犬黏液瘤性二尖瓣疾病和扩张型心肌病中心肌组织的定量和定性组织病理学分析

《The Veterinary Journal》：Quantitative and qualitative histopathological analysis of myocardial tissue in canine myxomatous mitral valve disease and dilated cardiomyopathy

　　索拉维特·佩塔里亚约旺（Sorawit Phetariyawong）、延斯·哈格斯特伦（Jens H?ggstr?m）、弗雷德里克·索德斯特恩（Fredrik S?dersten）、塔利莎·C.F. 斯潘耶斯伯格（Talitha C.F. Spanjersberg）、奥萨·奥尔松（?sa Ohlsson）、埃里克·阿克塞尔松（Erik Axelsson）、玛格达莱娜·哈拉卡洛娃（Magdalena Harakalova）、弗兰克·G. 范·斯廷贝克（Frank G. van Steenbeek）、英格丽德·永瓦尔（Ingrid Ljungvall）
瑞典农业科学大学兽医医学与动物科学学院临床科学系，乌普萨拉

**摘要**
定量和定性的组织病理学评估可以为患有黏液瘤性二尖瓣疾病（MMVD）和扩张型心肌病（DCM）的狗的心肌组织变化提供互补且新的见解。本研究旨在使用定量和定性的组织病理学方法，比较患有MMVD、DCM的狗以及心脏健康的对照组的多个区域匹配的心脏标本中的心肌组织病理学特征。研究共纳入了27只MMVD狗、16只DCM狗和32只心脏健康对照组狗。通过数字图像分析软件定量评估了心肌细胞、纤维化和脂肪的组织比例，以及动脉管腔与面积比（LAR）；同时定性地评估了心内膜增厚、纤维化、脂肪和减弱波状纤维的存在情况。与对照组相比，MMVD狗的左心室（LV）侧壁、LV后乳头肌和左心房中的纤维化比例更高（所有P<0.05），且更多MMVD狗的心内膜增厚（P<0.05）。DCM狗的两个心房中的纤维化比例也高于对照组（P<0.05），其室间隔中的纤维化程度也高于MMVD狗（P<0.05）。伴有心房颤动的DCM狗的心房纤维化比例更高（P<0.05）。在各区域中，LAR和减弱波状纤维的存在情况在各组间无差异。总之，MMVD狗的心肌组织病理学改变主要发生在左侧，而DCM狗则表现为双侧改变。某些心脏区域的组织病理学特征随疾病类型和严重程度的不同而变化，这突显了它们在疾病发病机制中的潜在作用。

**引言**
黏液瘤性二尖瓣疾病（MMVD）和扩张型心肌病（DCM）是狗常见的两种心脏疾病。这两种疾病常伴随心室偏心重构和心房扩张。MMVD主要见于小型犬，其特征是二尖瓣弥漫性增厚、结节形成和变形，导致二尖瓣反流，进而引起左心室（LV）和左心房（LA）扩张（Ljungvall等，2011a；Aupperle和Disatian，2012；Fox，2012；Oyama等，2020）。DCM是一种主要见于大型犬的心肌疾病，其特征是心室收缩功能障碍，导致继发性心室扩张和功能障碍，通常影响左侧心腔，有时涉及所有四个心腔（Richardson等，1996；Tidholm等，2001；Dukes-McEwan等，2003；Tidholm和J?nsson，2005）。

传统上，组织病理学评估用于主观（定性）评估MMVD（Falk等，2006；Falk等，2010；Aupperle和Disatian，2012；Fox，2012；Janus等，2016）和DCM（Hazlett等，1983；Everett等，1999；Vollmar，2000；Tidholm和J?nsson，2005；Janus等，2015；Janus等，2016；Vollmar和Aupperle，2016；Gasparini等，2020）狗的心肌细胞形态、纤维化和脂肪浸润的程度，以及可能指示动脉硬化的动脉狭窄，以及炎症细胞的存在。在患有CHF的MMVD狗中，发现LA和LV心肌中存在纤维化和动脉狭窄（Falk和J?nsson，2000；Falk等，2006；Falk等，2010；Janus等，2016），且动脉狭窄与纤维化程度相关（Falk等，2006；Falk等，2010）。在DCM狗中，心肌各部位均发现心肌纤维化、脂肪浸润和动脉狭窄（Hazlett等，1983；Everett等，1999；Tidholm和J?nsson，2005；Janus等，2015；Vollmar和Aupperle，2016；Gasparini等，2020）。DCM有两种组织病理学类型：“脂肪浸润-变性型”和“减弱波状纤维型”（Hazlett等，1983；Harpster，1991；Everett等，1999；Tidholm和J?nsson，2005）。“脂肪浸润-变性型”主要见于拳师犬和杜宾犬，“减弱波状纤维型”主要见于巨型犬和大型犬，包括纽芬兰犬、大丹犬和埃斯特雷拉山犬（Tilley和Liu，1975；Sandusky等，1984；Harpster，1991；Tidholm等，2000；Lobo等，2010）。在爱尔兰狼犬中，这两种类型的特征均在诊断为DCM的狗的心室心肌中得到组织病理学描述（Tilley和Liu，1975；Vollmar和Aupperle，2016）。大多数针对MMVD狗的组织病理学研究主要集中在瓣膜病变上，而针对DCM狗的研究则主要集中在LV心肌上。在兽医医学中，对MMVD和DCM狗的多个解剖区域的心脏组织样本进行系统评估的研究较少，因此这两种疾病之间的潜在心肌差异在组织病理学上尚未得到充分探索。在同一分析框架下研究这些疾病可能有助于识别共同的病理生理途径以及每种疾病特有的机制。

数字图像分析软件已被引入，以系统地对组织样本进行深入的形态学分析。该软件能够跨不同物种的不同器官进行定量和定性评估（Bankhead等，2017；Mysona等，2020；Humphries等，2021；Peter，2021；Abecasis和Cortez-Dias，2023；Kirillov等，2023）。这种方法还支持大规模数据整合，将组织形态、分子特征和临床结果联系起来。鉴于犬类心脏疾病与人类疾病有许多共同点，犬类心脏疾病的数字病理学可能为跨物种的转化研究提供有价值的平台，推动诊断和治疗的创新。据我们所知，此前尚无研究应用这种机器学习辅助的、区域特定的、半自动化的数字组织病理学技术来评估狗的心肌组织，也未探索其在比较MMVD和DCM方面的潜力。定量和定性的组织病理学评估可以为MMVD和DCM狗的心肌组织变化提供互补且新的见解。因此，本研究旨在使用定量形态测量方法比较患有MMVD、DCM的狗以及心脏健康对照组的多个区域匹配的心脏标本中的心肌组织病理学特征，包括心肌细胞、纤维化和脂肪的比例，以及动脉管腔与面积比（LAR），并定性评估心内膜增厚、纤维化、脂肪和减弱波状纤维的存在情况，以确定心肌变化是否与疾病的超声心动图指标相关。

**材料与方法**
本研究遵循瑞典农业科学大学乌普萨拉分校动物教学医院（UDS）的伦理指南和通用数据保护条例（GDPR），以及动物体内实验报告（ARRIVE）指南进行。该研究已获得乌普萨拉和斯德哥尔摩南部动物实验伦理委员会（C103/10、C2/12、C12/15、5.8.18–04682/2020）的批准。安乐死操作按照UDS和阿斯利康R&D S?dert?lje的标准程序进行，由狗主人根据与本研究无关的原因独立决定，尽管潜在的医疗状况（包括心脏疾病）可能影响了这些决定。在实验前已从宠物主人处获得知情同意。安乐死使用过量的戊巴比妥钠。

**研究对象**
纳入研究的家犬（Canis lupus familiaris）包括私人拥有的狗以及来自制药公司（阿斯利康R&D G?rtuna，瑞典）的研究设施中的狗。2006年至2023年间，前瞻性地招募了患有自然发生的MMVD、DCM或心脏健康的狗。选择心脏健康的狗是为了反映MMVD和DCM组中的品种规模分布。如果狗被诊断为DCM或MMVD，或被归类为心脏健康，且没有其他可能引起继发性心脏效应的心脏疾病和其他临床显著的系统性疾病，则符合纳入标准。记录了关于狗的特征（如年龄、性别、品种和体重）、病例史以及体检结果。体重低于15公斤的狗被归类为小型犬，体重超过25公斤的狗被归类为大型犬（Montoya等，2025）。体重在15至25公斤之间的狗未被纳入本研究。正在服用标准心脏药物的狗（包括利尿剂、匹莫贝丹、血管紧张素转换酶抑制剂和抗心律失常药物）也被允许纳入研究。

**临床检查**
对于出现心力衰竭（CHF）临床症状（如呼吸急促和呼吸努力增加）的狗，进行了胸部X光检查以评估是否存在肺水肿。对疑似心律失常的狗进行了标准6导联心电图（ECG）记录。经验丰富的兽医心脏病专家（IL或JH）使用频率在5至7 MHz之间的超声设备进行了标准M模式、二维（2D）超声心动图和彩色多普勒检查，并在ECG监测下进行。在超声心动图检查期间，狗被轻轻固定在右侧和左侧卧位（Thomas等，1993）。从右侧胸骨旁长轴和左侧心尖4腔视图检查二尖瓣结构。通过彩色多普勒映射评估二尖瓣反流（MR）的程度，并主观评估反流射流的面积与LA面积的比例（Pedersen等，1999）。还筛查了三尖瓣、主动脉瓣和肺动脉瓣的潜在反流。根据标准程序从右侧胸骨旁短轴视图对LV进行了M模式测量（Thomas等，1993）。使用主动脉瓣关闭时的第一帧中的左心房直径与主动脉根部的比值来评估左心房大小（Hansson等，2002）。测量了左心室舒张末期和收缩末期内部尺寸（LVIDd和LVIDs），并随后根据以下公式按体重进行标准化：标准化LVIDd（LVIDDn）= LVIDd（cm）/（体重（kg）^0.294；标准化LVIDs（LVIDSn）= LVIDs（cm）/（体重（kg）^0.315（Cornell等，2004））。左心室分数缩短率（LV FS%）是根据M模式获得的测量值计算得出的。所有超声心动图图像和循环均由经过认证的兽医心脏病专家（IL）在2023年进行了系统审查。

**心脏组织取样**
由于部分心脏样本需立即冷冻用于遗传和蛋白质组学研究，因此优先进行快速组织采集（安乐死后30分钟内）。通过从心尖开始并向基部延伸至心房和心室流出道（主动脉和肺动脉）的纵向切口打开心脏，从而暴露心腔。随后根据取样方案（图1）使用锋利的手术刀从七个解剖位置收集心肌组织样本：LV后乳头肌（PPM）；LV侧壁（前乳头肌和后乳头肌之间）；LV前乳头肌（APM）；与乳头肌同一水平的室间隔（IVS）；RV侧壁；右心房（RA）的主体；以及左心房（LA）的主体。在每只狗中，按此预定顺序收集样本，并在整个研究中的所有狗中一致应用相同的程序。为了减少沿顶基轴的区域差异，从LV乳头肌水平获取两个心室的组织样本。组织样本立即在室温下的10%中性缓冲福尔马林中固定。

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**图1.** 用于组织病理学检查的取样部位示意图：1. 左心室（LV）前乳头肌；2. LV侧壁；3. LV后乳头肌；4. 室间隔；5. RV侧壁；6. 右心房；7. 左心房。蓝色圆圈表示在MMVD中观察到的结构改变，橙色圆圈表示在DCM中观察到的结构改变，这些改变是通过定量组织病理学评估确定的。超声心动图的检查结果由经验丰富的兽医心脏病专家（IL或JH）进行评估，而大体病理学检查结果则由同一组心脏病专家和一位经验丰富的兽医病理学家（FS）共同评估。MMVD（二尖瓣膜病）的超声心动图诊断标准包括在二维和彩色多普勒图像上观察到二尖瓣叶增厚和/或脱垂以及二尖瓣反流（Ljungvall等人，2011a；Keene等人，2019）。MMVD的大体病理学诊断标准包括瓣叶上出现灰白色、光滑、有光泽的结节或斑块样隆起（Whitney，1974；Fox，2012）。DCM（扩张型心肌病）的超声心动图诊断标准包括左心室收缩功能障碍，并伴有左心室腔扩大，可能伴有或不伴有右心室扩大。根据先前发布的指南和建议，左心室射血分数（FS%）降低和左心室舒张末期容积（LVIDSn）超过参考范围表明存在左心室收缩功能障碍（Dukes-McEwan等人，2003；Holler和Wess，2014；Wess等人，2017；Esser和Borkovec，2020）。左心室腔扩大是根据舒张期左心室直径超过参考范围来确定的，而右心室腔扩大则是通过主观评估来确定的（Dukes-McEwan等人，2003；Cornell等人，2004；Wess等人，2017；Esser等人，2020）。DCM的大体病理学诊断标准还包括左侧心腔的扩张或左右心腔同时扩张，以及左心室壁厚度与心腔直径比例降低和心室小梁网变平（Tidholm和J?nsson，1997；Dukes-McEwan等人，2003；Hughes和McKenna，2005）。如果心脏听诊、超声心动图和心电图检查均未发现异常，且大体病理学检查也未发现心脏形态学异常，则将这些狗归类为心脏健康的狗（对于小型犬对照组，心电图检查不是强制性的诊断步骤）。根据体格检查、超声心动图、胸部X光片（如进行）和大体病理学的检查结果，狗被分为三组：1）患有MMVD的狗（Keene等人，2019）；2）患有DCM的狗（Dukes-McEwan等人，2003）；3）心脏健康的狗（对照组）。患有MMVD的狗进一步根据美国兽医内科医学院（ACVIM）的分期标准分为临床前阶段（对应ACVIM B期）和临床阶段（对应ACVIM C期和D期）（Keene等人，2019）。患有DCM的狗也根据DCM的分期系统进一步分为临床前阶段（对应DCM B期）和临床阶段（对应DCM C期和D期）（Wess，2021）。对照组狗根据体重分为小型犬（<15公斤）和大型犬（>25公斤）两组，分别作为MMVD（小型犬）和DCM（大型犬）队列的参考组。

心脏健康的狗是指在心脏听诊、超声心动图和心电图检查中均未发现异常，并且大体病理学检查也未发现心脏形态学异常的狗。根据这些检查结果，狗被分为三组：1）患有MMVD的狗（Keene等人，2019）；2）患有DCM的狗（Dukes-McEwan等人，2003）；3）心脏健康的狗（对照组）。患有MMVD的狗进一步根据美国兽医内科医学院（ACVIM）的分期标准分为临床前阶段（对应ACVIM B期）和临床阶段（对应ACVIM C期和D期）（Keene等人，2019）。患有DCM的狗也根据DCM的分期系统进一步分为临床前阶段（对应DCM B期）和临床阶段（对应DCM C期和D期）（Wess，2021）。对照组狗根据体重分为小型犬（<15公斤）和大型犬（>25公斤）两组，分别作为MMVD（小型犬）和DCM（大型犬）队列的参考组。

心脏组织的样本（大约5x5x5毫米）被固定并储存在10%中性缓冲福尔马林（pH 7.4）中，置于室温下直至后续处理。然后对样本进行修剪、脱水，并包埋在石蜡中。石蜡包埋的组织被切成4-5微米的切片，并使用Masson三色染色法进行染色（Van De Vlekkert等人，2020），以便在光学显微镜下区分心肌细胞、脂肪和纤维化。使用数字显微镜扫描仪（NanoZoomer XR，Hamamatsu Photonics，日本）以20倍放大倍数获取玻璃载玻片的全片图像，并以TIF格式保存。

所有定量和定性的组织病理学评估均由一名兽医博士生（SP）在兽医病理学家（FS）的直接监督下于2024年系统地进行。使用了QuPath（v0.5.1）图像分析软件（Bankhead等人，2017）对心脏组织的全片图像进行评估。

定量组织病理学评估中，软件通过应用一个阈值分割器（分辨率=中等，1.81微米/像素；通道=红色；预滤波器=加权偏差；平滑=2；阈值=5）来检测组织区域。该阈值分割器生成的最小组织对象面积为200,000微米2（图2a和b）。

基于体检、超声心动图、胸部X光片（如进行）和大体病理学的检查结果，狗被分为三组：1）患有MMVD的狗（Keene等人，2019）；2）患有DCM的狗（Dukes-McEwan等人，2003）；3）心脏健康的狗（对照组）。患有MMVD的狗进一步根据美国兽医内科医学院（ACVIM）的分期标准分为临床前阶段（对应ACVIM B期）和临床阶段（对应ACVIM C期和D期）（Keene等人，2019）。患有DCM的狗也根据DCM的分期系统进一步分为临床前阶段（对应DCM B期）和临床阶段（对应DCM C期和D期）（Wess，2021）。对照组狗根据体重分为小型犬（<15公斤）和大型犬（>25公斤）两组，分别作为MMVD（小型犬）和DCM（大型犬）队列的参考组。

心脏组织样本（大约5x5x5毫米）被固定并储存在10%中性缓冲福尔马林（pH 7.4）中，置于室温下直至后续处理。然后对样本进行修剪、脱水，并包埋在石蜡中。石蜡包埋的组织被切成4-5微米的切片，并使用Masson三色染色法进行染色（Van De Vlekkert等人，2020），以便在光学显微镜下区分心肌细胞、脂肪和纤维化。使用数字显微镜扫描仪（NanoZoomer XR，Hamamatsu Photonics，日本）以20倍放大倍数获取玻璃载玻片的全片图像，并以TIF格式保存。

所有定量和定性的组织病理学评估均由一名兽医博士生（SP）在兽医病理学家（FS）的直接监督下于2024年系统地进行。使用了QuPath（v0.5.1）图像分析软件（Bankhead等人，2017）对心脏组织的全片图像进行评估。

为了训练软件区分折叠组织和非折叠组织，使用了一组24张代表性图像来标记折叠组织区域和非折叠组织区域（分类器=随机树；分辨率=低，3.62微米/像素；通道=红色、绿色、蓝色；特征=高斯）。该分类器识别出的最小折叠组织对象面积为20,000微米2。同一组图像也被用来标记心内膜/心外膜区域，以训练软件区分心内膜/心外膜和心肌（分类器=随机树；分辨率=低，3.62微米/像素；通道=红色、绿色、蓝色；特征=高斯），从而生成最小面积为50,000微米2的心内膜/心外膜对象。然后通过减去折叠组织对象（如果存在）和心内膜/心外膜对象的面积来调整总组织面积（图2c）。

为了训练软件识别心肌细胞和纤维化，使用了同一组图像（分类器=随机树；分辨率=中等，1.81微米/像素；通道=红色、绿色、蓝色；特征=高斯、结构张量[最大和中间特征值]和Hessian[中间特征值]）。标记了多个心肌细胞和纤维化区域以训练软件识别它们。随后应用该分类器来量化心肌细胞和纤维化所占的面积（图2d）。由于数字图像分析软件无法区分结缔组织结构和纤维化，因此所有心脏标本的纤维化比例中都包含了结缔组织。使用QuPath 0.3.2中的StarDist软件检测脂肪（阈值=0.35，像素大小=0.9）来测量脂肪所占的面积（Schmidt等人，2018）（图2e和f）。StarDist能够识别脂肪细胞的白色外观，并根据细胞结构和形态进行识别。为了优化脂肪细胞的检测，调整了阈值和像素大小以实现最准确的检测。

心肌细胞的百分比计算方法如下：（心肌细胞面积 / （心肌细胞面积 + 纤维化面积 + 脂肪面积）× 100。纤维化的百分比计算方法如下：（纤维化面积 / （心肌细胞面积 + 纤维化面积 + 脂肪面积）× 100。脂肪的百分比计算方法如下：（脂肪面积 / （心肌细胞面积 + 纤维化面积 + 脂肪面积）× 100。LAR（管腔面积比率）是通过将血管的管腔面积除以总血管面积（不包括外膜）来计算的，如先前出版物所述（Falk等人，2006）。使用QuPath中的Segment Anything Model扩展版本（Kirillov，2023）对心肌血管进行半自动化分割，以量化动脉管腔面积和总血管面积（图2g）。分析中包括了直径在50至400微米之间的心肌动脉，排除了非圆形和斜切的血管。每个组织样本分析了三条心肌动脉，平均值用于后续分析。

为了对应用于心肌组织样本的定量方法（QuPath）进行方法学评估，从不同组的十八个样本中随机选取了一部分图像，代表三个解剖区域：左心室侧壁、左心室乳头肌（PPM）和左心房（LA）。分析由一名兽医博士生（SP）在兽医病理学家（FS）的监督下于2024年进行。使用基于网格的计数方法来估计心肌细胞、纤维化和脂肪所占的相对面积。心脏组织切片上覆盖了一个250×250微米的网格，并记录了与心肌细胞、纤维化和脂肪相交的区域。各组分的百分比计算方法如下：心肌细胞百分比 = （心肌细胞交点数 / （心肌细胞交点数 + 纤维化交点数 + 脂肪交点数）× 100；纤维化百分比 = （纤维化交点数 / （心肌细胞交点数 + 纤维化交点数 + 脂肪交点数）× 100；脂肪百分比 = （脂肪交点数 / （心肌细胞交点数 + 纤维化交点数 + 脂肪交点数）× 100。

使用RStudio（版本4.2.3）（RStudio Team，2023）和“ggplot2”包（Wickham，2016）生成了Bland-Altman图，以评估使用QuPath和基于网格的计数方法得到的结果之间的一致性。计算了每个组织样本的心肌细胞、纤维化和脂肪的百分比的平均值和差异，并将平均值绘制在X轴上，差异绘制在Y轴上。通过计算选定样本的平均差异来确定偏差。还计算了差异的标准差（SD）。较低的一致性水平定义为偏差 - (1.96×SD)，较高的一致性水平定义为偏差 + (1.96×SD)。

总体而言，大多数观察结果都在一致性范围内，表明使用QuPath和基于网格的计数方法得到的结果具有合理的一致性（补充图S1）。图表显示了一些变异性，尤其是在测量极端值处。

所有样本均使用相同的预定义标准进行评估。当心内膜与心肌之间出现增厚的纤维弹性组织层时，认为心内膜增厚，如先前所述（Stehbens等人，2000），并将结果报告为“存在”或“不存在”（图3）。间质纤维化的模式被分类为“不存在”，当没有纤维化的组织学证据或仅有少量胶原沉积时；“局灶性”，当纤维化局限于组织切片的小区域时；“弥漫性”，当在整个组织中观察到不同量的纤维化时（图4a-c）（Pattanayak和Bleumke，2015）。当没有观察到纤维化的组织学证据时，将血管周围纤维化或替代性纤维化报告为“不存在”；当观察到围绕心肌内血管的纤维化（血管周围纤维化）或在局部区域替代心肌的纤维化（替代性纤维化）时，将其报告为“存在”（图4d-f）（Krenning等人，2010）。脂肪浸润与心外膜脂肪区分开来，仅记录心肌内的脂肪浸润。脂肪浸润的模式被分类为“不存在”，当没有脂肪浸润的组织学证据时；“局灶性”，当局部脂肪浸润局限于组织切片的小区域时；“弥漫性”，当脂肪浸润遍布整个心肌时，符合既定标准（图5）（Fox等人，2000）。当在至少一半的心肌厚度中观察到波状且减弱的肌细胞时，将减弱的波状纤维分类为“存在”；当没有观察到此类特征时，将其分类为“不存在”（图6）（Tidholm等人，1998）。图4. 左心房（LA）Masson三色染色切片中正常心内膜与增厚心内膜的示例。(a) 来自2岁雌性大丹犬（大型犬对照组）的正常心内膜（比例尺 = 100 μm）。(b) 来自10岁雄性卡瓦利尔王查尔斯猎犬（患有临床黏液样二尖瓣疾病）的增厚心内膜（比例尺 = 100 μm）。下载：下载高分辨率图像（2MB）下载：下载全尺寸图像

图5. Masson三色染色切片中显示心肌间质纤维化和血管周围/替代纤维化存在及程度的示例。(a) 来自1岁雌性比格犬（小型犬对照组）的左心室（LV）前乳头肌（APM）中未观察到间质纤维化的证据（比例尺 = 100 μm）。(b) 来自10岁雌性卡瓦利尔王查尔斯猎犬（患有临床黏液样二尖瓣疾病（MMVD）的LV后乳头肌中观察到局灶性间质纤维化（蓝色）（比例尺 = 100 μm）。(c) 来自8岁雄性卡瓦利尔王查尔斯猎犬（患有临床MMVD）的右心房（RA）中观察到弥漫性间质纤维化（蓝色）（比例尺 = 250 μm）。(d) 来自2岁雌性比格犬（小型犬对照组）的室间隔中未观察到血管周围纤维化和替代纤维化的证据（比例尺 = 100 μm）。(e) 来自12岁雌性卡瓦利尔王查尔斯猎犬（患有临床MMVD）的RA中观察到血管周围纤维化的证据（比例尺 = 100 μm）。(f) 来自8岁雄性卡瓦利尔王查尔斯猎犬（患有临床MMVD）的LV APM中观察到替代纤维化的证据（比例尺 = 250 μm）。下载：下载高分辨率图像（741KB）下载：下载全尺寸图像

图6. Masson三色染色切片中显示心肌脂肪浸润存在及程度的示例。(a) 来自1岁雌性比格犬（小型犬对照组）的左心室后乳头肌中未观察到脂肪浸润的证据（比例尺 = 200 μm）。(b) 来自6岁雌性杜宾犬（患有临床扩张型心肌病（DCM）的右心房中观察到局灶性脂肪浸润（白色）（比例尺 = 200 μm）。(c) 来自11岁雄性杜宾犬（患有临床DCM）的右心室侧壁中观察到弥漫性脂肪浸润（白色）（比例尺 = 250 μm）。下载：下载高分辨率图像（540KB）下载：下载全尺寸图像

图7. Masson三色染色切片中显示心肌细胞波状纤维减弱外观的示例。(a) 来自2岁雌性大丹犬（大型犬对照组）的右心房中未观察到波状纤维减弱的证据（比例尺 = 200 μm）。(b) 来自4岁雌性杜宾犬（大型犬对照组）的RA中观察到心肌细胞波状纤维减弱的外观（比例尺 = 200 μm）。

统计分析
所有统计分析均使用JMP? Pro 17.0版本进行。比较了小型犬对照组与大型犬对照组、患有MMVD的犬与小型犬对照组、患有DCM的犬与大型犬对照组以及患有MMVD的犬与患有DCM的犬之间的差异。随后对卡瓦利尔王查尔斯猎犬（CKCS）中的MMVD患者与其他小型犬中的MMVD患者、杜宾犬中的DCM患者与其他大型犬中的DCM患者以及患有DCM的犬与伴有心房颤动的犬进行了亚组比较。连续变量以中位数±四分位数范围（IQR）表示，并使用非参数统计方法进行比较。三个独立组之间的比较使用Kruskal-Wallis检验进行，两个独立组之间的比较使用Wilcoxon秩和检验进行。对于三个独立组之间的成对事后比较，使用Dwass-Steel-Critchlow-Fligner检验进行，并对多重比较进行了P值调整。非连续变量以比例表示，如果预期计数大于五则使用卡方检验（似然比），如果预期计数小于五则使用Fisher精确检验。P值<0.05被认为具有统计学意义。

单变量线性回归用于评估患有MMVD的犬和小型犬对照组以及患有DCM的犬和大型犬对照组中因变量（心肌细胞百分比、纤维化、脂肪和LAR）与解释变量（年龄、体重和超声心动图测量值）之间的关联。采用向后逐步回归程序（多重线性回归）来评估年龄、体重和超声心动图变量预测心肌细胞百分比、纤维化、脂肪和LAR的能力。退出概率设为0.2，进入概率设为0.05。所有预测变量都被添加到模型中，逐步移除最不显著的变量，直到只剩下统计学上显著的变量。最终预测模型仅保留P值<0.05的变量。使用RStudio（版本4.2.3）和“ggplot2”包（Wickham，2016）将单变量线性回归模型的调整后R2值、相应的P值和标准化贝塔系数可视化为热图，并使用JMP? Pro 17.0将多重线性回归模型可视化为带拟合线的散点图。

研究特征
参与研究的75只犬（35只雌性，38只雄性，2只性别未报告）包括63只私人拥有的犬和12只来自制药公司（Astra Zeneca R&D，瑞典S?dert?lje）的研究犬，其中后者组的犬没有疾病。在招募的犬中，27只均为小型犬，自然患有MMVD（10只临床前MMVD和17只临床MMVD），16只均为大型犬，自然患有DCM（5只临床前DCM和11只临床DCM），32只作为对照组（14只小型犬对照组和18只大型犬对照组）。每组犬的七个解剖位置的可用心脏组织样本数量见补充表S1。福尔马林固定时间的中位数为1.9年（IQR：1.1–6.7年）。每组犬的中位年龄和体重见表1。最常见的犬种是CKCS（n=24），其次是杜宾犬（n=17）、比格犬（n=12）、大丹犬（n=10）和爱尔兰狼犬（n=2）。研究还包括其他八个品种的各一只代表：澳大利亚凯尔皮犬、卡纳科索犬、腊肠犬、芬兰杜宾犬、杰克罗素梗、拉普兰牧羊犬和西伯利亚哈士奇以及两只混血犬。所有患有MMVD和DCM的犬以及18只对照组（2只小型犬和16只大型犬）的超声心动图数据包括LA/Ao比率、LVIDDn、LVIDSn和LV FS%（表1）。在纳入研究时，75只犬中有4只（5.3%）检测到室性早搏复合波（VPC），其中2只被诊断为MMVD（均为CKCS），2只被诊断为DCM（均为杜宾犬）。6只犬（8.0%）被检测到心房颤动，其中所有犬都被诊断为DCM（3只大丹犬、2只爱尔兰狼犬、1只杜宾犬）。在纳入研究时，21只犬正在接受药物治疗，其中15只犬接受呋塞米治疗。其他治疗方法包括螺内酯（5/75只犬，6.7%）、ACE抑制剂（3/75只犬，4%）、匹莫苯丹（17/75只犬，22.7%）、地高辛（4/75只犬，5.3%）、地尔硫卓（1/75只犬，1.3%）、地高辛和地尔硫卓联合使用（2/75只犬，2.7%）、泼尼松龙（1/75只犬，1.3%）以及卡洛芬和曲马多联合使用（1/75只犬，1.3%）。

表1. 对照组（n=32）、患有黏液样二尖瓣疾病（MMVD）的犬（n=27）和患有扩张型心肌病（DCM）的犬（n=16）的犬特征、合并症和超声心动图数据摘要。

变量
小型犬对照组 | 临床前MMVD | 临床MMVD | P值
大型犬对照组 | 临床前DCM | 临床DCM | P值
研究数量 | 14 | 10 | 17 | 18 | 5 | 11 |
犬种（n） | 比格犬 = 12 | CKCS = 2 | 比格犬 = 1 | CKCS = 9 | 澳大利亚凯尔皮犬 = 1 | CKCS = 1 |
卡纳科索犬 = 1 | 杜宾犬 = 1 | 杰克罗素梗 = 1 | 混合犬 = 1 |
DBM = 9 | 卡纳科索犬 = 1 | 大丹犬 = 6 | 拉普兰牧羊犬 = 1 | 西伯利亚哈士奇 = 1 |
DBM = 5 | DBM = 3 | 芬兰杜宾犬 = 1 | GD = 4 | 爱尔兰狼犬 = 2 | 混合犬 = 1 |
年龄 | 1.8a (1.2–1.9) | 11.7b (9.5–13.7) | 9.9b (8.4–12.3) | <0.01 |
4.4a (1.8–8.2) | 5.6a (4.5–10.1) | 6.2a (5.1–8.7) | 0.14 |
体重 | 11.8a (9–14) | 9.6a (9–10.3) | 9.4a (7.7–10.3) | 0.35 |
38.9a (30.8–52.3) | 37.0a (33.0–43.7) | 59.0a (42.3–62.5) | 0.09 |
合并症（n） | 神经系统 = 1 | 行为 = 1 | 肌肉骨骼 = 3 |
神经系统 = 1 | 行为 = 1 | 肌肉骨骼 = 5 | 肌肉骨骼 = 2 |
-- |
超声心动图数据可用（n） | 21 | 10 | 17 | 16 | 5 |
LA/Ao比率 | N/A | 1.4 (1.2–1.7) | 2.3 (1.9–2.6) | <0.01 |
*1.2a (1.1–1.2) | 1.6b (1.3–1.7) | 2.0c (1.8–2.2) | <0.01 |
LVIDDn（cm） | N/A | 1.8 (1.6–2.2) | 2.5 (2.1–2.7) | <0.01 |
*1.5a (1.5–1.7) | 2.0b (1.8–2.2) | 2.2b (1.8–2.5) | <0.01 |
LVIDSn（cm） | N/A | 1.1 (1.0–1.1) | 1.3 (1.2–1.5) | 0.01 |
*1.0a (0.9–1.0) | 1.5b (1.3–1.8) | 1.6b (1.4–1.9) | <0.01 |
LV FS% | N/A | 38.9 (32.5–47.7) | 43.0 (39.5–47.1) | 0.38 |
*30.8a (27.3–38.8) | 17.0a,b (11.2–30.9) | 18.0b (11.0–21.8) | <0.01 |

连续变量以中位数±四分位数范围表示。超声心动图数据；体重标准化为舒张末期和收缩末期左心室内部尺寸（LVIDDn和LVIDSn），左心房与主动脉根比率（LA/Ao），左心室分数缩短（LV FS%）。

卡瓦利尔王查尔斯猎犬（CKCS）、杜宾犬（DBM）、大丹犬（GD）。
不同的上标表示组间存在显著差异。N/A = 数据因犬只数量少而不适用。
*表示临床前MMVD与临床MMVD之间比较的P值。

定量组织病理学评估
在定量组织病理学评估中，包括心肌纤维化和脂肪浸润在内的心肌改变主要发生在患有MMVD的犬中，而患有DCM的犬则表现为双侧改变（图1）。

小型犬对照组与大型犬对照组之间的组间比较
小型犬对照组在APM、LV侧壁、PPM和IVS中的纤维化百分比较低（P<0.05），并且APM中的脂肪百分比也低于大型犬对照组（P=0.03）。在其他解剖位置，小型犬对照组与大型犬对照组之间的纤维化或脂肪百分比没有显著差异。在任何解剖位置，小型犬对照组与大型犬对照组之间的LAR也没有显著差异（补充表S2）。

MMVD与小型犬对照组之间的组间比较
临床MMVD犬在LV侧壁和LA中的纤维化百分比较高（图7a和b），以及在PPM和IVS中的脂肪百分比也较高（P<0.05）（图7d和e）。临床MMVD犬与小型犬对照组相比，PPM中的纤维化百分比也较高（P<0.05）（图7c）。患有MMVD的卡瓦利尔王查尔斯猎犬在LA中的脂肪百分比高于其他患有MMVD的小型犬（3.16% [IQR, 1.61–5.98] vs 0.80% [IQR, 0.44–1.08]；P=0.003）。在其他解剖位置，患有MMVD的犬与小型犬对照组之间的纤维化或脂肪百分比没有显著差异（补充表S3、S4和S5），以及CKCS中的MMVD与其他患有MMVD的小型犬之间的其他解剖位置也没有显著差异。在任何解剖位置，患有MMVD的犬与小型犬对照组之间的LAR也没有显著差异（补充表S6）。

图7. 按诊断和疾病阶段划分的患有临床前黏液样二尖瓣疾病（preclin MMVD）的犬、患有临床MMVD（clin MMVD）的犬和小型犬对照组中的纤维化和脂肪百分比。(a) 左心房（LA）中的纤维化。(b) 左心室（LV）侧壁中的纤维化。(c) LV后乳头肌（PPM）中的纤维化。(d) PPM中的脂肪。(e) 室间隔（IVS）中的脂肪。显示了显著成对比较的调整后P值（P）。

DCM与大型犬对照组之间的组间比较
临床DCM犬在LA和RA中的纤维化百分比高于临床前DCM和大型犬对照组（P<0.01）（图8a和b）。临床前DCM犬在RV侧壁中的脂肪百分比高于临床DCM和大型犬对照组（P=0.02）（图8e）。患有DCM和心房颤动的犬在RA中的纤维化百分比高于没有心房颤动的DCM犬（图8c和d）。患有DCM的杜宾犬在RV侧壁中的脂肪百分比高于其他患有DCM的大型犬（2.48% [IQR, 0.82–7.49] vs 0.51% [IQR, 0.33–0.66]；P=0.01）以及RA中的脂肪百分比也高于其他大型犬（15.40% [IQR, 2.48–17.03] vs 2.01% [IQR, 1.23–4.69]；P=0.045）。在其他解剖位置，患有DCM的犬与大型犬对照组之间的纤维化或脂肪百分比没有显著差异（补充表S3、S4和S5）。在任何解剖位置，患有DCM的犬与大型犬对照组之间的LAR也没有显著差异（补充表S6）。

图8. 按诊断和疾病阶段划分的患有临床前扩张型心肌病（preclin DCM）的犬、患有临床DCM（clin DCM）的犬和大型犬对照组中的纤维化和脂肪百分比。(a) 左心房（LA）中的纤维化。(b) 右心房（RA）中的纤维化。(c) 患有DCM和心房颤动（AF）的犬与没有AF的DCM犬之间的LA中的纤维化。(d) 患有DCM和AF的犬与没有AF的DCM犬之间的RA中的纤维化。(e) 右心室（RV）侧壁中的脂肪。显示了显著成对比较的调整后P值（P）。

MMVD与DCM之间的组间比较
临床DCM犬在IVS中的纤维化百分比高于临床MMVD（P<0.05）（补充表S4）。临床前DCM犬在RV侧壁中的脂肪百分比高于临床前MMVD（P=0.01）（补充表S5）。在患有MMVD的狗和患有DCM的狗之间，任何解剖位置的LAR均未观察到显著差异（补充表S6）。线性回归 - MMVD和小型犬对照组：单变量线性回归包括13只小型犬对照组（其中2只狗有超声心动图数据）和27只患有MMVD的狗。左心室侧壁的纤维化百分比、PPM和IVS的纤维化百分比随着年龄的增长而增加。左心房的纤维化百分比随着LVIDDn和LVIDSn的增加而增加。IVS的脂肪百分比随着年龄的增长而增加，并随着LV FS%的增加而减少。调整后的R2值、相应的P值和标准化贝塔系数以热图形式显示在补充图S2中。在多元线性回归中，左心房的纤维化百分比仍然与LVIDDn显著相关（补充图S2）。其他模型未达到统计显著性。

线性回归 - DCM和大型犬对照组：单变量线性回归包括18只大型犬对照组（其中16只狗有超声心动图数据）和16只患有DCM的狗。APM、左心室侧壁和PPM的纤维化百分比随着年龄的增长而增加。IVS的纤维化百分比随着LVIDDn和LVIDSn的增加以及LV FS%的减少而增加。左心房的纤维化百分比随着LA/Ao比率的增加、LVIDDn和LVIDSn的增加以及LV FS%的减少而增加。右心房的纤维化百分比随着体重的增加和LA/Ao比率的增加而增加。左心室和右心室侧壁以及IVS的脂肪百分比随着年龄的增长而增加。APM的LAR随着LV FS%的减少和LVIDSn的增加而减少。其他模型未达到统计显著性。调整后的R2值、相应的P值和标准化贝塔系数以热图形式显示在补充图S3中。在多元线性回归中，APM的纤维化百分比随着年龄的增长而增加。IVS的纤维化百分比随着LVIDSn的增加而增加。左心房的纤维化百分比随着LVIDSn和体重的增加而增加。右心房的纤维化百分比随着LA/Ao比率和体重的增加而增加。右心室侧壁的脂肪百分比随着年龄的增长而增加。APM的LAR随着LVIDSn的增加而减少。其他模型未达到统计显著性。调整后的R2值、相应的P值和标准化贝塔系数以带拟合线的散点图形式显示在补充图S4中。

**定性组织病理学评估：**

**MMVD与小型犬对照组之间的组间比较：**
与小型犬对照组相比，患有MMVD的狗更常见于左心房内膜增厚（P = 0.02）（补充图S5）、PPM和左心房的弥漫性间质纤维化、IVS的局灶性间质纤维化（所有P < 0.05）（补充图S6）以及右心室侧壁的替代/血管周围纤维化（P = 0.01）（补充图S7）。在任何解剖位置，MMVD狗和小型犬对照组之间的脂肪替代程度均未发现统计学上的显著差异（补充图S8）。在PPM（2/26 MMVD）、IVS（1/26 MMVD）、右心房（1/9对照，6/25 MMVD）和左心房（2/24 MMVD）中观察到弱化的波状纤维，MMVD狗和小型犬对照组之间没有显著差异（图9a）。

**DCM与大型犬对照组之间的组间比较：**
与大型犬对照组相比，患有DCM的狗更常见于左心房的弥漫性间质纤维化和弥漫性脂肪替代（两者P < 0.05）（补充图S10和S12）。在任何解剖位置，DCM狗和大型犬对照组之间的内膜增厚和替代/血管周围纤维化均未发现统计学上的显著差异（补充图S9和S11）。在IVS（1/15 DCM）、右心房（2/15对照，3/12 DCM）和左心房（1/14对照，1/13 DCM）中观察到弱化的波状纤维，DCM狗和大型犬对照组之间没有显著差异（图9b）。

**MMVD与DCM之间的组间比较：**
与DCM狗相比，患有MMVD的狗更常见于左心室侧壁的替代纤维化和/或血管周围纤维化（P = 0.02）。与MMVD狗相比，患有DCM的狗更常见于APM的弥漫性间质纤维化（P < 0.01）和左心房的弥漫性脂肪替代（P = 0.01）。

**讨论：**
研究中的狗群的心肌组织病理学发现因心脏位置、疾病类型和疾病严重程度而异。在患有MMVD的狗中，心肌组织病理学改变（包括心肌纤维化和脂肪浸润）主要发生在左侧，而在患有DCM的狗中则表现为双侧改变。心房颤动与DCM狗中更高的心房纤维化百分比相关。弱化的波状纤维未被确定为疾病特异性特征，且各组之间的LAR没有差异。临床MMVD狗的左心室侧壁和PPM中的心肌纤维化百分比更高，PPM和IVS中的脂肪浸润百分比也更高。品种可能影响了脂肪的程度，因为大多数小型犬对照组是比格犬，而大多数临床MMVD狗是CKCS。然而，临床MMVD狗在PPM和IVS中观察到的脂肪百分比相对较低，这与纤维化的程度相比，表明心肌纤维化是该疾病中心脏重塑的更显著特征。由于老化导致的细胞外基质病理重塑可能促进心脏纤维化（Hinderer和Schenke-Layland，2019），并且心肌纤维化在狗和人类中都倾向于随着年龄的增长而变得更加普遍和明显（Lakatta和Levy，2003；Sorrentino等人，2016）。在本研究中，大型犬对照组在左心室的几个区域的心肌纤维化百分比高于小型犬对照组，但它们也比小型犬对照组年龄更大。年龄可能影响了LV组织的纤维化程度，因为MMVD狗明显比小型犬对照组年龄更大，且根据线性回归模型，LV侧壁和PPM中的纤维化百分比随年龄显著增加。但这些关联仅达到边缘显著性，在多元线性回归模型中，包括年龄在内的解释变量均未能与LV侧壁或PPM中的纤维化百分比显著相关。这一发现表明，LV组织中的纤维化程度可能主要受疾病状态的影响，而非年龄。长期增加的LV容积和压力可能导致心肌细胞损伤，甚至心肌细胞死亡（Piek等人，2016）。这一过程由潜在疾病驱动，导致心脏成纤维细胞激活并分化为肌成纤维细胞，这是弥漫性间质纤维化的常见特征（Disertori等人，2017；Hinderer和Schenke-Layland，2019），正如本研究中基于定性组织病理学评估的MMVD狗的PPM所观察到的。此外，在PPM中，与nebulette表达减少相关的等位基因与MMVD有关，可能通过损害乳头肌完整性而导致乳头肌纤维化和二尖瓣功能恶化（Axelsson等人，2021）。

临床DCM狗的IVS中的心肌纤维化百分比高于临床MMVD狗。DCM狗的IVS纤维化百分比随着LVIDSn的增加而增加，但在MMVD狗中则没有。这些发现表明，IVS中的心肌纤维化是DCM中心脏重塑过程的更显著特征。然而，尚不清楚DCM狗中的心肌纤维化是主要的病理特征、疾病进展的结果，还是两者兼有。一种假设是心肌纤维化本身会引发LV收缩功能障碍，最终导致LV扩张（Masci等人，2013；Kong等人，2014；González等人，2018）。细胞外基质的结构改变，由基质金属蛋白酶、它们的组织抑制剂和转化生长因子-β介导，可能促进心肌纤维化的发展（Togashi等人，2007；Ljungvall等人，2011b；Moesgaard等人，2014）。或者，慢性LV容积过载可能导致心肌细胞损伤，随后被纤维组织替代（Janus等人，2015；Piek等人，2016）。

临床MMVD狗的左心房心肌纤维化百分比高于小型犬对照组，而临床DCM狗的左心房心肌纤维化百分比高于临床前DCM狗和大型犬对照组。此外，MMVD狗的左心房内膜增厚更为常见。MMVD狗的左心房纤维化百分比随着LVIDDn的增加而增加，而在DCM狗中则随着LVIDSn和体重的增加而增加。然而，不同品种在体型和体重上存在差异，多元线性回归中观察到的体重效应可能部分反映了品种差异——特别是本研究中使用的杜宾犬比数据集中的其他大型犬体型更小。在MMVD中，瓣膜结构的退化和随时间的LV扩张分别导致原发性和继发性MR，两者都促进了左心房和LV的进行性扩张（H?ggstr?m等人，2004；Ljungvall等人，2011a；Aupperle和Disatian，2012；Fox，2012）。在DCM中，LV收缩功能障碍是一个显著特征，最终导致左心房和LV扩张（Borgarelli等人，2001；Bonagura和Visser，2022）。慢性LV容积增加可能导致左心房广泛受累，由于左心房压力升高，最终导致左心房弥漫性纤维化（H?ggstr?m等人，2004；To等人，2011；Disertori等人，2017；Hinderer和Schenke-Layland，2019）。此外，在MMVD狗中，左心房内膜可能通过增厚来适应压力增加（Cameli和Incampo，2017；Bouwmeester等人，2022）。有趣的是，患有MMVD的CKCS狗的左心房脂肪浸润百分比高于其他小型MMVD狗，表明代谢改变和/或品种特异性变异可能影响CKCS中的心房重塑。这些发现需要在该品种中进行进一步评估。

临床前DCM狗的右心室侧壁脂肪浸润百分比高于临床DCM狗和大型犬对照组，临床前DCM狗的右心室侧壁脂肪浸润百分比也高于临床前MMVD狗。品种可能影响了这些发现，因为所有临床前DCM狗都是杜宾犬。在本研究中，患有DCM的杜宾犬的右心室侧壁和右心房的脂肪百分比高于其他大型犬DCM狗，表明右侧脂肪浸润可能在DCM的病理生理学中起关键作用，或者反映了品种差异和不同于MMVD的疾病背景。在人类心肌病中，特定的纤维化和脂肪浸润组织病理学模式与特定的基因变异相关（Sepehrkhouy等人，2017）。鉴于犬类品种群体的遗传隔离性质，近亲繁殖增加了致病变异的流行率，可以预期会出现类似的基因型特异性组织重塑模式。例如，RNF207和PRKAA2基因的变异与杜宾犬的DCM有关（Niskanen等人，2023）。这些发现需要在更大的狗群体中进行进一步评估。年龄也可能影响这些发现，因为右心室侧壁的脂肪百分比随年龄增加。心肌的脂肪浸润可以通过多种生理或病理机制发生（Anumonwo和Herron，2018）。生理性心肌脂肪倾向于随年龄积累，常见于老年个体的右心室侧壁和右心室流出道（Tansey等人，2005；Kimura等人，2010）。在本研究中，大型犬对照组在APM中的脂肪百分比高于小型犬对照组，但它们也比小型犬对照组年龄更大。病理性的心肌脂肪被认为与心肌内的纤维化同时发生（Kohela和van Rooij，2022年）。在人类中，这一过程被称为纤维-脂肪浸润，这是心律失常性心肌病（AC）患者中常见的特征（Kohela等人，2021年）。类似的特征也在患有扩张型心肌病（DCM）的狗中被报道（Lobo等人，2010年；Vollmar和Aupperle，2016年；Gaar-Humphreys等人，2022年）。在心肌细胞发生萎缩或凋亡的情况下，几种细胞类型——如心肌细胞本身、心脏前体细胞和心外膜细胞——被认为参与了导致纤维-脂肪浸润的转分化过程（d'Amati等人，2000年；Lombardi等人，2016年；Kohela等人，2021年）。其中，心外膜细胞被认为是特别有嫌疑的候选者，因为存在直接的体内和体外证据，而支持其他来源的证据则更为间接或依赖于模型（Suffee等人，2020年；Ernault等人，2021年；Kohela等人，2021年；Kohela和van Rooij，2022年）。此外，与AC相关的基因变异也被认为有助于人类患者的纤维-脂肪浸润（Beffagna等人，2005年；Hariharan等人，2014年）。患有临床DCM的狗在右心房（RA）中的心肌纤维化百分比高于临床前DCM和大品种对照组，且纤维化百分比随着左心房/主动脉（LA/Ao）比率和体重的增加而增加。品种可能影响了纤维化百分比与体重之间的关联，因为本研究中的杜宾犬比其他大品种狗体型更小。有趣的是，患有DCM和心房颤动的狗在心房中的心肌纤维化百分比高于没有心房颤动的DCM狗。心房纤维化低于20%的狗发生心房颤动的风险较低（图8）。在人类中，心房纤维化的发生和发展被认为是结构性心房重塑的标志，这被称为心房心肌病，且纤维化被认为是心房颤动持续存在的基质（Dzeshka等人，2015年）。在每个疾病类别中的一些狗中观察到了心房、室间隔（IVS）和心包膜（PPM）中的弱化波状纤维。然而，在所研究的任何组中，弱化波状纤维的存在没有显著差异。这些发现与先前的研究不符，先前的研究报道在大品种DCM狗的左心室中更频繁地观察到弱化波状纤维（Tilley和Liu，1975年；Tidholm等人，1998年；Alroy等人，2000年；Tidholm和J?nsson，2005年；Lobo等人，2010年）。弱化波状纤维的存在不太可能是对慢性容量负荷和心肌细胞拉伸的反应，因为在没有临床或超声心动图证据的心脏病的新芬兰犬的心肌中也观察到了弱化波状纤维（Tidholm等人，2000年）。然而，本研究中的弱化波状纤维主要出现在薄壁心房中。这些发现可能代表了解剖后的伪影或组织样本处理的结果（Tidholm和J?nsson，2005年）。用于制备载玻片的技术过程可能会产生心肌细胞的人为波状。在本研究中，组织样本在安乐死后30分钟内收集，并特别注意最小化解剖后的伪影。在描述DCM狗中弱化波状纤维表型的先前研究中，没有明确报告安乐死和样本收集之间的时间间隔（Tidholm等人，1998年；Alroy等人，2000年；Tidholm等人，2000年；Sleeper等人，2002年；Lobo等人，2010年；Sykes等人，2021年）。作为动脉狭窄的形态测量指标的LAR在小品种和大品种对照组之间以及疾病组和对照组之间在任何解剖位置上都没有差异。这与临床MMVD狗的发现相反，在临床MMVD狗中，与年龄匹配的对照组相比，左心室（LV）的LAR值显著较低（Falk等人，2006年）。在患有DCM的大品种狗和对照组中，APM的LAR随着左心室内径（LVIDSn）的增加和左心室收缩分数（LV FS%）的降低而降低，尽管这种关联相对较弱。鉴于LVIDSn的增加和LV FS%的降低被认为是DCM中收缩功能障碍和疾病严重程度的指标，这一发现可能表明心室重塑与区域动脉形态之间存在潜在关联。然而，由于没有发现LAR的组间一致差异，本研究没有进一步详细表征血管病理。定量分析的方法学评估表明，大多数观察结果在一致性范围内。在Bland–Altman图的测量极端值处观察到一些变异性；这可能是由于基于手动网格的计数方法本身的局限性，该方法涉及主观解释，而不是方法之间的系统差异。相比之下，QuPath可能提供一个更标准化和可重复的定量分析框架。总的来说，本研究的发现表明QuPath适用于心肌组织样本的定量评估。此外，来自数字病理平台（如QuPath）的定量形态学特征与新兴的病理组学概念一致，其中组织学图像被分析以生成高维形态学数据（Bülow等人，2023年）。通过结合定性观察和标准化的形态测量数据，这项研究可能超越纯粹的描述性发现，提供对疾病机制和进展的更严格的见解。将这些形态学信息与其他组学层面（如基因组学、转录组学或蛋白质组学）整合，可能有助于更全面地理解心脏重塑的生物学机制。本研究存在一些固有的局限性。招募的大多数小品种狗和大品种狗分别是CKCS和杜宾犬，所有临床前DCM狗都是杜宾犬，这可能限制了这一组的异质性。因此，品种特异性变异可能影响了结果，特别是在心肌中的脂肪百分比方面。此外，临床前DCM狗的数量较少，这可能影响了统计功效。与年龄相关的因素可能影响了纤维化和/或脂肪的百分比，因为患有MMVD的狗比小品种对照组年龄更大。本研究中的狗没有关于饮食的信息；因此，无法评估潜在的饮食缺陷。尽管研究中没有包括其他具有临床意义的器官特异性或系统性疾病 的狗，但不能完全排除共病的影响。研究包括较长的采样期和不同的福尔马林固定时间；然而，所有心肌样本都在安乐死后30分钟内用10%中性缓冲福尔马林固定，从而最小化了与组织保存相关的变异性。由于本研究中的分析仅限于形态学组织学变量（心肌细胞、纤维化、脂肪、弱化波状纤维和LAR），因此认为将组织长期储存在福尔马林中是可接受的。福尔马林固定通过蛋白质交联保留了整体组织结构和细胞形态，即使在长时间储存后也能进行组织病理学评估。先前的研究表明，储存多年的组织仍适合进行组织学评估，尽管长时间固定可能会降低染色质量并导致一定程度的组织收缩（Ono等人，2018年；Alrafiah和Alshali，2019年；Likhithaswamy等人，2020年）。值得注意的是，组织在固定后的几天内可能会发生一定程度的收缩。尽管如此，不能完全排除组织处理的影响。本研究缺乏基于大体病理的定量形态测量参数，如绝对心脏重量、心脏重量与体重比、心室壁厚度或室间隔厚度，这些参数本可以提供额外信息。然而，有超声心动图测量数据，可以将心脏尺寸标准化到体重，从而允许不同品种和大小的狗之间进行标准化比较。相比之下，死后心脏测量可能受到心肌松弛、心内压力丧失和组织处理的影响。因此，体内超声心动图评估提供了生理相关和标准化的心脏尺寸指标。尽管每只狗的每个位置只评估了一个样本，但使用系统方法从多个心脏区域进行了广泛的组织学评估，据我们所知，这种方法在患有这些疾病的狗与健康对照组之间尚未描述过。虽然这种方法仍有可能遗漏局部病变，但这代表了组织病理学研究的固有局限性，因为全面采样整个犬类心脏很少可行。然而，研究中的所有狗都使用相同的协议进行了采样、处理和加工。仅进行了Masson三色染色来量化心肌细胞、纤维化和脂肪区域，因为目的是比较这些成分在感兴趣的疾病之间的差异。尽管其他染色方法可以提供进一步的见解，但它们超出了本研究的范围。未来的研究可能需要评估本研究中未涉及的方面。即使软件检测脂肪细胞的能力得到了优化，一些脂肪组织可能仍会被数字图像分析软件遗漏，因为脂肪细胞在组织处理后可能与组织背景相似。然而，所有载玻片都以统一的方式进行了处理和评估。最后，无法控制个别医疗治疗方案对组织病理学变化的潜在影响。总之，心肌组织病理学模式因疾病类型和严重程度而异，支持它们在MMVD和DCM病理生理学中的潜在作用。MMVD中的纤维化主要局限于左心，而在DCM中，纤维化和脂肪浸润影响了左右两侧区域。在患有DCM的狗中，心房颤动与心房纤维化增加相关。弱化波状纤维不常见，也不是疾病特异性的。在LAR中没有发现一致的组间差异，表明现有材料中疾病相关血管重塑的证据有限。总体而言，这些发现提供了特定区域的组织病理学见解，有助于更好地理解疾病相关的心肌重塑。

作者贡献声明：
Erik Axelsson：撰写 – 审阅与编辑、可视化、验证、资金获取。
?sa Ohlsson：撰写 – 审阅与编辑、验证、资源、调查、资金获取、数据管理、概念化。
Talitha C.F. Spanjersberg：撰写 – 审阅与编辑、可视化、验证、软件、方法学、正式分析。
Fredrik S?dersten：撰写 – 审阅与编辑、可视化、验证、监督、软件、资源、方法学、调查、资金获取、正式分析、数据管理、概念化。
Jens H?ggstr?m：撰写 – 审阅与编辑、撰写 – 原稿、可视化、验证、监督、软件、资源、项目管理、方法学、调查、资金获取、正式分析、数据管理、概念化。
Sorawit Phetariyawong：撰写 – 审阅与编辑、撰写 – 原稿、可视化、项目管理、资金获取、正式分析、概念化。
Ingrid Ljungvall：撰写 – 审阅与编辑、撰写 – 原稿、可视化、验证、监督、软件、资源、项目管理、方法学、调查、资金获取、正式分析、数据管理、概念化。
Frank G. van Steenbeek：撰写 – 审阅与编辑、可视化、验证、监督、软件、资源、项目管理、方法学、调查、资金获取、正式分析、数据管理、概念化。
Magdalena Harakalova：撰写 – 审阅与编辑、可视化、验证、监督、软件、资源、方法学、正式分析。

伦理声明：
该研究已获得乌普萨拉和斯德哥尔摩南部动物实验伦理委员会（C103/10、C2/12、C12/15、5.8.18–04682/2020）的批准。

关于生成式AI和AI辅助技术在写作过程中的声明：
在准备手稿期间，作者使用ChatGPT来提高可读性。该工具还根据作者提供的信息生成了图1。所有内容都经过作者的严格审查和编辑，作者对工作的准确性和原创性负全责。

资金声明：
本研究获得了FORMAS基金（2022–01170）和泰国普密蓬·阿杜德王的90岁诞辰纪念基金的资助。