迷你猪肌肉对寒冷胁迫的转录组响应特征

《Veterinary and Animal Science》：Transcriptome profile of Min pig muscle response to cold stress

　　王文涛|王亮|杨硕|刘迪|张东杰
黑龙江农业科学院畜牧研究所，中国哈尔滨学府路368号，150086

**摘要**
寒冷应激是畜禽养殖中常见的自然灾害。它抑制生长、免疫等生理功能，甚至可能导致死亡。尽管骨骼肌是猪在寒冷应激下的主要产热器官，但肌肉对寒冷应激反应的分子机制仍不清楚。为了了解参与寒冷应激反应的分子调控机制，利用第二代测序和生物信息学分析方法，比较了暴露于寒冷应激下的民猪（CS组）与对照组（RT组）骨骼肌的完整转录组谱。CS组中差异表达的mRNA、lncRNA、circRNA和miRNA分别为711个、179个、127个和32个。这些变化涉及多个生物学途径，包括蛋白酶体、蛋白质消化与吸收、神经系统以及免疫系统。同时，lncRNA、miRNA与mRNA之间的内源性竞争关系也发生了变化。研究发现了三个与囊泡运输、抗氧化应激和肌肉细胞功能调节相关的ceRNA网络。这些结果揭示了民猪肌肉在寒冷应激下的转录调控机制，为应对低温灾害和培育耐寒新品种提供了理论基础。

**引言**
寒冷应激在高海拔地区和寒冷区域的生物中普遍存在。动物在受到寒冷应激后，其内部环境的稳定性会发生变化，严重情况下会导致生物损伤（Cao等人，2022年）。机体会出现体温过低、认知障碍、肝脏损伤和心血管疾病等症状，从而导致死亡率增加（Kong等人，2020年；Liu等人，2022年；Yadav等人，2024年）。因此，寒冷应激对高海拔地区和寒冷区域的畜牧业构成了重大威胁。作为畜牧业的重要组成部分，猪比其他家畜和禽类更容易受到环境温度的影响，因为新生仔猪缺乏足够的脂肪储备来提供保温作用。此外，仔猪的体温调节中枢尚未完全发育，因此它们难以适应外部温度的变化（Zhang等人，2022年）。寒冷应激会增加猪的疾病发病率和死亡率，并降低肉质（Lesiow & Xiong，2024年）。

在中国，有一些本土猪品种，如民猪（Zhang等人，2022a）、马深猪（Li等人，2023）和藏猪（Yang等人，2023），由于长期生活在高海拔或寒冷地区而具备了耐寒性。民猪主要分布在中国的黑龙江省，该地区的年平均温度在-5°C至5°C之间，1月和12月会出现极低的温度（-20°C至-30°C）。民猪在半开放式户外棚舍中饲养，可以自由采食并正常生长，不会遭受冻伤。据Ai等人研究，民猪的耐寒特性可能源自一个已灭绝的猪属，这一基因杂交事件发生在数十万年前（Ai等人，2015年）。Lin等人发现，在民猪和藏猪中，UCP3可以部分替代UCP1的功能，诱导白色脂肪褐变，从而增加脂肪组织的能量代谢。根据UCP3的基因序列，猪可以分为耐寒和非耐寒品种（Lin等人，2017年）。此外，β3-肾上腺素受体（ADRB3）在民猪受到寒冷刺激时也能诱导白色脂肪褐变（Zhu等人，2024年）。Guo等人对民猪和恩施黑猪两种不同组织的表观遗传反应进行了多组学分析，发现民猪间脑区的H3K27ac信号发生显著变化，而脂肪组织中的变化较小（Guo等人，2024年）。慢性寒冷应激会导致大白猪的肠道黏膜损伤，补充适量的葡萄糖可以缓解这种损伤；但在民猪中则不会出现这种情况（Sun等人，2022年）。由于这些复杂的影响，民猪在寒冷应激下的精确分子机制尚不清楚。

棕色脂肪组织（BAT）、皮肤血流和骨骼肌是重要的产热器官（Mota & Madden，2024年）。鸟类和猪体内不存在BAT，因此对于这两种动物来说，肌肉的非颤抖产热（NST）比脂肪组织更为重要。肌肉作为产热器官的出现时间早于真核哺乳动物中的BAT（Bal & Periasamy，2020年）。普遍认为，肌浆/内质网Ca2+-ATP酶（SERCA）的解偶联作用（涉及sarcolipin（SLN）是骨骼肌NST的基础（Rowland等人，2015年）。Bardova等人提出，肌肉的NST可能是机体适应外部环境压力的结果（Bardova等人，2024年）。由于BAT中的肾上腺素能NST不足，骨骼肌的NST可能是适应性增强的（Janovska等人，2023年）。因此，我们假设猪骨骼肌在应对寒冷应激引起的环境压力中起着重要作用。在本研究中，一组民猪仔猪经历了3天、4°C的低温寒冷应激，另一组作为对照组处于25°C的正常温度下。基于实验组和对照组最长背肌的转录组测序结果，分析了差异表达的lncRNA、circRNA和miRNA以及相关的通路和相互作用关系，以确定猪肌肉对寒冷应激的转录反应。这些结果揭示了耐寒猪品种在寒冷应激下的肌肉转录组变化，为未来培育耐寒猪品种提供了理论支持。

**材料与方法**
2.1 **样本收集与制备**
选取6头体重相似（5.12 ± 0.46公斤）的30天龄雌性民猪仔猪，随机分为两组：对照组（25°C，n = 3）和寒冷应激组（4°C，n = 3）。提供充足的水和饲料。在25°C或4°C的呼吸代谢笼中饲养3天后（表S1），将猪宰杀。收集最长背肌并迅速冷冻在液氮（-196°C）中。使用Tritizol?试剂盒（ThermoFisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）提取每个样本的总RNA。使用Qubit RNA Assay Kit（ThermoFisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）测定总RNA含量，并用Ribo-Zero? Magnetic Kit（Epicentre，美国威斯康星州麦迪逊）去除rRNA。全转录组测序由Novogene Technology Co., Ltd.完成。

2.2 **寒冷应激后民猪肌肉中mRNA和lncRNA的分析**
根据以下标准筛选原始读段：含有接头序列的读段；未知核苷酸比例超过10%的读段；Qphred得分≤5且占总碱基比例超过50%的读段。将清洁后的读段与Sus scrofa（v11.1）基因组序列进行比对（使用HISAT2（v2.2.1））。使用StringTie（v1.3.3）组装比对后的读段并重建转录组。将组装的转录组与参考基因组的已知注释文件进行比较，过滤掉已知的mRNA和lncRNA，留下未知的转录组。使用多种编码潜力预测软件（CPC2（v3.2.0）、CNCI、CPAT和PFAM（v1.3）进行联合分析。只有所有软件均认定为“非编码”的转录组才被保留为新的mRNA和lncRNA。使用DESeq2（R-3.1.2）软件根据|log2FC| > 1和P < 0.05的标准筛选RT组和CS组之间差异表达的基因（DEGs）和lncRNA。通过其靶基因预测DE lncRNA的功能。位于lncRNA上游或下游100 kb区间内的基因定义为顺式调控靶基因。lncRNA与基因表达水平之间的Spearman相关系数大于0.9的基因定义为反式调控靶基因。

2.3 **寒冷应激后民猪肌肉中miRNA的分析**
从原始数据中去除3′接头和垃圾序列后，获得长度为18–25 nt的清洁读段。使用Bowtie（v2.0.6）将清洁读段与猪的参考基因组（v11.1）进行比对。使用DESeq2（R-3.1.2）进行标准化和差异分析，以识别RT组和CS组之间表达显著变化的miRNA。显著差异miRNA的阈值设定为|log2FC| > 1和P < 0.05。

2.4 **寒冷应激后民猪肌肉中circRNA的分析**
对离线测序数据进行质量控制，去除接头和各种低质量序列。使用Hisat2（v2.0.5）将清洁读段与猪的参考基因组进行比对。使用find_circ和CIRI2（v2.0.5）识别circRNA并构建circRNA参考序列。在使用find_circ识别circRNA时，首先从未与参考序列比对的读段两端提取20 nt的锚序列，然后再次将每对锚序列与参考序列比对。如果锚序列的5′端与参考序列对齐，且3′端位于该位置上游，并且两个序列之间存在剪接位点（GT-AG），则将该读段视为候选circRNA。最终，将读段计数≥2的候选circRNA识别为circRNA。使用CIRI2脚本，输入序列比对后的SAM文件、参考基因组FASTA文件和可选的基因注释GTF文件来预测circRNA。使用构建的circRNA序列作为参考基因组，再次使用Hisat2进行比对，筛选高置信度的circRNA。使用DESeq2（R-3.1.2）分析RT组和GC组之间的circRNA差异表达。显著差异circRNA的阈值设定为|log2FC| > 1和P < 0.05。

2.5 **mRNA和ncRNA的GO术语及KEGG通路富集分析**
对DEGs、lncRNA和miRNA的靶基因以及circRNA的来源基因进行GO和KEGG富集分析。使用ClusterProfiler（v R-3.2.4）进行GO分析，使用Kobas（v 2.0）进行KEGG分析。显著性标准均为P < 0.05。

2.6 **lncRNA/miRNA–mRNA的ceRNA网络构建**
为了构建lncRNA/miRNA-mRNA调控网络，对DE lncRNA、miRNA和mRNA进行了联合分析。使用MiRcode数据库预测与DE lncRNA相互作用的miRNA。使用MiRWalk、Target scan和miRDB数据库预测miRNA的靶基因（结合概率：0.95；结合位点位置：3′-UTR）。使用Cytoscape（v 3.8）构建lncRNA/miRNA-mRNA调控网络，并以图形方式展示结果。

2.7 **RT-qPCR验证和统计分析**
使用qRT-PCR验证数据集中的mRNA、lncRNA、miRNA和circRNA，以U6作为内参基因。使用特定引物和条件验证选定的上调/下调ncRNA和mRNA（表1）。采用2–??CT方法量化基因表达水平。使用GraphPad Prism（v 8.0）软件进行学生t检验，比较RT组和CS组之间的差异（P < 0.05）。

**表1. 基因的引物序列**
| 基因 | 序列（5′–3′） | Tm（°C） | Accession No. | ORF： | |
|---------------|------------|---------|-------------|------------------|
| | TGGGCTGGAAGTGTTTAT | 52 | AEMK02000106.1 | |
| | TACTCGCAGAAGAAGTCA | 56 | CST6 | |
| | CAACTACAACATGGGCAGCA | 60.6 | AEMK02000006.1 | |
| | CAGGGAACCACAAGGATCTCA | 60.1 | |
| lnc15346 | F:GAGGAGACGCCTTTGCC | 56 | ENSSSCT000400 | |
| | ACGCCTAGCCTGGGAAC | 56 | |
| lnc05798 | F:TTGGCCTCCTTCCATA | 52 | ENSSSCT000401 | |
| | AAGCCCACCTCTTCAAATA | 54 | AEMK02000067.1 | |
| | ACGGCTTCACGAATTTGCGT | 58 | |
| miR-196 | F:CGCGCGTAGGTAGTTTCAT | 60.2 | AEMK02000028.1 | |
| | AGTGCAGGGTCCGAGGT | 62 | |
| miR-192 | F:GCGCGCTGACCTATGA | 62 | AEMK02000006.1 | |
| | AGTGCAGGGTCCGAGGT | 62 | |

**3. 结果**
3.1 **CS组和RT组之间差异表达mRNA的鉴定**
构建了6个mRNA文库，比较CS组和RT组的mRNA表达水平。CS组中有711个DEGs（P < 0.05，|log2FC| > 1），包括346个上调基因和365个下调基因（图1A和表S2）。层次聚类分析表明，一些DEGs调节相同的通路或具有相似的功能（图1B）。GO分析显示，有46个GO术语的P值< 0.05（图1C和表S3）。富集的生物过程包括蛋白水解、氧化还原、细胞黏附和生物黏附。富集的分子功能包括金属肽酶活性、内肽酶活性、肽酶活性和辅因子结合。富集的细胞成分包括细胞外区域、蛋白酶体复合体和内肽酶复合体。差异表达基因（DEGs）在KEGG通路数据库中进行了比对。蛋白酶体、药物代谢-细胞色素P450、蛋白质消化与吸收以及MAPK信号通路显著富集（P < 0.05）（图1D和表S4）。下载：下载高分辨率图像（872KB）下载：下载全尺寸图像。图1. mRNA表达谱概览。(A) 不同表达（DE）mRNA的火山图（冷应激与对照组）。灰色虚线表示显著基因的阈值；水平线表示?log10 0.001，垂直线表示log2 2。(B) 显示mRNA表达的热图。红色表示高表达，蓝色表示低表达。每个DE mRNA由一列彩色框表示，每个样本由一列表示。(C) DE mRNA的基因本体术语分析（P < 0.05）。(D) Kyoto基因与基因组百科全书（KEGG）对DE mRNA的分析（P < 0.05）。3.2. CS组和RT组之间DE lncRNAs的功能分析发现了许多新的lncRNAs，并将其分为四类（图2A）。为了确保这些新的lncRNAs符合一般特征，比较了它们的外显子数量、转录本长度和开放阅读框（ORF）长度。新的lncRNAs的外显子数量与已注释的lncRNAs相似，但显著低于mRNAs的外显子数量。转录本长度主要为1000 bp，ORF长度主要为200–300 bp，均短于mRNAs的ORF长度（图2B）。CS组和RT组之间的DE lncRNAs包括95个上调和84个下调的lncRNAs（图2C和表S5）。预测了DE lncRNAs的靶基因，并使用这些基因进行了功能富集分析。对于顺式靶基因，识别出22个GO术语（图2D和表S6）。富集的生物学过程（BPs）包括防御反应、免疫反应、免疫系统过程和蛋白质磷酸化。富集的细胞组分（CCs）包括细胞外区域、细胞边缘和超分子复合体。富集的分子功能（MFs）包括细胞因子受体结合、信号受体结合和核苷酸转移酶活性。DE lncRNAs显著富集了16个KEGG通路（P < 0.05），包括甲状腺激素信号通路、AMPK信号通路以及细胞周期和凋亡通路（图2E和表S7）。为反式靶基因提取了30个GO术语（图2F和表S8）。富集的BPs包括细胞分解代谢过程、分解代谢过程和细胞蛋白质分解代谢过程。富集的CCs包括蛋白酶体核心复合体、蛋白酶体复合体和内肽酶复合体。富集的MFs包括阳离子通道活性、氧化还原酶活性和ATP酶活性。DE lncRNAs显著富集了15个KEGG通路（P < 0.05），包括蛋白酶体、蛋白质消化与吸收、DNA复制和核苷酸切除修复通路（图2G和表S9）。下载：下载高分辨率图像（832KB）下载：下载全尺寸图像。图2. lncRNA靶基因的预测和功能分析。(A) 四种lncRNA类型的分布。(B) lncRNAs与mRNA之间的外显子数量、长度和开放阅读框的比较。(C) DE lncRNAs的火山图。灰色虚线表示显著基因的阈值，包括水平线（?log10 0.05）和垂直线（log2 2）。(D) 不同表达（DE）lncRNAs对应的顺式靶基因的基因本体（GO）分析。(E) DE lncRNAs对应的顺式靶基因的京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析。(F) DE lncRNAs对应的反式靶基因的GO分析。(G) DE lncRNAs对应的反式靶基因的KEGG分析。3.3. CS组和RT组之间DE circRNA的概述circRNA是一种具有封闭环形结构的特殊类型的ncRNA。从CS组和RT组获得的rRNA耗尽的肌肉组织中的circRNA谱型显示，共有13,279个circRNAs，广泛分布在猪的十九对染色体上。如果根据来源分类，来自外显子区域的circRNAs占比最高（92.85%）；其次是来自内含子和基因间区域的circRNAs（分别为4.34%和约2.81%）。为了识别参与冷应激的DE circRNAs，比较了CS组和RT组中的表达模式。127个DE circRNAs中包括60个上调和67个下调的基因（图3A、B和表S10）。GO分析识别出30个生物学过程（BPs），包括RNA生物合成过程、生物合成过程和大分子生物合成过程。主要的细胞组分（CCs）是细胞核，主要的分子功能（MFs）是阳离子结合、金属离子结合和锌离子结合（图3C和表S11）。基于DE circRNAs的通路分析显示，破骨细胞分化和B细胞受体信号通路发生了显著变化（图3D和表S12）。下载：下载高分辨率图像（880KB）下载：下载全尺寸图像。图3. circRNA的鉴定和功能分析。(A) DE circRNAs的火山图。(B) 用于评估DE circRNAs表达的热图。(C) circRNAs的GO术语分析。(D) DE circRNAs的KEGG分析。3.4. CS组和RT组之间DE miRNA的概述进行了RNA测序以阐明DE miRNAs在CS组中的作用。测序的小RNA中包括55.1%的已知miRNAs和0.28%的新miRNAs（图4A）。为了识别参与冷应激的DE miRNAs，比较了CS组和RT组之间的表达模式。32个DE miRNAs中包括9个上调和23个下调的基因（图4B和表S13）。DE miRNAs靶向2571个基因。GO分析揭示了62个生物学过程（BPs），包括磷酸化和蛋白质磷酸化。主要的细胞组分（CCs）是细胞核，主要的分子功能（MFs）包括细胞核、膜包被腔和激酶活性（图4C和表S14）。DE miRNAs的主要功能包括细胞粘附分子、甘油磷脂代谢和肥厚型心肌病通路（图4D和表S15）。下载：下载高分辨率图像（685KB）下载：下载全尺寸图像。图4. miRNA靶基因的预测和功能分析。(A) 小RNA的分布。(B) 不同表达（DE）lncRNAs的火山图。灰色虚线表示显著基因的阈值，包括水平线（?log10 0.05）和垂直线（log2 2）。(C) DE miRNAs的GO分析。(D) DE miRNAs的KEGG分析。3.5. ceRNA网络的构建ceRNA调控机制通过竞争性结合miRNA来实现对基因表达的精确调控。它揭示了miRNA调控网络之外的另一种复杂的基因表达调控模式。在这个实验中，建立了lncRNA/miRNA–mRNA网络。识别出11对lncRNA/miRNA–mRNA关系，涉及九个mRNAs（图5）。ssc-miR-370、ssc-miR-133a-3p和ssc-miR-532–3p可能在调节冷应激反应中起重要作用，特别是ssc-miR-370，它还参与RFX4、TTC9B和HSPB1基因的表达调控。下载：下载高分辨率图像（500KB）下载：下载全尺寸图像。图5. 预测的lncRNA–mRNA、miRNA–mRNA和ceRNA网络的可视化。A. 预测的参与冷应激的lncRNA靶mRNA的可视化。B. 预测的参与冷应激的miRNA靶mRNA的可视化。C. 预测的ceRNA网络（lncRNA–miRNA–mRNA）参与冷应激。红色和蓝色分别代表上调和下调的ceRNAs；倒三角形、正三角形和菱形分别代表mRNAs、miRNAs和lncRNAs。3.6. 完整转录组测序结果的验证为了验证测序结果，使用相同的样本进行了qRT-PCR实验。随机选择了两个基因和四个ncRNAs进行验证，包括OTOR、CST6、lncRNA: ENSSSCG00040062468、lncRNA: ENSSSCG00040011712、miR-196a和miR-192。结果显示实验结果与测序结果基本一致（图6）。下载：下载高分辨率图像（143KB）下载：下载全尺寸图像。图6. mRNA和ncRNAs差异表达的确认。通过qRT-PCR测量了冷应激组和对照组中OTOR、CST6、lncRNA: ENSSSCG00040062468、lncRNA: ENSSSCG00040011712、miR-196a和miR-192的mRNA倍数变化；* P < 0.05，** P < 0.01。4. 讨论由于样本数量有限，本研究仅设置了三个生物学重复实验。通过严格控制实验条件并使用高灵敏度检测平台，尽可能减少了技术变异性。然而，结果仍存在一定的局限性。在后续研究中，将适当增加样本量以弥补这一限制。组学是一种系统生物学方法，涉及对生物体内特定分子群体的全面研究。这种研究方法避免了传统单分子研究的局限性，为生命科学提供了新的视角。miRNA、lncRNA和circRNA是三种常见的非编码RNA，它们通过竞争或协作来调控mRNA的转录和表达，在调节体温方面发挥重要作用（Ingelsosn-Filpula等人，2025；Zhang等人，2020；Zhang等人，2021）。例如，miR-669a-5p在冷应激下调节小鼠脂肪细胞的分化，并在脂肪褐变中发挥作用（Tan等人，2022）。lncRNA AK029592可以在脂肪细胞中结合miR-199a-5p以刺激产热基因的表达（Hong等人，2024）。尽管已经在低温环境下研究了ncRNA的表达谱，但没有研究涉及大型牲畜，如猪。因此，分析了暴露于冷应激的迷你猪肌肉中的ncRNA表达谱。由于UCP1基因的突变，猪无法以传统方式形成棕色脂肪。然而，UCP3可能补偿UCP1的缺乏，使猪能够形成米色脂肪以抵抗寒冷（Guo等人，2024）。除了脂肪组织外，肌肉组织也是调节哺乳动物产热的重要器官。肌肉组织可以通过颤抖产热和非颤抖产热来调节体温（Pani等人，2023）。猪的肌肉含量较高，肌肉可能是比脂肪组织更重要的产热器官。然而，根据当前的研究报告，猪肌肉组织在寒冷条件下的产热机制仍存在争议。广泛接受的SERCA调控模式在猪肌肉组织中尚未得到验证（Bal等人，2018），耐寒和不耐寒猪品种的产热机制可能存在显著差异（Li等人，2023；Yang等人，2023）。因此，需要进一步研究猪肌肉组织在寒冷环境下的产热机制。许多因素影响冷处理时间的选择，如实验目的、猪的体重和年龄。因此，研究人员选择了不同的处理时间，如48小时（Yang等人，2021）、4天（Li等人，2023）、21天（Sun等人，2022）和30天（Huang等人，2025）。在这项研究中，由于实验材料是幼猪，选择了3天的冷处理时间。经过3天的冷刺激后，在最长的背肌中观察到mRNA和ncRNAs的显著变化。下调的基因包括mRNAs、circRNAs和miRNAs，而不是lncRNAs，其数量多于上调的基因，表明冷应激倾向于抑制基因表达。这一发现与我们之前的研究结果不一致，即急性冷应激和慢性低温适应下激活的基因更多（Zhang等人，2022）。然而，在培养的肌母细胞中，低温（35°C）诱导下的下调基因比标准培养温度（37°C）更多（Sarais等人，2023）。冷刺激后的基因变化复杂，受多种因素影响，包括品种、年龄、冷刺激的持续时间和强度以及性别（Coughlin等人，2025；Dai等人，2025；Ren等人，2025）。品种是影响猪耐寒性的重要因素。例如，生活在寒冷地区的猪品种通常比生活在热带地区的猪品种具有更强的耐寒性。本地猪品种通常比商业猪品种（如Yorkshine和Landrace）更能适应寒冷环境。目前，猪抵抗寒冷环境的机制尚未完全阐明，但一般认为耐寒品种和敏感品种之间存在差异。例如，在相同的冷刺激下，耐寒猪品种通过产热、能量代谢和线粒体活动来适应冷应激，而Yorkshine主要通过产热和甘油脂能量代谢来应对冷应激（Li等人，2023）。根据DEGs的通路分析，骨骼肌的蛋白酶体通路在冷应激下显著激活。蛋白酶体途径中的PSMC3、PSME4、PSMC4、PSMD3、PSMA7、PSMA1、PSMD2、PSMD11、PSMB3、PSMB4和PSMC2均显著上调。因此，蛋白质的降解在应对寒冷压力时得到增强。蛋白酶体对于维持蛋白质稳态至关重要，影响应激抵抗力、寿命和热适应性。从秀丽隐杆线虫到Gracilariopsis lemaneiformis以及模式小鼠，寒冷压力可能上调各种生物体中的蛋白酶体途径基因表达（Dubey等人，2024年；Qin等人，2023年；Shen等人，2023年）。除了蛋白酶体途径外，细胞代谢、增殖、分化和组织修复途径也在寒冷压力下发生改变。此外，AMPK和PPAR代谢途径、MAPK和PI3K Akt增殖相关途径以及TGF-β和肾素-血管紧张素系统的炎症和纤维化相关途径也受到调控（表S3）。非编码RNA在调节mRNA转录中起着重要作用。因此，分析ncRNA的目标基因可以阐明受影响的生物功能。根据其目标基因，与神经系统（帕金森病和神经退行性病变）、免疫系统（IL-17信号通路）、能量平衡和脂质代谢（脂肪消化和吸收）、细胞周期（凋亡性坏死）、DNA稳定性（DNA复制、核苷酸切除修复）以及内分泌系统（甲状腺激素信号通路）相关的寒冷压力诱导途径参与了应激反应。这与寒冷刺激后出现的认知衰退、运动功能障碍、记忆丧失和肌肉萎缩症状一致（Akan等人，2023年）。程序性坏死和DNA稳定性的变化可能会加速细胞衰老或凋亡。同时，能量代谢也发生显著变化；由于身体需要消耗更多能量物质来维持恒定体温，能量消耗增加（Feyera等人，2023年）。ceRNA网络的构建使我们能够更直观地理解寒冷压力下lncRNA、miRNA和mRNA之间的调控关系。发现了一条与囊泡运输相关的调控途径。该途径中的关键基因是YKT6。ssc-miR-6782–3p抑制YKT6的表达，而lncRNA ENSSSCT00040014532与ssc-miR-6782–3p竞争结合位点。YKT6在真核生物中高度保守，主要参与囊泡运输、细胞膜融合以及外泌体的形成和释放（Zhang等人，2024年）。我们之前对Min猪的全基因组序列分析研究表明，Min猪的囊泡运输途径受到自然选择（Zhang等人，2022b年）。作为细胞间通讯的关键载体，囊泡在寒冷压力下会选择性地装载特定的生物活性分子（如miRNA和蛋白质）。这些囊泡可以从激活的组织（如棕色脂肪组织）释放，并通过体液循环到达远端器官（如肝脏），从而实现跨组织信息传递并协调全身代谢（Xu等人，2023年）。ssc-miR-6782–3p在仔猪断奶引起的肠道应激中起重要作用（Jang & Lee，2021年）。寒冷压力下细胞内囊泡运输的变化可能是由于蛋白质降解增加和脂质代谢改变引起的（Shimoyama等人，2020年；Tomanek，2014年）。一个更复杂的ceRNA调控网络涉及五个基因，包括RFX4、TTC9B和HSPB1；三个miRNA，包括ssc-miR-370和ssc-miR-133a-3p；以及四个lncRNA，包括ENSSSCT00040061639。RFX4属于调控因子X家族，该家族成员的主要功能是参与调节机体对环境的适应性（Zhao等人，2024年）。HSPB1属于HSP20家族，它可以对不同类型的细胞应激作出不同的反应。例如，在氧化应激下它具有抗氧化作用，但在化学应激下也可以作为抗凋亡剂（Liang等人，2023年；Sluzala等人，2025年）。ssc-miR-133a-3p属于MyomiRsis家族，在猪肌肉中高表达（Daza等人，2017年；Zuo等人，2015年）。ssc-miR-133a-3p通过PPAR信号通路参与猪皮下脂肪的发育调节（Zhang等人，2022c年）。ceRNA网络的构建基于生物信息学分析结果，并显示出明显的预测能力。后续实验将重点关注ENSSSCT00040061639-ssc-miR-370/ssc-miR-133a-3p-YKT6调控轴，以验证它们是否符合“ceRNA竞争性吸附”机制。5. 结论本研究描述了寒冷压力下Min猪骨骼肌中完整转录组的表达谱。在3天的寒冷压力下，Min猪肌肉中的mRNA和ncRNA表达受到抑制。结合之前的研究，我们筛选了三个lncRNA–miRNA–mRNA网络。寒冷压力改变了蛋白酶体、神经系统、细胞周期和DNA稳定性途径。这些发现将为进一步研究Min猪肌肉组织在寒冷压力下的适应机制提供理论支持。资助本研究由黑龙江省自然科学基金（TD2024C002）、黑龙江省农业科学院科技创新项目（CX23ZD06）和国家生猪技术创新中心研究计划（NCTIP-XD/C16）资助。伦理委员会所有动物手术均按照相关指南进行。所有动物护理和样本收集程序均严格遵循黑龙江省农业科学院动物研究所（IAH-202325）批准的协议。CRediT作者贡献声明Wentao Wang：撰写——原始草稿、正式分析、数据管理。Liang Wang：正式分析、数据管理。Shuo Yang：撰写——原始草稿、验证。Di Liu：撰写——审阅与编辑、概念构思。Dongjie Zhang：撰写——审阅与编辑、资金获取、概念构思。