A mycovirus-encoded homologue of plant viral movement proteins is not functional in movement complementation assays in plants 中文标题：真菌病毒编码的植物病毒运动蛋白同源物在植物运动互补试验中无功能

《Virus Research》：A mycovirus-encoded homologue of plant viral movement proteins is not functional in movement complementation assays in plants

　　

摘要：苹果黑腐皮壳阴性链RNA病毒1 (Valsa mali negative strand RNA virus 1, VmNSRV1) 是一种感染Valsa mali且属于Phenuiviridae科的真菌病毒，近期被鉴定能够自然侵染植物。其RNA2编码一种植物病毒运动蛋白 (movement protein, MP) 的同源物，该蛋白可互补MP缺陷型病毒载体并定位于胞间连丝 (plasmodesmata)，从而实现自然的跨界侵染。为了确定这一特性是拥有遥远MP同源物的真菌病毒 (mycovirus) 的共同特征还是分离株特异性性状，研究人员调查了Trichoderma gamsii cogu-like virus 1 (TgClV1)，这是一种在Trichoderma gamsii中检测到的属于Phenuiviridae科Bocivirus属的成员。在AlphaFold指导下进行的构象分析证实，RNA2编码的开放阅读框 (open reading frame, ORF) 包含一个保守的七β链模块，这是30 kDa MP超家族的特征，使其成为推定的MP样蛋白 (MP-like protein, MP-L)。为了评估其功能角色，研究人员测试了TgClV1的推定MP (TgCl-MPl) 是否能够互补三种不同系统中的运动缺陷型植物病毒：番茄顶坏死病毒 (tomato apex necrosis virus, ToANV)、苜蓿花叶病毒 (alfalfa mosaic virus, AMV) 和马铃薯X病毒 (potato virus X, PVX)。虽然烟草花叶病毒MP (tobacco mosaic virus-MP, TMV-MP) 在所有这些系统中均成功实现了反式细胞间运动互补，但TgCl-MPl未能实现。此外，TgClV1-MPl-GFP融合蛋白的定位研究显示，与TMV-MP和VmNSRV1-MP不同，TgClV1-MPl并未特异性靶向胞间连丝，而这是功能性病毒MP的关键特征。最后，无论是通过机械接种纯化的TgClV1，还是通过与根部相关的TgClV1感染的Trichoderma gamsii进行自然接种，均未能在本氏烟草 (Nicotiana benthamiana) 中建立侵染。综上所述，研究人员的发现不支持TgClV1-MPl作为植物病毒运动蛋白发挥功能的假设，并讨论了这一观察结果的进化意义。

论文解读：真菌病毒编码的运动蛋白同源物在植物中的非功能性验证

研究背景与科学问题

随着高通量测序 (high throughput sequencing, HTS) 技术的发展，真菌病毒 (mycovirus) 的生物多样性被大量揭示，其中部分病毒与植物病毒在分类学上亲缘关系密切，提示了跨界宿主适应事件的存在。植物病毒的一个标志性特征是编码运动蛋白 (movement protein, MP)，以促进病毒核糖核酸 (ribonucleic acid, RNA) 或病毒粒子通过胞间连丝 (plasmodesmata, PD) 进行细胞间的移动。近期研究发现，属于Phenuiviridae科的苹果黑腐皮壳阴性链RNA病毒1 (VmNSRV1) 能够编码一种功能性MP，使其不仅能感染真菌宿主Valsa mali，还能自然侵染植物。这引发了关于此类特性是否为Phenuiviridae科真菌病毒普遍特征的疑问。为了探究这一问题，研究人员聚焦于另一成员——来自Trichoderma gamsii的Trichoderma gamsii cogu-like virus 1 (TgClV1)，旨在通过分子结构与功能互补实验，验证其编码的MP样蛋白 (MP-like protein, MP-L) 是否具备在植物细胞中促进病毒运动的能力。该研究成果已发表于《Virus Research》。

关键技术方法概述

研究人员采用了生物信息学构象分析 (AlphaFold3预测)、系统发育树构建 (IQ-TREE) 及结构比对 (ChimeraX) 来确定TgClV1-MPl的结构特征。功能验证上，构建了基于本氏烟草的瞬时表达系统，利用农杆菌浸润法 (agroinfiltration) 将TgClV1-MPl与三种不同的运动缺陷型病毒载体（番茄顶坏死病毒 ToANV、马铃薯X病毒 PVX 和苜蓿花叶病毒 AMV）共表达进行互补试验。亚细胞定位则通过激光共聚焦显微镜观察绿色荧光蛋白 (green fluorescent protein, GFP) 融合蛋白在叶片表皮细胞和原生质体中的分布。此外，还通过机械接种和共生真菌介导的方式尝试直接侵染植物。

研究结果

3.1 系统发育分析

通过BLASTp分析，TgCl-MPl与Phenuiviridae科多个属（如Bocivirus, Coguvirus, Laulavirus等）的蛋白具有同源性。系统发育树分析显示，TgCl-MPl与已证实的植物MP（如烟草花叶病毒MP TMV-MP）处于不同的分支，表明尽管序列存在相似性，但其进化路径可能存在差异。

3.2 构象分析

AlphaFold3预测显示，TgCl-MPl具有一个由8条反平行β折叠组成的果冻卷 (jelly-roll) 构象，这是30 kDa MP超家族的核心特征。然而，通过Foldseek进行的数据库搜索发现，尽管其构象与某些植物病毒MP相似，但与其结构最接近的是同科的其他真菌病毒和昆虫病毒，而非经典植物MP。

3.3 TgClV1-MPl蛋白亚细胞定位

研究人员构建了GFP标记的TgCl-MPl融合蛋白。在共聚焦显微镜下观察，经典的TMV-MP和Ourmia melon virus MP (OuMV MP) 能够定位于细胞壁并形成管状突起 (tubules)。相比之下，TgCl-MPl无论是在氨基端还是羧基端与GFP融合，均未显示出对胞间连丝的特异性富集，且在原生质体中未形成管状结构，这与功能性MP的典型特征相悖。

3.4 功能互补

在ToANV、PVX和AMV三种不同的运动缺陷型病毒系统中，研究人员测试了TgCl-MPl的反式互补能力。结果显示，阳性对照TMV-MP能够显著促进病毒在细胞间的扩散，形成感染灶 (infection foci)；而表达TgCl-MPl的实验组与空载体阴性对照组无显著差异，未能恢复病毒的细胞间运动能力。

3.5 植物侵染试验

研究人员尝试通过两种方式让TgClV1侵染植物：一是机械摩擦接种纯化的病毒粒子至本氏烟草叶片；二是将感染TgClV1的Trichoderma gamsii菌丝体与番茄幼苗根系共培养。通过逆转录定量聚合酶链式反应 (quantitative reverse transcription PCR, qRT-PCR) 检测，结果均未能在植物体内检测到病毒积累，证实了TgClV1无法在测试的寄主植物中建立系统性侵染。

结论与讨论

本研究通过结构预测、亚细胞定位和功能性互补试验三个维度的证据，确证了TgClV1编码的MP样蛋白 (TgCl-MPl) 虽然在构象上保留了30 kDa MP超家族的单果冻卷结构域，但在功能上并不能作为植物病毒运动蛋白发挥作用。这一发现与近期报道的VmNSRV1-MP形成鲜明对比，提示并非所有携带MP同源基因的Phenuiviridae科真菌病毒都具备跨界侵染植物的能力。研究人员认为，VmNSRV1可能代表了近期获得的适应植物的功能，而TgClV1则反映了该蛋白家族在进化过程中可能承担的其他非植物运动相关功能，例如在真菌或昆虫宿主中的适应性。该研究强调了不能仅凭序列或结构的保守性来注释开放阅读框的功能，特别是在复杂的跨界病毒进化研究中，需结合严格的体内功能验证。