马锥虫（Trypanosoma equiperdum）的体外培养：体外抗原与体内抗原的比较，以实现Dourine病的伦理和可持续血清学诊断

《Veterinary Parasitology》：In vitro cultivation of Trypanosoma equiperdum: comparison of in vitro and in vivo antigens for an ethical and sustainable serological diagnosis of Dourine

　　吉塞拉·阿米洛塔（Gisella Armillotta）| 萨拉·卡皮斯塔（Sara Capista）| 迪亚曼特·罗多蒙蒂（Diamante Rodomonti）| 萨拉·特拉伊尼（Sara Traini）| 莉莉亚·泰斯塔（Lilia Testa）| 安娜·塞罗尼（Anna Serroni）| 卡特琳娜·拉瓜迪亚（Caterina Laguardia）| 克里斯蒂亚诺·帕卢奇（Cristiano Palucci）| 奇亚拉·迪·潘克拉齐奥（Chiara Di Pancrazio）| 蒂齐亚娜·迪·费博（Tiziana Di Febo）| 奥诺里娜·普利埃利（Onorina Puglielli）| 加埃塔诺·费德里科·龙基（Gaetano Federico Ronchi）| 玛里亚安杰拉·伊奥里奥（Mariangela Iorio）| 弗朗切斯卡·帕罗利尼（Francesca Parolini）| 埃马努埃拉·罗西（Emanuela Rossi）| 萨拉·法尼（Sara Fanì）| 安娜皮亚·迪·詹纳罗（Annapia Di Gennaro）| 法布里齐亚·佩莱塔（Fabrizia Perletta）| 安娜·丽塔·纳塔利（Anna Rita Natali）| 罗莫洛·萨利尼（Romolo Salini）| 玛丽亚·特蕾莎·梅尔坎特（Maria Teresa Mercante）
意大利阿布鲁佐和莫利塞省实验动物卫生研究所（Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell’Abruzzo e del Molise），泰拉莫（Teramo）

**摘要**
原生动物**Trypanosoma equiperdum**是导致**Dourine**的病原体，这是一种通过性传播的传染病，可表现为慢性或急性形式。Dourine具有严重的兽医和经济影响，因为目前没有可用的疫苗进行预防，而且疾病的管理需要扑杀受感染的动物，并采取严格的卫生控制措施。本研究比较了传统的体内培养T. equiperdum抗原的方法与一种体外培养方法，后者旨在消除对动物的使用。通过补体结合试验（Complement Fixation Test, CFT）和间接荧光抗体试验（Indirect Fluorescent Antibody Test, IFAT）等血清学诊断方法，评估了这两种方法在Dourine诊断中的效果。这些方法的验证遵循了世界动物卫生组织（WOAH）《陆地动物诊断测试和疫苗手册》中规定的原则和程序，以评估其诊断性能和伦理可持续性。结果表明，体外抗原的敏感性和特异性与体内抗原相当。精确度参数证实了这些测试的可靠性，重复性和再现性均达到100%的一致性。IFAT与CFT表现出极好的一致性，表明其作为根除计划中的确认测试具有潜力。体外生产系统显著降低了与动物饲养和感染相关的生物安全风险和物流限制。这种方法符合3R原则（替代、优化和减少），为抗原生产提供了可持续的替代方案，并支持更符合伦理的动物管理，促进动物福利和可持续的兽医诊断实践。

**引言**
**Trypanosoma equiperdum**是导致Dourine的病原体，这是一种慢性或急性的传染病，主要通过交配在动物之间直接传播（世界动物卫生组织，2021a）。与其他锥虫（如**T. brucei**和**T. congolense**不同，后者依赖采采蝇作为传播媒介（Brun等人，1998）。这种独特的传播方式具有重要的流行病学意义，因为它将疾病传播限制在发生繁殖交流的马群和地区，而不受媒介生态的影响。**T. equiperdum**是一种属于**Trypanosomatida**目、**Trypanosomatidae**科和**Trypanozoon**亚属的鞭毛虫。该寄生虫存在于受感染动物的精液、阴道分泌物和生殖组织中，随后在组织中扩散并进入淋巴系统和血液系统，引起低程度和短期的寄生虫血症（Theis和Bolton，1980）。感染过程分为三个阶段：初始的生殖阶段，特征是水肿和黏液脓性分泌物；皮肤阶段，表现为圆形荨麻疹斑块（“银元”病变）；以及神经阶段，伴随协调障碍、瘫痪和逐渐消瘦。最近的系统发育研究表明，**T. equiperdum**和**T. evansi**实际上是**T. brucei**的亚种（Zablotskij等人，2003）。这种遗传亲缘关系支持了**T. equiperdum**可能从**T. brucei**祖先演化而来并通过失去动质体DNA大环而适应性传播模式的假设。然而，更新的基因组分析进一步细化了这一观点，指出**T. equiperdum**的分类具有多系統性质（Carnes等人，2015；Luke?等人，2022）。这种“单系性的终结”对诊断工具的开发和验证具有重要意义。正如（Oldrieve等人，2021）所展示的，调和Dourine和surra这两种疾病的重叠系统发育特征仍是一个重大挑战；缺乏独特的遗传标识使得难以找到同时适用于所有**T. equiperdum**菌株并对**T. brucei**和**T. evansi**具有特异性的标记。

**疾病的严重程度和持续时间差异很大**，尽管该疾病通常是致命的，但有时也会自发治愈，之后动物可能成为潜伏携带者。潜伏感染对疾病控制构成重大挑战，因为无症状的公马可能长期排出寄生虫，导致在繁殖网络中不知不觉地传播疾病。诊断主要基于临床症状，但必须始终通过血清学检测进行确认。Dourine是一种影响马、骡子和驴的传染性疾病，后者通常比马更具抵抗力，并且经常作为无症状携带者（Gizaw等人，2017）。除了受感染的马之外，尚未发现其他自然寄生虫宿主。然而，狗、兔子、小鼠和大鼠容易受到实验性感染。后者可以用于分离**T. equiperdum**并维持用于诊断测试的抗原株（Pascucci等人，2013）。然而，使用动物进行体内抗原生产不可避免地会导致生物变异性，从而影响抗原生产的标准化（Bassarak等人，2016；Voelkl等人，2020）。此外，使用动物还引发了重大的伦理和生物安全问题。近几十年来，包括欧盟指令2010/63/EU（2010）和意大利第26/2014号立法法令在内的国际和国家立法加强了在动物实验中强制应用3R原则（替代、优化和减少）（Russell William和Burch Rex，1960）。意大利通过定向资助（第8/2020号法律）和2022年8月24日的部际法令进一步支持向无动物替代方法的过渡，为阿布鲁佐和莫利塞省实验动物卫生研究所（IZSAM）提供了资源，以开发符合卫生部伦理标准的体外**T. equiperdum**抗原生产方法。

**直接检测病原体**可以通过对阴茎头、包皮和尿道窝采集的拭子进行聚合酶链反应（PCR）等生物分子测试。然而，唯一有效的预防措施是通过补体结合试验（CFT）和间接荧光抗体试验（IFAT）对所有用于公共繁殖的公马进行血清学监测，以检测抗体。这些血清学检测是全球Dourine监测的基石，能够早期发现和监测受感染或携带动物，从而支持官方控制计划。这些分析需要足够的**T. equiperdum**抗原量。

本研究根据世界动物卫生组织《陆地动物诊断测试和疫苗手册》第1.1.6章的要求，旨在评估和比较两种官方Dourine诊断方法（CFT和IFAT）的性能，使用的抗原分别通过传统的体内培养和新型的体外培养方法生产（世界动物卫生组织，2023）。通过评估分析灵敏度、诊断灵敏度和特异性等关键参数以及重复性和再现性等精确度指标，本研究旨在提供科学依据，支持用体外系统替代基于动物的抗原生产，确保技术等效性和伦理进步。验证这些检测方法不仅对于确保Dourine疾病监测和根除计划的可靠性和连续性至关重要，也有助于推动向无动物诊断方法的广泛过渡，符合3R原则（替代、优化和减少）。

**部分内容**
**用于抗原生产和体外培养接种的T. equiperdum OVI菌株的体内和体外扩增**
**T. equiperdum**的体内生产按照世界动物卫生组织手册中的协议（第3.6.3章，第2.1.1.2节）进行。选择差异离心法分离锥虫。共有50只Sprague Dawley大鼠（退役繁殖用）作为寄生虫繁殖的宿主（世界动物卫生组织，2021a）。两只起始动物腹腔内接种了含有5.6 × 10^7个**T. equiperdum OVI**菌株的0.5毫升液体。

**从48只大鼠的采血中获得了700毫升含柠檬酸钠的血液溶液。处理其中650毫升后，得到8.3毫升的细胞浆，并与16.7毫升5%聚乙烯吡咯烷酮（PVP）溶液混合。所得25毫升的**T. equiperdum**体内抗原被分装到3毫升的小瓶中，每瓶含0.5毫升，然后冷冻干燥，共制备了50个小瓶，储存在-20°C。该抗原通过了质量控制测试，工作稀释度为1:20。**此外，剩余的50毫升……**

**讨论**
**体外和体内方法在生产**T. equiperdum**抗原方面的比较突显了无菌培养系统的当前局限性和战略优势。目前，体外生产的时间线明显更长（约三个月），而体内方法约为15天），且抗原产量较低，通常不足以满足单次批次的年度诊断需求。这些限制很大程度上是由于在手册准备过程中使用了人工智能辅助技术。在准备本手册期间，作者使用ChatGPT（OpenAI）来辅助语言编辑，提高文本的清晰度、结构和可读性。使用该工具后，作者仔细审查、编辑和修订了内容，并对工作的科学准确性、原创性和完整性负全责。

**未引用参考文献**
（Luciani等人，2013；Luciani等人，2018；William和Rex，1960；世界动物卫生组织，2021a）

**资助**
本研究得到了意大利卫生部的支持（项目编号MSAATE0122），属于“使用体外技术生产并验证**T. equiperdum**抗原以用于Dourine的血清学诊断”项目框架内。

**作者贡献声明**
玛丽安杰拉·伊奥里奥（Mariangela Iorio）：方法学；弗朗切斯卡·帕罗利尼（Francesca Parolini）：方法学；奇亚拉·迪·潘克拉齐奥（Chiara Di Pancrazio）：写作——初稿；蒂齐亚娜·迪·费博（Tiziana Di Febo）：写作——审阅与编辑、可视化；奥诺里娜·普利埃利（Onorina Puglielli）：方法学；加埃塔诺·费德里科·龙基（Gaetano Federico Ronchi）：可视化；萨拉·法尼（Sara Fanì）：方法学；安娜皮亚·迪·詹纳罗（Annapia Di Gennaro）：方法学；法布里齐亚·佩莱塔（Fabrizia Perletta）：方法学；安娜·丽塔·纳塔利（Anna Rita Natali）：方法学；埃马努埃拉·罗西（Emanuela Rossi）：方法学、资金获取；米雷拉·卢西亚尼（Mirella Luciani）：写作——审阅与编辑、写作——初稿。

**利益声明**
作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文所述的工作。

**致谢**
作者感谢Laurent Hébert博士（ANSES）提供来自实验感染的阳性马血清。

**利益冲突**
作者声明与本研究无关的任何相关利益冲突。本文所述的研究是独立进行的，没有外部影响或资金支持可能影响结果或结论。