接种疫苗的商业蛋鸡体内重组传染性喉气管炎病毒的亚临床循环

《The Veterinary Journal》：Subclinical circulation of recombinant infectious laryngotracheitis virus in vaccinated commercial layers

　　**天津塔曼娜·穆穆 | 斯蒂芬·W·沃克登-布朗 | 莎拉·威廉姆森 | 普里西拉·F·格伯**
**新英格兰大学环境与农村科学学院，澳大利亚新南威尔士州阿米代尔**

**摘要**
在澳大利亚，观察到在接种减毒ILT疫苗后15至20周内，传染性喉气管炎（ILT）疫情会再次爆发。本研究评估了接种疫苗的商业产蛋鸡在受到强毒株攻击时对ILT病毒（ILTV）感染的易感性。从一家商业养鸡场获取了84只ISA Brown母鸡，这些母鸡的年龄分别为22周、49周和62周（wo），分别对应于接种了4剂、6剂和7剂1类减毒ILT疫苗，以及最后一次接种后的12周、14周和2周（wpv），然后将它们转移到隔离设施中。到达设施后，82%（69/84）的母鸡在鼻孔裂隙拭子中检测出ILTV DNA阳性。检测率（%）和病毒载量（最小二乘平均值±标准误差）在22周龄组最低（71%，4.94 ± 0.61），而在62周龄组最高（93%，7.09 ± 0.42）。对每个年龄组12个拭子进行ILTV分型后发现，22周龄组的所有样本均为1类病毒。令人惊讶的是，在49周龄组中有41.7%的样本检测出与近期澳大利亚疫情相关的类似疫苗的重组株（7b类）。当用9类ILTV进行攻击（n=42）时，这些鸡没有表现出临床症状，22周龄组、49周龄组和62周龄组的样本中分别有53.8%、15.4%和0%的样本呈阳性。研究表明，当前的澳大利亚ILT疫苗接种方案似乎可以预防临床疾病，但免疫保护力会随时间减弱，最早可能在最后一次接种后13周就允许病毒再次感染。野毒株的隐匿传播增加了流行病学风险，这凸显了加强生物安全和开发更有效疫苗的重要性。

**1. 引言**
传染性喉气管炎（ILT）是由ILT病毒（ILTV，Iltovirus gallidalpha1）引起的，是一种高度传染性的急性上呼吸道疾病（Davison等人，2009年；García和Spatz，2020年；ICTV，2024年）。尽管自20世纪30年代以来实施了多种控制策略，ILT仍导致显著的经济损失，包括死亡率高、生产量下降和疫苗接种成本增加（García & Spatz，2020年）。ILT在澳大利亚部分地区呈地方性流行，在维多利亚州和新南威尔士州（NSW）有长达十年的难以控制的疫情，在其他州也有零星爆发（Agnew-Crumpton等人，2016年）。疫情主要通过疫苗接种和严格的生物安全措施来控制。
通过聚合酶链反应和限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）分析，澳大利亚流行的ILTV野毒株和疫苗株被分为十个基因型（1类至10类）（Kirkpatrick、Mahmoudian、O’Rourke等人，2006年）。尽管全基因组测序已被用于ILTV株的分型，但由于成本和技术挑战，其广泛应用受到限制（Asif等人，2022年）。其他方法，包括针对ICP4、胸苷激酶和选定糖蛋白的靶向Sanger测序，也被用于ILTV株的鉴定（Creelan等人，2006年；Ojkic等人，2006年）。然而，PCR-RFLP仍然是最常用的方法，但可能无法检测到重组株。澳大利亚使用的减毒活疫苗来源于鸡胚，包括澳大利亚来源的SA2和A20株（1类），以及欧洲来源的Serva株（7a类）（Sabir等人，2020年）。自2007年将欧洲疫苗引入澳大利亚以来，已证明澳大利亚和欧洲的疫苗株在野外可以重组，产生具有不同致病性的重组株（Lee等人，2012年）。在同一地理区域内不同农场同时使用7类和1类疫苗的疫情中，都检测到了疫苗重组株（Assen等人，2022年）。一些重组株导致了长期疫情，随后消失，例如2009年流行的主要基因型10类ILTV自2014年以来未再被报道（Agnew-Crumpton等人，2016年）。近年来，其他重组株如9类（Lee等人，2012年）和7b类（Sabir等人，2020年）与新南威尔士州和南澳大利亚的重大ILT疫情有关。其中，9类可以通过PCR-RFLP识别，而7b类只能通过测序与7a类区分，这给流行病学调查和疫情控制带来了困难（Sabir等人，2020年）。

目前可用的减毒活疫苗存在局限性，包括在呼吸道和眼部分泌物中终生间歇性排毒（Thilakarathne等人，2020年），这可能由于疫苗在鸟类之间传播时恢复毒力，或者病毒随后传播到未接种疫苗的群体（如肉鸡）而增加疫苗相关疫情的风险（Agnew-Crumpton等人，2016年；Bagust和Johnson，1995年；Garcia，2017年）。这一问题因需要定期为长寿命鸟类重新接种疫苗而加剧，因为澳大利亚的商业产蛋鸡群中通常在接种后15-20周就会发生ILT疫情（Bagust & Johnson，1995年）。减毒活疫苗的保护免疫持续时间差异很大，一些研究表明在受到攻击后保护作用可持续长达60周（Andreasen Jr等人，1989年；Palomino-Tapia等人，2019年），而其他研究则指出在实验条件下保护作用仅持续6至20周（Alls等人，1969年；Churchill，1965年；Gelenczei和Marty，1965年；Raggi和Lee，1965年）。虽然当前的澳大利亚ILT疫苗接种计划可能有效预防临床疾病，但免疫保护力的持续时间和疫苗防止野毒株传播的效果仍不清楚。需要进一步研究来评估现有疫苗接种计划在保护鸟类免受野毒株感染方面的有效性，因为免疫保护的相关机制尚未完全明确。现有证据表明，保护作用主要与细胞介导的免疫反应有关，而局部和系统抗体似乎在保护作用中不起作用（Coppo等人，2013年；Sabir等人，2019年），并且似乎依赖于预先存在的局部免疫力，主要是CD8? T细胞（Beltran等人，2019年；Maekawa等人，2021年；Maekawa等人，2021年；Vagnozzi等人，2016年）。

本研究旨在使用标准行业方法，评估接种了澳大利亚1类鸡胚来源（CEO）减毒ILTV疫苗株（SA2/A20）的产蛋鸡在受到强毒ILTV株攻击时的感染易感性。未包括未接种疫苗的对照组，因为澳大利亚所有商业产蛋鸡都接种了ILT疫苗。在鸟类到达隔离设施后采集的样本的ILTV分型显示，尽管来源农场没有临床症状或呼吸道疾病史，但仍有一部分母鸡携带野毒株（7b类）。本研究实验性地复制了在无临床症状的情况下，用野毒株感染接种疫苗的母鸡的过程。

**2. 材料与方法**
**2.1. 使用的鸟类和来源农场**
从一家采用棚舍系统的澳大利亚商业产蛋鸡场获取了84只ISA Brown产蛋鸡，分为三个不同年龄组（每组28只，分别为22周、49周和62周龄[wo]），并获得了该农场的同意将其用于本研究。选择这些年龄组是为了代表对ILT攻击可能具有高水平、中等水平和低水平免疫力的情况。所有鸟类均来自同一孵化场，并在同一商业农场按照相同的管理、生物安全和疫苗接种程序饲养。在研究前后，无论是研究农场还是同一地理区域的农场都没有记录到呼吸道临床症状或死亡率增加。这些鸟类在22周龄时通过饮用水接种了Poulvac Laryngo A20（Zoetis，澳大利亚）1类CEO ILTV疫苗，62周龄时进行了眼部滴注（图1A）。此外，它们在4周龄时通过饮用水接种了Poulvac Laryngo SA2（Zoetis，澳大利亚），10周龄时也进行了眼部滴注。根据澳大利亚行业标准，22周龄、35周龄和60周龄时通过饮用水进行了加强接种。因此，22周龄的母鸡接种了4次疫苗，49周龄的母鸡接种了6次疫苗，62周龄的母鸡接种了7次疫苗（图1A）。来源农场没有接种Serva（7a类）疫苗。研究过程中提到的年龄组（22周、49周和62周）指的是从农场采集时以及随后转移到隔离设施时的年龄。这些年龄标识在整个实验中作为组别标识符使用。

**2.2. 实验设计和样本采集**
**2.2.1. 使用的鸟类和来源农场**
**2.2.2. 实验设计和样本采集**
鸟类从农场收集后按年龄组分开装笼运输到新英格兰大学PC2隔离设施。每个隔离设施都配备了温度控制的、经过HEPA过滤的空气，温度设定为21°C。实验期间使用16:8的光照周期。隔离设施的地板铺有新鲜松木屑作为垫料。安装了带隔板的巢箱用于产蛋。所有鸟类在整个实验期间都可以自由获取商业饲料和水。从采集到到达隔离设施的时间大约为五小时。到达后立即使用无菌拭子（FLOQ Swabs，COPAN，布雷西亚，意大利）采集鼻孔裂隙拭子，并用腿环标记鸟类。按年龄组顺序处理鸟类，从最年轻的到最年长的。处理后，根据年龄组将母鸡放入相应的隔离设施（每组7只/隔离设施，共28只），并让它们适应七天。之后，每个年龄组的鸟类要么接受9类强毒野毒株的攻击，要么仅接受稀释剂的假接种，从而形成六个处理组。每个年龄组有两个隔离设施的鸟类（n = 14）接受9类株的攻击（攻击组），另外两个隔离设施的相同年龄组的鸟类（n = 14）接受假接种（未攻击组）。22周龄、49周龄和62周龄组的鸟类在攻击时的接种时间分别为13周、15周和3周。
在攻击后第4天和第7天（DPC），从每个处理组随机选取7只鸟进行采样（每个隔离设施3或4只鸟）。采集鼻孔裂隙拭子，并通过CO2吸入法人道处死这些鸟类。在尸检时，收集气管近端段和结膜样本，用10%缓冲福尔马林固定48小时，然后用磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.6）冲洗，并储存在含有0.1%叠氮化钠的PBS中，直至进行常规组织学检查。实验设计总结见图1B。

**2.3. 病毒和接种**
使用强毒ILTV（9类株，NSW/18 B2）作为攻击病毒。该株于2017年在澳大利亚新南威尔士州的一次ILT疫情中分离出来（Groves等人，2019年），并在新英格兰大学进行了扩增（Nazir等人，2020年）。通过眼部滴注（每只眼睛50 μl；25 μl）和气管内注射（100 μl）途径进行攻击，剂量为103 50%组织培养感染剂量（103 TCID50）。未受攻击组的鸟类通过相同途径接受了等量的无菌细胞培养基。

**2.4. 临床症状监测**
ILTV攻击后，每天两次监测鸟类的健康状况、与ILT相关的临床症状和死亡率。根据Kirkpatrick、Mahmoudian、Colson等人（2006年）的描述，并对其进行修改，对每只鸟的临床症状进行了评分。呼吸系统的症状评分标准如下：0（正常呼吸），1（轻度呼吸困难），2（中度呼吸困难并伴有张口呼吸），3（严重呼吸困难并伴有颈部伸展）。眼部症状的评分标准如下：0（正常结膜），1（轻度结膜炎），2（眼睛中度肿胀和/或部分闭合），3（眼睛完全闭合）。整体行为状态的评分标准如下：0（正常），1（轻度抑郁），2（中度抑郁并伴有羽毛蓬乱），3（严重抑郁并伴有厌食和/或自我隔离）。总体临床评分是各单项评分的总和（每只鸟的最高总分为9分）。

2.5. DNA提取和ILTV PCR
将拭子尖端放入含有800 μl PBS的1.5 ml微管中，涡旋10秒。按照制造商的建议，使用ISOLATE II基因组DNA试剂盒（Bioline，Eveleigh，澳大利亚）从200 μl拭子洗液中提取DNA。提取的DNA储存在-20°C环境中直至使用。ILTV糖蛋白C（gC）基因通过实时qPCR进行检测和定量（Callison等人，2007年）。该检测方法无法区分疫苗株和野毒株的ILTV。PCR实验在Rotor-Gene Q qPCR仪器（Qiagen，澳大利亚）的100孔板上进行。病毒拷贝数的绝对定量是基于已知ILTV基因组拷贝数的标准曲线（Nazir等人，2020年）确定的。每次实验中都包含标准品的重复样本。所有实验中，标准曲线的线性（R2）均高于0.99。样本中的病毒DNA载量以log10 ILTV GC/拭子计报告。每个拭子的浓度是通过将每次反应中的病毒载量乘以80（相当于用于PCR的100 μl洗液体积中的5 μl作为模板DNA）然后再乘以4（相当于用于DNA提取的800 μl洗液总体积中的200 μl）来确定的。

2.6. ILTV分型和菌株鉴定
病毒载量高于每次反应4 log10 ILTV拷贝的ILTV样本（这是所用分型方法的最低检测限）被送往Birling实验室（Sydney，NSW）进行分型（Assen等人，2022年）。使用了两种PCR反应混合物：Mix A含有扩增ICP4基因两个区域的引物，这些区域存在小插入/缺失；Mix B含有针对ICP4基因的第三个区域TK基因以及ICP18.5基因两个区域的引物，这些区域都含有用于分类等位基因的Hae III限制性位点。Mix A和Mix B中存在的等位基因组合可以分出1型、7型和9型，但无法区分7a型（疫苗株）和7b型（野毒株）。初步的PCR分型假设只有1型和9型存在，因此仅使用Mix A进行分型。在未接种过7型疫苗的鸟类中检测到疑似9型病毒后，进一步使用基于扩增子的下一代测序（NGS）进行了检测，从而确认了一些样本中存在7b型野毒株。大约三分之一的ILTV基因组使用AmpliSeq Custom Panel（ThermoFisher，澳大利亚）在Ion S5测序仪（ThermoFisher）上进行了基于扩增子的NGS分析。将Ion S5输出BAM文件与1型、9型、7a型和7b型的基因组（Genebank登录号JN596963、JN804827、HQ630064、MN335811）进行比对，并使用Geneious Prime? 2023软件进行后续单核苷酸多态性（SNP）检测，从而将样本分类为1型、7a型、7b型或9型。进一步使用Mix B进行分型后，可以将一些未能通过NGS分型的样本分类为1型、7a/b型或9型，因此将这部分样本假设为7b型。这种菌株分类基于确认来源农场未接种过Serva（7a型）疫苗，以及基于部分样本的扩增子NGS结果，这些结果显示只有野毒株7b型。

2.7. 组织学检查
气管和结膜组织切片常规进行组织病理学处理，并根据Guy等人（1990年）的标准对病理变化进行评分。气管切片的评分范围从0（正常）到5（严重），依据白细胞浸润程度、细胞内含体、合胞体形成、上皮脱落、上皮增生改变等情况。结膜的组织学评分依据Nazir等人（2020年）的标准进行，评估指标包括白细胞浸润程度、合胞体形成、出血、坏死和上皮脱落情况，评分范围从0（正常）到3（严重）。

2.8. 数据分析
使用JMP软件版本16（SAS Institute，Cary，NC，美国）进行数据探索、验证和分析。在分析前，病毒载量数据经过对数转换（log10 ILTV GC + 1）。连续变量以最小二乘均值±标准误差（LSM ± SE）表示。为了研究挑战后时间和挑战对拭子中ILTV GC载量的影响，使用了混合效应模型，其中年龄组、挑战状态、DPC及其交互作用作为固定效应，隔离器和鸟类作为随机效应。离散数据（挑战后对ILTV 9型的阳性或阴性结果）使用列联表分析，独立性采用Pearson卡方检验进行评估。离散结果（挑战后是否存在ILTV 9型）也使用列联表分析，并采用Fisher精确检验，以挑战后的ILTV状态（ILTV阳性 vs ILTV阴性）作为因变量。整个研究过程中采用的显著性水平为P < 0.05。使用GraphPad Prism（版本8.0）制作图表。

3. 结果
3.1. 试验期间未观察到与ILT相关的临床症状、尸检或组织学发现
在整个研究期间，任何年龄组的鸟类均未观察到表明ILT的临床症状。在84只鸟类中，有3只死亡（3.57%），其中1只是出于福利原因被安乐死。所有鸟类都进行了尸检以确定死因。病变与腹腔的广泛细菌感染有关（n = 2），或者未发现病变（n = 1）。此外，在任何鸟类的结膜和气管中均未检测到ILT特征性的组织病理学病变。因此，所有鸟类的临床评分为0，结膜和气管中ILT特异性病变的组织病理学评分为0。

3.2. 鸟类到达隔离器时的ILTV状态
到达隔离器时，82%（69/84）的鸟类在鼻孔拭子中ILTV DNA检测呈阳性。ILTV DNA检测率和载量最低的是22周龄的母鸡（71%，LSM log10 ILTV拷贝/拭子 ± SE，4.94 ± 0.61），而最高的是62周龄的母鸡（93%，7.09 ± 0.42）（P = 0.01）（图2A）。

3.3. 挑战后的ILTV状态
在9型病毒挑战之前，对ILTV DNA阳性的样本进行了分型（每个年龄组12个样本；每个隔离器3只鸟类）。使用两种PCR反应混合物：Mix A含有扩增ICP4基因两个区域的引物，这些区域有小的插入/缺失；Mix B含有针对ICP4基因的第三个区域TK基因以及ICP18.5基因两个区域的引物，这些区域都含有用于分类等位基因的Hae III限制性位点。Mix A和Mix B中存在的等位基因组合可以分出1型、7型和9型，但无法区分7a型（疫苗株）和7b型（野毒株）。初步的PCR分型假设只有1型和9型存在，因此仅使用Mix A进行分型。在未接种过9型疫苗的鸟类中检测到疑似9型病毒后，进一步使用基于扩增子的下一代测序（NGS）进行了检测，从而确认了一些样本中存在7b型野毒株。大约三分之一的ILTV基因组使用AmpliSeq Custom Panel（ThermoFisher，澳大利亚）在Ion S5测序仪（ThermoFisher）上进行了基于扩增子的NGS分析。将Ion S5输出BAM文件与1型、9型、7a型和7b型的基因组（Genebank登录号JN596963、JN804827、HQ630064、MN335811）进行比对，并使用Geneious Prime? 2023软件进行后续单核苷酸多态性（SNP）检测，从而将样本分类为1型、7a型、7b型或9型。进一步使用Mix B进行分型后，可以将一些未能通过NGS分型的样本分类为1型、7a/b型或9型，因此将这部分被定义为7a/b型的样本假设为7b型。这种菌株分类基于确认来源农场未接种过Serva（7a型）疫苗，以及基于部分样本的扩增子NGS结果，这些结果显示只有野毒株7b型。

3.4. 组织学检查
气管和结膜组织切片常规进行组织病理学处理，并根据病理变化进行评分。气管切片的评分范围从0（正常）到5（严重），依据白细胞浸润程度、细胞内含体、合胞体形成、上皮脱落、上皮增生改变等情况（Guy等人，1990年）。结膜的组织学评分依据Nazir等人（2020年）的标准进行，评估指标包括白细胞浸润程度、合胞体形成、出血、坏死和上皮脱落情况，评分范围从0（正常）到3（严重）。

3.5. 数据分析
使用JMP软件版本16（SAS Institute，Cary，NC，美国）进行数据探索、验证和分析。病毒载量数据在分析前进行了对数转换（log10 ILTV GC + 1）。连续变量以最小二乘均值±标准误差（LSM ± SE）表示。为了研究挑战和挑战后时间对拭子中ILTV GC载量的影响，使用了混合效应模型，其中年龄组、挑战状态、DPC及其交互作用作为固定效应，隔离器和鸟类作为随机效应。离散数据（挑战后对ILTV 9型的阳性或阴性结果）使用列联表分析，独立性采用Pearson卡方检验进行评估。离散结果（挑战后是否存在ILTV 9型）也使用列联表分析，并采用Fisher精确检验，以挑战后的ILTV状态（ILTV阳性 vs ILTV阴性）作为因变量。整个研究过程中采用的显著性水平为P < 0.05。使用GraphPad Prism（版本8.0）制作图表。

3.6. 试验期间未观察到与ILT相关的临床症状、尸检或组织学发现
在整个研究期间，任何年龄组的鸟类均未观察到表明ILT的临床症状。在84只鸟类中，有3只死亡（3.57%），其中1只是出于福利原因被安乐死。所有鸟类都进行了尸检以确定死因。病变与腹腔的广泛细菌感染有关（n = 2），或者未发现病变（n = 1）。此外，在任何鸟类的结膜和气管中均未检测到ILT特征性的组织病理学病变。因此，所有鸟类的临床评分为0，结膜和气管中ILT特异性病变的组织病理学评分为0。

3.7. 鸟类到达隔离器时的ILTV状态
到达隔离器时，82%（69/84）的鸟类在鼻孔拭子中ILTV DNA检测呈阳性。ILTV DNA检测率和载量最低的是22周龄的母鸡（71%，LSM log10 ILTV拷贝/拭子 ± SE，4.94 ± 0.61），而最高的是62周龄的母鸡（93%，7.09 ± 0.42）（P = 0.01）（图2A）。

3.8. ILTV分型和菌株鉴定
病毒载量高于每次反应4 log10 ILTV拷贝的ILTV样本（这是所用分型方法的最低检测限）被送往Birling实验室（Sydney，NSW）进行分型（Assen等人，2022年）。使用了两种PCR反应混合物：Briefly Mix A含有扩增ICP4基因两个区域的引物，这些区域有小的插入/缺失；Mix B含有针对ICP4基因的第三个区域TK基因以及ICP18.5基因两个区域的引物，这些区域都含有用于分类等位基因的Hae III限制性位点。Mix A和Mix B中存在的等位基因组合可以分出1型、7型和9型，但无法区分7a型（疫苗株）和7b型（野毒株）。初步的PCR分型假设只有1型和9型存在，因此仅使用Mix A进行分型。在未接种过9型疫苗的鸟类中检测到疑似9型病毒后，进一步使用基于扩增子的下一代测序（NGS）进行了检测，从而确认了一些样本中存在7b型野毒株。大约三分之一的ILTV基因组使用AmpliSeq Custom Panel（ThermoFisher，澳大利亚）在Ion S5测序仪（ThermoFisher）上进行了基于扩增子的NGS分析。将Ion S5输出BAM文件与1型、9型、7a型和7b型的基因组（Genebank登录号JN596963、JN804827、HQ630064、MN335811）进行比对，并使用Geneious Prime? 2023软件进行后续单核苷酸多态性（SNP）检测，从而将样本分类为1型、7a型、7b型或9型。进一步使用Mix B进行分型后，可以将一些未能通过NGS分型的样本分类为1型、7a/b型或9型，因此将这部分被定义为7a/b型的样本假设为7b型。这种菌株分类基于确认来源农场未接种过Serva（7a型）疫苗，以及基于部分样本的扩增子NGS结果，这些结果显示只有野毒株7b型。

3.9. 挑战后的ILTV状态
在9型ILTV挑战之后，挑战组和未挑战组之间的ILTV DNA载量没有差异（图3A-3C，22周龄（P = 0.14）、49周龄（P = 0.07）和62周龄（P = 0.57）的鸟类）。DPC 4和DPC 7时的ILTV基因组载量也没有差异（7.27 ± 0.32和6.69 ± 0.34，P = 0.16）。处理组与DPC之间的交互作用也不显著（P = 0.92）。

3.10. 分析结果
使用JMP软件版本16（SAS Institute，Cary，NC，美国）进行数据探索、验证和分析。病毒载量数据在分析前进行了对数转换（log10 ILTV GC + 1）。连续变量以最小二乘均值±标准误差（LSM ± SE）表示。为了研究挑战和挑战后时间对拭子中ILTV GC载量的影响，使用了混合效应模型，其中年龄组、挑战状态、DPC及其交互作用作为固定效应，隔离器和鸟类作为随机效应。离散数据（挑战后对ILTV 9型的阳性或阴性结果）使用列联表分析，独立性采用Pearson卡方检验进行评估。离散结果（挑战后是否存在ILTV 9型）也使用列联表分析，并采用Fisher精确检验，以挑战后的ILTV状态（ILTV阳性 vs ILTV阴性）作为因变量。整个研究过程中采用的显著性水平为P < 0.05。使用GraphPad Prism（版本8.0）制作图表。在62周龄组（图4C）中，ILTV类别没有发生变化；8只（8/10）在挑战前后始终被归类为第1类，2只（2/10）被归类为第7b类。DPC-7和DPC 4/7之间ILTV菌株状态的转变总结在表2中。表2. 仅限受挑战鸟类的DPC-7和DPC 4/7之间ILTV菌株状态转变的总结。行表示DPC-7时的菌株状态，列表示DPC 4/7时的菌株状态。数值代表每个转变类别中的鸟类数量。

DPC-7 DPC 4/7
阴性 第1类 第7b类 第9类 混合 总计
阴性 11 0 6 0 8
第10类 19 13 12 4
第7b类 0 0 3 0 0
混合 0 0 10 0 1
总计 12 0 5 9 13 6

在DPC 4/7时，ILTV阴性鸟和ILTV阳性鸟之间的第9类检测结果存在差异。具体来说，到达时ILTV阴性的6只鸟中有6只（75.0%）在DPC 4/7时被归类为第9类，而到达时ILTV阳性的28只鸟中有3只（10.7%）被归类为第9类（P = 0.001）（表2）。在DPC-7时排出ILTV的鸟类中，第9类的检测率在排出第1类的鸟类中为3/24（12.5%），而在排出第7b类的鸟类中为0/3（表2）。

年龄组对挑战后鼻孔拭子中第9类的检测有显著影响（P = 0.007）（表1）。年龄的影响与接种的疫苗次数和最后一次接种后的时间有关。在挑战时已经接种了四次疫苗并且距离最后一次接种13周的22周龄组，其鼻孔拭子中第9类的检测率最高。

4. 讨论

本研究评估了当前澳大利亚行业疫苗接种计划在受澳大利亚第9类野外菌株挑战后保护产蛋鸡免受感染的效果。尽管没有临床症状，但在实验设施到达时，22%的测试鸟类中检测到了第7b类野外菌株。在接种第9类菌株后进行实验性感染后，距离最后一次接种13周的22周龄组鸟类在鼻孔裂隙拭子中的病毒检测率最高，而距离最后一次接种3周的62周龄组鸟类中没有感染。这些关于商业接种鸟类在野外和实验条件下检测到ILTV野外菌株的观察结果表明，当前的疫苗接种方案可能能够在几周内保护鸟类免受疾病的影响，但对野外菌株感染的防护作用会较早减弱。

在本研究中，当鸟类到达时，超过70%的鸡在最后一次接种后超过12周的时间内检测到了中等至高水平的ILTV DNA，这是出乎意料的。已知ILTV疫苗菌株可以导致终生潜伏，尤其是在应激事件后，临床正常的鸟类会间歇性地排出病毒（Bagust等人，1986年；Hughes等人，1991年）。将鸟类运输到实验设施可能会引发ILTV的再激活和排出；然而，考虑到本研究从采集鸟类到采样之间的时间较短（大约5小时），这令人惊讶。所有8只（9.52%）在到达隔离器时ILTV DNA阴性的鸟类在接种第9类菌株后都变成了阳性，尽管在接种后ILTV DNA阳性的鸟类中鼻孔拭子中的ILTV DNA载量没有进一步增加。先前的研究报道，在接种SA2（11/20只鸟类ILTV阳性，log10平均基因组拷贝数为2.53 ± 0.30）或A20（5/20，2.35 ± 0.13）后20-21天内，ILTV DNA阳性的鸟类比例较低（Thilakarathne等人，2019年）。虽然不能完全排除残留接种物的可能性，但在挑战后4天和7天检测到第9类菌株，主要出现在22周龄组中，而不是62周龄组中，这更符合感染的情况，而不是鼻孔裂隙中的短暂接种物残留，后者预计在1-2天内会被清除。

尽管受到了第9类菌株的挑战，但在本研究中，没有任何鸟类表现出ILT的临床症状，这可能表明疫苗对疾病具有临床保护作用，尽管缺乏未接种疫苗的对照组，因此无法明确证明临床保护效果。这些发现与Hughes等人（1991年）的研究结果一致，他们发现CEO ILTV疫苗可以保护鸟类免受挑战后的临床症状，但无法阻止病毒排出。然而，Assen等人（2023年）的研究表明，接种CEO疫苗的鸟类得到了很好的保护，没有表现出临床症状，并且防止了病毒载量的增加。相反，多项研究表明接种CEO疫苗的鸟类得到了很好的保护，没有表现出临床症状，并且阻止了病毒复制，这通过气管中不存在病毒基因组和抗原得到证实（Garcia等人，2016年；Johnson等人，2010年；Maekawa等人，2019年；Maekawa等人，2021年；Palomino-Tapia等人，2019年；Vagnozzi等人，2012年）。这些研究使用的是美国CEO疫苗，该疫苗可以在挑战后提供完全的防止病毒排出的保护（Maekawa等人，2021年）。在澳大利亚使用的CEO疫苗不能完全防止挑战后的ILTV排出（Korsa等人，2015年；Lee等人，2014年）。据报道，受感染的鸟类可以排出疫苗和挑战菌株（Yegoraw等人，2021年；Yegoraw等人，2020年）。尽管如此，Assen等人（2023年）认为，在ILTV挑战后观察到的ILTV载量增加和阳性鸟类比例更可能是由于感染了挑战病毒，而不是疫苗菌株的复制。

本研究中在没有ILT临床症状的情况下检测到第7b类野外菌株，证实了这种菌株在商业鸡群中的亚临床传播。我们小组之前的研究也在未接种疫苗的肉鸡场爆发期间检测到了亚临床ILTV野外菌株（Assen等人，2022年）。在所研究的农场中检测到第7b类菌株是出乎意料的，因为该地区之前没有报告过ILTV爆发，而且通常使用的是SA2/A20疫苗。新南威尔士州之前的一次爆发与引入Serva疫苗（第7a类）有关，而该地区通常只使用SA2/A20菌株（第1类）（Assen等人，2022年），两种疫苗菌株的共感染导致了重组事件和第7b类的出现（Lee等人，2012年；Sabir等人，2020年）。然而，目前尚不清楚在我们研究期间，研究农场附近的农场是否使用了Serva疫苗，以及第7a类疫苗菌株是否传播到了使用第1类疫苗的农场，从而导致该地区出现了第7b类菌株，或者第7b类菌株是从其他地方悄悄传入的。悄悄传播的野外菌株可能通过鸟类之间的传播而在易感群体中增强毒力（Guy等人，1991年；Lee等人，2012年）。一只最初排出ILTV第1类的49周龄鸡在接种第9类菌株后变成了第7b类阳性，这表明共感染鸟类中的不同菌株可能在不同的时间重新激活，或者在第7b类的水平传播可能发生在隔离器中。本研究和其他研究中也报告了多种ILTV菌株的同时排出（Blacker等人，2011年；Fakhri等人，2020年；Loncoman等人，2017年），这可能增加了商业农场中出现新的ILTV重组菌株的可能性。进一步的野外重组菌株重组产生了目前在澳大利亚占主导地位的ILTV第7b类，它似乎是第7a类、8类和9类的重组体，而之前第10类似乎是第7a类、1类和2类病毒之间的重组体（Agnew-Crumpton等人，2016年；Sabir等人，2020年）。

有趣的是，年轻的鸟类（22周龄组）显示出最高的第9类检测率，而最老的鸟类（62周龄组）没有感染的证据。这可能归因于年龄、距离最后一次接种的时间、接种次数较少或这些因素对第9类感染易感性的综合影响。值得注意的是，22周龄组在挑战时距离最后一次接种13周，而62周龄组距离最后一次接种3周。需要注意的是，不同年龄组之间的感染抵抗力相关因素（例如距离最后一次接种的时间和接种次数）并不一致，这代表了本研究的局限性，需要进一步研究。此外，本研究中没有测量抗ILTV的抗体，这有助于证明受挑战的鸟类已经得到了适当的接种。早期研究发现，SA2和A20疫苗可以帮助控制由第9类ILTV引起的ILT；但它们提供的保护是非彻底的，不能防止挑战病毒的复制，这可能解释了商业鸡群中第9类感染的持续存在（Korsa等人，2015年）。此外，接种次数也可能导致了这些差异，因为22周龄组接受了四次接种，而62周龄组接受了七次接种。

我们研究的结果表明，目前使用多次眼药滴剂和饮用水接种的野外疫苗接种可能可以防止ILTV的临床表现（临床症状和组织病理学病变），但可能不能完全防止ILTV野外菌株的感染。开发更有效的替代ILTV疫苗和改进接种策略对于防止野外菌株在商业鸡群中的重组和传播至关重要。常规监测和ILTV分型是ILT爆发根除计划的关键组成部分（Assen等人，2022年），可以实时评估各种控制措施的有效性并降低相关成本。然而，分型和区分菌株的过程仍然具有挑战性，因为它成本高昂、耗时且在野外条件下不切实际。本研究的局限性包括缺乏未接种疫苗的对照组，无法确定鸡只是否接受了适当的接种，因为它们是在农场接种的，同时年龄与接种次数和距离最后一次接种的周数之间存在混淆。此外，在挑战前在一部分鸟类中检测到第7b类菌株是一个混淆因素，因为它也可能影响了宿主对挑战的反应。在商业生产条件下检测到第7b类ILTV可能反映了暴露情况，因为感染可以通过间接途径发生，包括饲料输送、鸡蛋收集和服务人员以及常规农场操作。观察到的免疫反应可能不仅仅归因于接种，也不能排除之前接触过第7b类ILTV的可能性。

值得注意的是，本研究中使用的挑战模型在研究前后通过多次应用得到了验证，始终产生了中度至严重的疾病症状，包括在ISA Brown产蛋鸡中（Assen等人，2023年；Tran等人，2024年；Yegoraw等人，2020年）。未来的研究应包括未接种疫苗且年龄匹配的鸟类作为对照组，以评估挑战菌株的毒力以及适当的挑战模型，尽管在隔离器中长期维持未接种疫苗的鸟类的后勤限制可能使这变得不可行。

在临床正常的接种疫苗的鸡只中检测到中等至高水平的疫苗和野外ILTV菌株对鸡群管理具有重要意义。持续的病毒排出可能导致ILTV在鸡群内的维持，并增加传播到其他鸡群的风险，包括未接种疫苗或部分接种疫苗的鸡群。野外研究表明，ILTV可以传播到未接种疫苗的肉鸡场。Agnew-Crumpton等人（2016年）报告了在接种疫苗的产蛋鸡场附近的未接种疫苗的肉鸡场中发生了爆发，而在受影响场所清空后，在附近的肉鸡场又发现了更多病例。这些发现强调了加强生物安全措施的重要性，包括严格控制人员和设备的移动，以及有针对性的分子监测和菌株分型，以检测ILTV野外病毒的悄悄传播。此外，定期评估接种时间和接种方式，特别是在长寿鸟类中，可能有助于减少感染易感期，同时保持临床保护。由于传染性法氏囊病（ILTV）的再激活和病毒排毒可能受到压力的影响，包括与产蛋开始相关的生理变化，因此采取减少处理、运输和环境压力的管理措施可以进一步降低接种疫苗的鸡群中的病毒排毒量。ILTV在澳大利亚是一种需报告的疾病，当检测到野毒株时，应寻求官方兽医的建议。其他国家可用的灭活疫苗或亚单位疫苗应考虑在澳大利亚获得批准和使用，以解决当前ILTV减毒疫苗存在的安全问题。总之，这项研究揭示了当前澳大利亚ILTV疫苗接种方案在抑制商业鸟类中野毒株感染方面的局限性，这些情况既在自然环境中观察到，也在实验中得到验证。接种疫苗的鸟类中多种ILTV毒株的排毒增加了病毒传播给未受保护鸟类的风险，并增加了病毒进一步重组的可能性，这可能导致更具毒力的毒株出现，从而对ILTV在野外的传播和控制产生重大影响。这些发现强调了持续监测ILTV疫苗效力、定期监测和实施严格的生物安全措施以及开发能够诱导无菌免疫的ILTV疫苗接种策略的必要性。

**未引用的参考文献**（Andreasen等人，1989年；ICTV，2024年；Kirkpatrick等人，2006年）

**资金支持**
本研究由澳大利亚研究委员会的Discovery Early Career Award资助计划（项目编号DE200101832，PFG）提供支持。TTM获得了新英格兰大学（UNE，阿米代尔，澳大利亚）的国际研究生研究奖（IPRA）奖学金，以支持其博士研究项目。

**伦理声明**
本研究获得了新英格兰大学动物伦理委员会的批准（批准编号ARA22-053），并按照动物伦理指南和批准的方案进行。在将鸟类纳入本研究之前，已从商业农场所有者处获得了知情同意。

**作者贡献声明**
- Tanjin Tamanna Mumu：撰写、审稿与编辑、原始稿撰写、数据可视化、软件使用、调查、数据分析、数据管理
- Stephen W. Walkden-Brown：撰写、审稿与编辑、验证、软件使用、数据分析、数据管理
- Sarah Williamson：软件使用、资源提供、数据分析
- Priscilla F. Gerber：撰写、审稿与编辑、验证、监督、资源提供、项目管理、方法学设计、调查、资金获取、数据分析、概念化

**关于写作过程中生成式AI和AI辅助技术的声明**
在准备本工作时，作者使用了Grammarly工具来改进手稿的语法、拼写和可读性。作者根据需要对手稿进行了审稿和编辑，并对其内容负全责。