HIV包膜假病毒——HIV研究中不可或缺的工具 综述：HIV包膜假病毒——HIV研究中不可或缺的工具

《Virus Research》：HIV ENVELOPE PSEUDOTYPED VIRUS- AN INDISPENSABLE TOOL IN HIV RESEARCH

　　

HIV env假病毒已成为HIV研究中极具价值的工具。这些重组病毒颗粒是通过将含有异源HIV包膜糖蛋白的包膜盒与缺失一个或多个必需基因（以限制其为单轮感染）的无包膜骨架共转染HEK293T细胞而产生的。env假病毒的非感染性、复制缺陷特性使其可在BSL-2设施中安全操作。由于能够表达异源来源的HIV包膜，它们可作为多功能工具用于研究辅助受体利用与嗜性、筛选新型抗HIV药物、研究中和抗体反应、鉴定新型广谱中和抗体（bNAbs）以及理解不同HIV毒株的感染性和机制潜力。本综述总结了利用多种包装系统产生HIV env假病毒的现有方法，及其多样化的应用、来源和局限性。

引言

假病毒是人工构建的嵌合病毒，包含来自两种不同病毒的病毒核心和膜或包膜，并具有额外的突变使其复制缺陷。这使得假病毒可用作高致病性病毒的安全替代物，因其使用安全、与天然病毒高度相似且易于实验室规模化测试。此外，体外假病毒检测数据与使用完全复制 competent 病毒获得的结果具有极好的一致性。携带绿色荧光蛋白（GFP）或荧光素酶等报告基因的假病毒因便于定量分析而更为重要。本综述讨论了HIV-1包膜假病毒生产的最新进展，并重点介绍了HIV假病毒在研究中的各种应用及其未来展望。

HIV包膜假病毒的生产

含有VSV-G骨架的HIV假病毒是最早开发的假病毒之一。VSV-G是一种感染动物的包膜RNA病毒。最初使用缺失糖蛋白（G）基因的VSV重组体（rVSV-ΔG）生成整合异源病毒包膜糖蛋白的VSV假型，用于筛选进入抑制剂和评估中和抗体反应。随后，通过将HIV基因组的部分片段克隆到不同的DNA载体中，并删除rev/nef等HIV基因组的一些必需元件，生产出了HIV假病毒。已开发出使用两、三或四种载体的HIV假病毒包装系统，但最首选的包装系统是基于两个质粒：一个无包膜质粒（如pSG3Δenv或pNL4-3.Luc.R-E-，称为包装质粒）和一个携带env的质粒（称为表达质粒）。两载体包装系统多年来经过改进以更适合HIV研究。Li等人（2018）引入的一项改进是在env和nef基因之间插入萤火虫荧光素酶报告基因（Fluc），产生了pSG3Δenv.Fluc.Δnef质粒。进一步努力修改载体骨架以包含功能性nef和CMV启动子，产生了pSG3Δenv.CMVFluc载体，其报告基因表达更佳。这种改良的包装系统使假病毒产量比pNL4-3.Luc.R-E系统提高了100至1000倍。三质粒慢病毒包装系统是为实现高效、稳定的基因递送至非分裂细胞而开发的。该系统包含含有HIV-1 gag和pol基因的包装载体（psPAX2）、含有报告基因、HIV-1逆转录酶、整合酶和其他受CMV启动子控制的顺式调控元件的转移质粒（plentiGFP），以及异源HIV-1 env表达质粒。为了安全起见，转移质粒通过在整合后缩短3’LTR（长末端重复序列）使其自我失活而变得复制无能。然而，该系统似乎存在在非转基因序列插入两个LTR之间时触发肿瘤基因表达的固有威胁，因此并不流行。为了进一步提高安全性并减少体外HIV重组的机会，开发了四包装系统，其中HIV骨架被分配到四个包装载体中：一个含有gag和pol的载体，一个含有逆转录酶和整合酶的转移载体，一个含env的质粒，以及一个带有其他顺式调控元件的rev表达质粒。当这些载体与共转染到合适的细胞系（如293T）时，会产生复制无能的HIV假病毒颗粒。尽管该系统与三包装系统一样存在肿瘤基因激活的微小风险，但这种第三代条件性包装系统被认为是用于人类基因治疗的良好慢病毒载体候选者。因此，尽管开发了许多HIV包装系统，两包装系统至今仍是最广泛使用的。目前仍在努力改进两包装系统在病毒产量和动物使用安全性方面的性能。

HIV env假病毒的应用

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  测量病毒感染性和确定辅助受体利用/嗜性
  TZM-bl基于荧光素酶的检测是假病毒实验中首选的标准读数方法。TZM-bl细胞包含两个报告基因，一个编码萤火虫荧光素酶，另一个编码受HIV-1长末端重复序列（LTR）控制的β-半乳糖苷酶。感染后，病毒Tat蛋白结合HIV-1 LTR并转录激活报告基因的表达。当加入荧光素底物时，产生的荧光素酶将其转化为发光，在发光计中以相对光单位（RLU）测量。测得的信号被认为与样品中存在的病毒量成正比。同样，可以使用比色法或X-gal染色法测量β-半乳糖苷酶活性。假病毒最早的应用之一是测量病毒感染性和评估宿主-病原体相互作用。Momoi等人（2000）在使用HIV假病毒的研究中表明，百日咳毒素处理以剂量依赖性方式显著增强了假病毒感染。Li等人（2012）使用CRF07_BC假病毒评估人脐带血CD34+造血祖细胞对该重组病毒的易感性，该病毒是中国流行的HIV主要毒株之一。同一组研究人员还构建了带有和不带有HXB2和ADA亚型B包膜可变区4（V4）的假病毒，以研究V4区域对病毒感染性和辅助受体使用的影响。使用这些假病毒，他们证明缩短N端和C端以及替换V4环保守区域的关键氨基酸残基导致病毒感染性降低，并有助于HIV感染过程中的辅助受体转换。Lumngwena等人（2019）生成了含有潜在N-连接聚糖位点（PNGs）突变的HIV-1假病毒，并用它们证明与携带相同PNGs突变的慢性env假病毒相比，传播/创始（T/F）env假病毒在进入、结合树突状细胞特异性细胞间粘附分子3抓取非整合素（DC-SIGN）受体和转感染方面的效率显著降低。使用这个模型，他们进一步证明HIV-1亚型C包膜在疾病进展过程中对N-聚糖缺失不太敏感。在另一项研究中，Lumngwena等人（2020）表明，拥有高甘露糖N-聚糖的T/F假病毒能够结合单核细胞源性树突状细胞（MDDCs）上的DC-SIGN受体并诱导其分泌IL-10，这一特征被认为是HIV毒株选择性传播所必需的。Nie等人构建了一个在N-糖基化位点有25个点突变的假病毒，以研究其对病毒感染性的影响。在所有研究的突变中，他们发现N442Q突变的存在使突变体病毒比野生型病毒更具传染性。假病毒也被广泛用于辅助受体分型。Whitcomb等人（2007）开发了一种名为Trofile检测的自动化辅助受体嗜性检测，用于确定患者来源的env假病毒的辅助受体使用情况。该检测广泛应用于临床试验，根据HIV辅助受体使用情况对患者进行分类以确定适当的方案，并监测治疗开始后病毒反弹期间的辅助受体转换。Rainwater等人（2007）使用基于荧光素酶的假病毒检测评估通过母乳喂养传播的病毒的辅助受体特异性，并报告源自婴儿包膜序列的假病毒使用CCR5作为辅助受体。Xu等人（2008）使用Photinus pyralis荧光素酶基因表达系统进行辅助受体分型，并显示所有单核细胞衍生的HIV-1假病毒优先使用CCR5受体。他们进一步表明，CCR5嗜性单核细胞和巨噬细胞衍生病毒仅感染MDMs而不感染CD4+ T细胞，而除CCR5外还使用CXCR4的双重嗜性病毒则感染MDMs和CD4+ T细胞。Zou等人（2011）证明巨噬细胞表达的I型凝集素受体Siglec（唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素）通过病毒包膜表面的唾液酸促进R5以及X4嗜性HIV的感染。Revilla等人使用TZM-bl细胞中的包膜假病毒评估了亚型G（n=15）和亚型F（n=7）病毒的感染性和辅助受体使用情况。在测试的22个包膜克隆中，据报道有21个使用CCR5辅助受体。Peters等人（2015）使用GFP标记的假病毒研究宫颈外植体感染，并显示外宫颈组织优先被含有非巨噬细胞嗜性R5包膜的假病毒感染，并且T细胞是感染的首个细胞靶点，即使是高度巨噬细胞嗜性的R5病毒也是如此。Gartner等人（2020）使用从未经治疗的HIV感染者不同时间点收集的长期样本获得的假病毒分析了亚型C包膜嗜性，并显示过渡记忆（TM）和效应记忆（EM）细胞由于CCR5表达水平较高而更频繁地被感染，而与池中较大比例的CD4+ T细胞无关。
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  抗HIV药物的筛选
  由于没有可以治愈HIV或防止耐药性出现的药物，开发针对HIV的新型抗逆转录病毒药物一直是研究的优先事项。由于HIV包膜单独负责病毒进入宿主细胞，特异性阻断病毒进入的进入抑制剂是一类非常有前景的药物。根据作用机制，进入抑制剂大致分为（1）附着抑制剂，（2）辅助受体拮抗剂和（3）融合抑制剂。体外筛选进入抑制剂极大地依赖于env假病毒的使用。Cocklin等人（2007）开发了一种广谱HIV-1进入抑制剂HNG-105，并显示了其对属于亚型A、B、C、D、BC和AE的多种HIV-1假病毒的中和效果。Mcmahon等人（2008）使用假型HIV病毒的单周期感染性检测测试了抗疱疹药物阿昔洛韦对HIV的抑制活性，发现阿昔洛韦以约5 μM的IC50抑制HIV感染。Van Herrewege等人（2008）使用一组包含不同亚型和辅助受体特异性的假病毒筛选了一组CD4模拟微蛋白的抗病毒活性。Asmal等人（2012）研究了肝素激活的抗凝血酶III（hep-ATIII）化合物（丝氨酸蛋白酶抑制剂家族成员）的效果，发现它对包含几个B簇和C簇包膜克隆的HIV假病毒面板表现出抗病毒活性。Qiu等人（2012）使用基于荧光素酶的假病毒检测证明了聚4-苯乙烯磺酸-共-马来酸（PSM）的进入抑制活性。Farr等人（2013）开发了一种使用源自新月柄杆菌的杀微生物剂阻断病毒进入的新策略，并使用B簇和C簇env假病毒测试了其活性。Curreli等人（2014）使用env假病毒筛选了二十五种病毒进入拮抗剂NBD-11021的CD4模拟类似物，并证明其中两种分子，45A（NBD-14009）和46A（NBD-14010），在测试包含代表性临床分离株的假病毒面板时显示出广谱抗病毒活性。Ding等人（2017）使用基于荧光素酶的假病毒检测评估了一种基于恩夫韦肽（T20）的脂肽的活性，并证明了其优于未修饰的恩夫韦肽（T20）。Wang等人（2017）合成并评估了一系列新型吡啶鎓多金属氧酸盐对HIV的活性，使用单周期假病毒检测显示所有化合物均表现出一定程度的抑制活性，IC50值为0.20-38.67 nM。Qiu等人（2019）展示了一种称为12m（NSPD-12m）的N-取代吡咯衍生物对包含HXB2、JR-FL和SF162的参考假病毒面板具有强大的抗HIV活性。Ryang等人（2019）使用HIV-1假病毒研究了分子印迹微生物紫杉醇在抑制病毒进入TZM-Bl细胞中的作用，并证明其具有HIV进入抑制剂活性。Yu等人（2021）测试了最近确定的一种泛冠状病毒融合抑制剂EK1V1修饰脂肽对HIV env假病毒的作用，发现它对HIV也有效。使用异源和自体病毒的基于假病毒的中和检测已被用于评估小分子进入抑制剂BMS-529的抗原性和免疫原性。最近，一类被称为双效杀病毒进入抑制剂（DAVEIs）的新型抑制剂已被测试并显示出通过双重结合gp120和gp41导致彻底的膜破坏和不可逆的病毒灭活。第一代和第二代DAVEIs均使用HIV-1 Bal和YU2 env假病毒进行了测试。因此，假病毒已被广泛用于推进HIV/AIDS的新疗法。
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  评估中和抗体（NAb）反应和鉴定新型bNAbs
  高效价广谱中和HIV特异性单克隆抗体（bNAbs）的发现为预防和治疗HIV感染开辟了新途径。这些抗体靶向HIV包膜中的关键位点，即CD4结合位点（CD4-bs）、V1/V2聚糖、V3聚糖、膜近端外部区域（MPER）、gp120-gp41界面和沉默面。表征从HIV感染者、疫苗诱导的抗体以及针对HIV开发的单克隆抗体中分离的抗体的敏感性、广度、交叉反应性和中和效力，在很大程度上依赖于采用假病毒面板的检测。全球范围内，评估中和抗体反应继续使用Montefiori等人（2004）描述的基于假病毒的TZM-bl检测作为标准方法。此处，使用基于报告基因的两包装系统生成大量假病毒。将所得的假病毒颗粒与人的血清孵育，然后感染TZM-bl细胞。通过报告基因表达评估血清中抗体对假病毒面板的中和活性。基于假病毒的TZM-bl检测还可用于根据其中和敏感性将假病毒分类为Tier 1A（高敏感性）、Tier 1B（中高敏感性）、Tier 2（中等敏感性）和Tier 3（低敏感性）。采用克隆包膜假病毒面板具有许多优势，例如减少了与病毒准种相关的变异性、遗传一致性以及增强的可重复性。这些特征有助于标准化评估中和抗体的广度和效力。此外，此类检测还有助于剖析针对HIV的中和抗体的特异性和特征，因为它们提供了Env序列与中和表型之间的一致相关性。列出了一些常用于标准化中和评估和HIV-1治疗药物筛选的全球代表性假病毒面板。纳米技术的潜力也被用于推进HIV/AIDS的新型替代治疗策略。Zhu等人（2024）使用属于亚型AE、B、BC和C的R5嗜性假病毒，表征了用人类CD4蛋白免疫羊驼产生的抗CD4纳米抗体的中和活性。Sajadi等人（2011）使用代表A、C和CRF02_AG克隆的15个tier 1/tier 2假病毒检查了循环HIV-1 RNA水平与广谱中和抗体活性之间的相关性，并报告持续的HIV-1抗原表达引发了个体保护水平的中和抗体。Doria-Rose等人（2014）使用代表主要亚型和重组形式的HIV假病毒面板，阐明了供体中V1V2导向的中和抗体的发育途径。这项研究为HIV-1疫苗的设计和开发提供了宝贵的见解。Song等人（2018）构建来自重组和非重组HIV序列的env假病毒，以评估其对随时间收集的自体血浆的中和敏感性，以确定重组对抗体的耐药性的影响。他们的研究结果表明，重组促进了自体中立抗体的免疫逃逸。Bertagnolli等人（2020）从潜伏库中扩增包膜并对这些包膜进行假型化，以评估对自体IgG的中和易感性，并证明假型病毒对自体IgG抗体敏感。Mkhize等人（2023）从参加使用VRC01进行被动免疫的抗体介导预防（AMP）临床试验的参与者中开发了假病毒，并对其针对八种处于临床开发阶段的bNAbs进行了测试。他们观察到，与未暴露于VRC01的病毒株相比，病毒对VRC07-523LS和CAP256.25的耐药性增加。Wieczorek等人（2023）也证明了来自当代病毒的包膜结构域的中和敏感性相比早期（1980年至2018-2019年）病毒的包膜有显著降低——这一时期跨度近四十年。这表明单克隆抗体（mAbs）的中和效力随着时间的推移已大幅下降。这些发现的一个重要教训是，更新假病毒面板以反映循环HIV-1变异株的持续进化和日益增加的耐药性至关重要。非常有趣的是，洛斯阿拉莫斯HIV数据库开发了一种基于网络的工具，称为CATNAP（编译、分析和统计NAb面板），通过整合已发表研究的中和数据与病毒包膜蛋白序列来支持HIV-1中和抗体研究的进展，使用户能够探索抗体-病毒特征并选择合适的假病毒面板进行体外表征。虽然假病毒被广泛用于评估中和敏感性，但也存在一些局限性。使用假病毒有时会导致高估中和抗体的效力和疗效，因为包膜刺突的密度显著影响病毒感染性和对中和的易感性。此外，假病毒通常在293T细胞中产生，这与天然宿主T细胞在糖基化模式上不同。这种糖型异质性可能导致对bNAbs的假病毒敏感性被高估或低估，与使用源自原代T细胞的完全复制 competent 病毒获得的结果相比。尽管存在这些局限性，基于假病毒的检测由于其若干显著优势，在评估中和反应和发现新型bNAbs方面继续发挥着重要作用。
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  追踪HIV进化
  HIV显示出迄今为止最高的生物突变率。在感染过程中，特别是在env基因中积累了几种有利的突变，这要么是因为遗传漂变，要么是因为突变提供的复制适应性允许病毒逃避宿主免疫反应、抗逆转录病毒药物和抗体的中和。HIV env假病毒已被用于从患者样本中筛选出抗性病毒并表征其突变热点。Chaillon等人（2012）使用基于荧光素酶的假病毒检测从长期非进展者（LTNPs）的包膜克隆池中筛选出对bNAbs具有抗性的包膜克隆，并使用抗性包膜克隆绘制逃逸突变。Zhao等人（2016）使用源自男男性行为者（MSM）受试者的自体和非自体假病毒调查从MSM精英中和者获得的血清中和抗体的中和广度和效力，发现后期血清样本对假病毒的更好中和，表明抗体与病毒共同进化。Wei等人（2020）重组了带有缺陷和功能性包膜基因的假病毒，并表明可以形成完全传染性的病毒。Nie等人（2020）使用异源假病毒将受试者分类为中和者和非中和者，并表征其env基因以识别突变热点和病毒进化。
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  新型基于假病毒的检测的开发
  几个研究小组使用HIV假病毒在不同细胞系中优化和验证现有检测并开发新检测。Heyndrickx等人（2008）评估了基于假病毒的检测与基于复制 competent 病毒的检测在评估抗病毒化合物活性方面的兼容性，并显示两种方法获得的EC50值之间存在显著相关性。Jia等人（2011）开发了一种新型的基于假病毒的检测，用于药物抗性HIV-1分离株的表型表征，将从患者样本中扩增的逆转录酶和蛋白酶基因克隆到PSG3ΔEnv骨架中，并在核苷逆转录酶抑制剂（NRTI）、非NRTI（NNRTI）和蛋白酶抑制剂（PI）类药物的存在下培养所得的重组假病毒以确定耐药性。Pietzsch等人（2012）开发了gp160 YU-2假型慢病毒（HIV YU-2），用于使用表达hCCR5和hCD4的荧光素酶报告基因小鼠进行HIV进入和抗体介导的早期HIV感染保护的体内研究。这被证明是研究针对HIV的抗体介导的效应功能的有用动物模型。Schultz等人（2012）开发了一种基于Tecan的自动化celerity系统，用于在良好临床实验室实践（GCLP）条件下生产HIV-1假病毒系统，以满足HIV疫苗试验对高质量HIV假病毒生产日益增长的需求。Asin-Milan等人（2014）开发了一种基于单周期克隆的HIV-1嗜性检测，以确定混合准种的R5和X4嗜性病毒以及双重嗜性病毒群体的辅助受体使用情况。Alexandre等人（2020）使用Abela等人（2012）开发的基于假病毒的细胞间传播检测的修改版本来筛选细胞间传播的抑制剂。Burnie等人开发了一种新颖的流式病毒学检测，通过检测HIV-1包膜上的宿主细胞蛋白来识别新的HIV-1靶点。为此，他们生产了表面表达三种宿主细胞蛋白（整合素α4β7、CD14和CD162/PSGL-1）的假病毒，并证明了与免疫磁捕获检测相似的增强病毒颗粒捕获能力。这为评估HIV-1表面蛋白提供了一个稳健且标准化的平台。Manoto等人（2021）采用光学光谱方法，如UV-vis光谱、透射电子显微镜（TEM）、原子力显微镜（AFM）、激光诱导荧光（LIF）和拉曼光谱，使用结合金纳米簇（AuNCs）和硒纳米粒子（SeNPs）的抗HIV-1 gp41抗体检测HIV假病毒，并展示了开发HIV生物传感器系统的概念验证。Schwarzmüller等人（2024）开发了一种有趣的方案，是对传统的基于TZM-bl的血浆中和检测的修改，该方案使用对抗逆转录病毒治疗（ART）具有抗性的假病毒来评估接受ART的HIV感染者的血浆中和活性。
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  其他应用
  Env假型HIV病毒已被有效地用于其他几个目的。Chong等人（2012）生产了具有M626A或T627A取代的HIV假病毒，发现gp41 621QIWNNMT627基序中的Met626和Thr627残基对HIV-1进入至关重要。Su等人（2013）使用HIV假型病毒证明益生菌干酪乳杆菌393通过结合CD4受体从而阻断HIV传播的有益效果。Joag等人（2016）生产了含有早期传播的R5嗜性A簇包膜的BlaM-Vpr假病毒，并用它来识别宿主宫颈中的细胞靶点。他们还显示表达CD69和整合素α4?7/α4?1的活化宫颈内CD4+ T细胞对HIV感染更易感。Zaitseva等人（2017）使用GFP标记的假病毒研究HIV-1进入融合阶段期间磷脂酰丝氨酸介导的信号传导，并观察到由Env-CD4-辅助受体复合物相互作用触发的信号依赖性TMEM16F脂质 scramblase 介导的非凋亡性磷脂酰丝氨酸在细胞表面的外翻，促进了HIV与目标细胞的融合。Bricault等人（2019）设计了一种基于签名表位靶向（SET）的疫苗，利用V2 bNAb引导的突变来创建三价疫苗。当在广泛的假病毒面板上进行测试时，发现基于SET的疫苗比非基于SET的疫苗引发具有更大中和广度的抗体。Beitari等人（2020）使用代表HIV感染不同阶段的假病毒研究两个限制因子SERINC5和IFITM3在HIV感染各个阶段的影响。他们的研究表明，限制因子在HIV-1感染过程中施加了差异压力，并且包膜反过来利用策略通过使用包膜假病毒抵抗这些因子。Ladinsky等人（2020）使用假病毒通过电子断层扫描（ET）捕获HIV感染期间的融合事件。研究人员使用融合抑制剂捕获pre-hairpin中间态，发现虽然野生型病毒颗粒使用2-4个窄辐条附着到TZM-bl细胞，但缺乏包膜胞质尾部的突变体病毒需要更多的辐条。Ward等人（2020）结合冷冻电镜断层扫描（cryo-ET）和全内反射荧光（TIRF）显微镜研究HIV假病毒与表达目标受体的巨血浆膜囊泡或Blebs的融合。这项研究提供了对融合事件和丝氨酸介导的HIV-细胞膜融合抑制的详细理解。

基于HIV的冠状病毒假型系统

冠状病毒（CoVs）属于冠状病毒科，自21世纪初以来一直导致一些重要的人类大流行；包括2002年的严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）、2012年的中东呼吸综合征-CoV（MERS-CoV）和2019年的SARS-CoV-2大流行。这些病毒是包膜、非分节段且具有正链RNA基因组。它们进入宿主细胞是由跨膜刺突（S）糖蛋白介导的，该蛋白突出于病毒表面。从事冠状病毒研究的调查人员试图开发基于HIV的SARS-CoV假型系统，该系统包装CoV包膜S蛋白，类似于HIV包膜假病毒系统。这些系统有利于筛选和鉴定针对冠状病毒的进入抑制剂。Yi等人（2004）通过将pNL4-3E-R-Luc（HIV-luc）和含有SARS-CoV包膜的质粒pcDSh共转染293T细胞，开发了一种灵敏快速的HIV-luc/SARS假型系统。该系统用于筛选中草药提取物库中的小分子。结果鉴定出两种分子，TGG和木犀草素，能有效阻断SARS-CoV进入宿主细胞。Yi等人（2024）开发了另一种基于HIV-1的CoV假型系统，通过共转染pNL4.3-Env-FLuc和spike-G614-Δ19质粒，并用于筛选针对SARS-CoV-2的天然产物抑制剂。这有助于鉴定马缨丹提取物和石竹烯作为有效的CoV进入阻断剂。Ao等人（2021）开发了一种敏感的SCoV-2刺突糖蛋白（SP）假型HIV-1基于载体的系统，包括SP突变体D614G，并用于测试其感染ACE2表达细胞的能力。使用三质粒包装系统评估了夏枯草提取物和苏拉明及其对SARS-CoV-2中和抗体（nAb）的协同作用。在此，将全长SP（SARS-CoV-2-SP）和C端17个氨基酸（aa）缺失的SP（SARS-CoV-2-SPΔC）表达质粒、含有高斯荧光素酶基因位于nef位置、缺失病毒RT和IN基因以及部分缺失包膜基因的基于HIV的载体（ΔRI/ΔEnv/Gluc），以及包装质粒（pCMVΔR8.2）共转染到HEK 293T细胞中以产生病毒感染性。该系统用于基于分泌到培养基中的生物发光酶Gluc的活性进行测量。

假病毒克隆的来源

本文讨论的各种研究中使用的假病毒克隆大多可通过NIH HIV试剂计划获得，该计划最初成立于1988年，旨在促进研究材料（包括病毒、假病毒、抗体、细胞系、肽和抗逆转录病毒化合物）的储存和分发。该计划通过免费提供这些资源来支持全球HIV研究界。截至2024年1月，HIV试剂计划已并入BEI Resources，并继续其向HIV研究人员分发试剂的使命，同时保护储存者的知识产权。

假病毒的局限性

虽然假病毒具有多种应用，并且在BSL-II设施中使用具有巨大的安全性优势，但也有一些值得提及的局限性。虽然假病毒拥有完全复制 competent 病毒的包膜，但它们并不总是精确复制天然病毒的感染模式。例如，虽然HIV是球形病毒，而VSV是子弹形病毒。这意味着工程化病毒包膜表面的糖蛋白分布、构象和密度可能不能反映野生型包膜的自然状态。除此之外，假型病毒的产生也可能导致产生复制 competent 病毒。为了量化假病毒的滴度，基于p24的ELISA和基于拷贝数的qPCR已被广泛使用。然而，据观察