使用了DeepSeek进行英文翻译和语言润色。

**作者贡献声明**
MA Limin：撰写——原始草稿、方法学、形式分析、概念化。
Duan Fuwen：验证、调查、数据管理。
Liu Zijian：验证、方法学、调查。
Tian Yu：验证、调查、形式分析。
Wu Min：监督、资源管理、项目管理。
Wei Gongqing：撰写——审阅与编辑、监督、项目管理、资金获取。