IFNL3降低犬气道上皮细胞中CIRDC相关病毒的复制

《Virus Research》：IFNL3 reduces replication of CIRDC-associated viruses in canine airway epithelial cells

　　

犬传染性呼吸道疾病综合征（CIRDC）导致犬发生传染性呼吸道疾病，包含多种致病因子。与CIRDC相关的病毒性病原体包括犬腺病毒2型（CAV-2）、犬瘟热病毒（CDV）、犬疱疹病毒1型（CaHV-1）和犬流感病毒（CIV）。疫苗的可及性和效力各不相同，目前尚无可用的治疗药物。干扰素（IFNs）是抵御许多病毒感染免疫防御的前沿，且干扰素λ（IFNL）已被证明是一种有效的抗病毒制剂。研究人员假设，用犬干扰素λ-3（IFNL3）处理犬呼吸道上皮细胞（ALI-CRECs）将减少犬窝咳病毒的复制。 研究人员分离、培养并对ALI-CRECs进行了形态学和免疫学表征，随后用CDV、CaHV-1、CIV和CAV-2进行感染。针对每种病毒，评估了犬IFNL3处理在降低病毒滴度以及诱导干扰素反应方面的价值。 用IFNL3处理ALI-CRECs可诱导干扰素刺激基因（ISGs）的表达。此外，预防性给予IFNL3导致病毒DNA显著降低，细胞内CT值变化高达13，细胞外高达9。相比之下，对于CDV和CaHV-1，仅在细胞内观察到病毒RNA/DNA的减少，CT值变化分别高达11和4。预防性IFNL3处理还显著降低了病毒滴度：CAV-2降低1.2至3 log-fold，CDV降低0.9-2.5 log-fold，CaHV-1降低1.1-1.7 log-fold。未观察到IFNL3对CIV RNA和CIV病毒滴度的影响。伴随着病毒复制的减少，干扰素处理组和感染细胞中的干扰素刺激基因与对照组相比差异表达。 总之，ALI-CRECs已被证明是研究呼吸道病毒和评估IFNL3潜在抗病毒作用的优良系统。然而，需要进一步深入的机理研究来充分理解IFNL3如何刺激/调节局部免疫反应以诱导抗病毒效应。此外，虽然本研究强调了IFNL3对几种犬呼吸道病毒的潜在抗病毒功效，但仍需在犬体内评估其安全性、有效剂量以及治疗潜力。

研究背景与意义

犬传染性呼吸道疾病综合征（CIRDC），俗称“犬窝咳”，是一种由多种因素引起的传染性疾病，常见于收容所和犬舍等拥挤环境中的犬只。该病的主要病原体包括犬腺病毒2型（CAV-2）、犬瘟热病毒（CDV）、犬疱疹病毒1型（CaHV-1）和犬流感病毒（CIV）等。由于病原体存在遗传变异且具有免疫调节作用，现有疫苗的保护期通常较短且保护不完全，临床上缺乏有效的抗病毒治疗药物。鉴于呼吸道黏膜是病原体入侵的第一道防线，刺激黏膜免疫对于改善局部保护和诱导系统性免疫反应至关重要。I型干扰素（IFN-α/β）和III型干扰素（IFN-λ）是黏膜早期抗病毒反应的关键因子。特别是IFN-λ，其主要受体表达于黏膜上皮细胞，相较于I型干扰素具有更少的副作用。因此，本研究旨在利用模拟犬自然气道的体外模型——气液界面培养的犬呼吸道上皮细胞（ALI-CRECs），探讨重组犬IFN-λ3（IFNL3）对CIRDC相关病毒的抗病毒潜力。

关键技术方法

本研究首先采集了8只呼吸道健康犬的气管组织，分离并培养了原代犬呼吸道上皮细胞（CRECs），并在气液界面（ALI）条件下分化成熟为ALI-CRECs。研究人员利用光学显微镜、苏木精-伊红（H&E）染色对细胞的形态学特征进行了表征，并通过PCR和qPCR技术比较了气管组织、新鲜分离的CRECs与ALI-CRECs在 Toll 样受体（TLRs）、细胞因子及干扰素刺激基因（ISGs）等免疫标志物mRNA表达上的差异。在功能验证方面，研究人员构建了四种CIRDC相关病毒（CAV-2、CDV、CaHV-1、CIV）的感染模型，通过测定细胞内外的病毒核酸载量（qPCR）和半数组织培养感染剂量（TCID₅₀）来评估病毒复制情况。此外，研究还通过剂量梯度实验确定了IFNL3的最佳处理浓度（100 μg/mL，瞬时暴露1小时），并利用qPCR分析了IFNL3处理后及病毒感染后细胞免疫基因的表达动力学。

研究结果

3.1. ALI-CRECs在形态学上模拟自然气道

研究人员成功在Transwell小室上培养出分化良好的ALI-CRECs。显微镜和H&E染色结果显示，培养约两周后的细胞形成了类似体内气道的假复层上皮结构，能够分泌黏液并含有杯状细胞，证实了该体外模型在形态学上与犬自然气道具有高度相似性。

3.2. 犬呼吸道上皮细胞保留了天然气道中观察到的先天免疫相关基因表达

通过对28种免疫相关基因的PCR分析发现，尽管个体间存在差异，但ALI-CRECs能够稳定表达模式识别受体（PRRs）、干扰素刺激基因（ISGs）及炎性细胞因子。qPCR定量结果显示，除TLR4、IFN2L和CCL7在新鲜分离的CRECs中表达略高外，ALI-CRECs与气管组织在绝大多数免疫标志物的mRNA表达水平上无显著差异，表明ALI-CRECs在免疫学特征上也较好地模拟了天然气道。

3.3. ALI-CRECs支持CAV-2、CDV、CaHV-1和CIV的感染

感染实验显示，四种病毒均能在ALI-CRECs中高效复制并产生典型的细胞病变效应（CPE）。例如，CDV和CaHV-1感染后48小时出现合胞体，CIV导致细胞脱落，CAV-2则引起细胞变圆。终点滴度测定证实所有病毒均能有效增殖，证明了该模型适用于CIRDC病原体的致病机制研究。

3.4. 仅瞬时暴露于IFNL3对ALI-CRECs耐受性良好

初步实验表明，持续暴露于IFNL3会导致细胞死亡，而采用100 μg/mL浓度瞬时处理（1小时）的方案既能维持细胞活力，又能有效诱导下游基因表达，因此被选定为后续实验的标准操作流程。

3.5. 用IFNL3处理ALI-CRECs可在长达48小时内提高干扰素刺激基因的mRNA表达

对IFNL3处理后的细胞进行qPCR分析发现，与未处理组相比，IRF-7和MXI的mRNA表达在24和48小时显著上调，Viperin的表达也在24小时显著增加。这表明IFNL3能够有效激活ALI-CRECs内的JAK-STAT信号通路，启动抗病毒状态。

3.6. IFNL3处理显著降低CAV-2、CDV和CaHV-1的病毒滴度及核酸载量

这是本研究的核心发现。预防性给予IFNL3显著降低了CAV-2、CDV和CaHV-1的细胞内和细胞外病毒滴度，降幅分别在1.2-3 log-fold、0.9-2.5 log-fold和1.1-1.7 log-fold之间。qPCR结果也显示，处理组的病毒DNA/RNA载量显著低于对照组。值得注意的是，IFNL3对犬流感病毒（CIV）的复制未表现出显著的抑制效果。

3.7. IFN-λ3对CAV-2、CDV和CaHV-1感染期间免疫基因mRNA表达的影响

在病毒感染背景下，IFNL3处理组的Viperin和IL-8等基因的mRNA表达模式与单纯感染组存在差异，但由于动物间个体差异较大，大多数变化未达到统计学显著性。不过，数据趋势提示IFNL3可能通过调节特定ISGs和炎性因子的表达来发挥抗病毒作用。

结论与讨论

本研究发表于《Virus Research》，主要结论如下：研究证实，气液界面培养的犬呼吸道上皮细胞（ALI-CRECs）在形态学和免疫学特征上均能很好地模拟犬的自然气道，是研究CIRDC病毒及评估抗病毒药物的优秀体外替代模型。研究人员发现，预防性使用IFNL3处理ALI-CRECs能够诱导干扰素刺激基因（如IRF-7、MXI、Viperin）的表达，并显著抑制CAV-2、CDV和CaHV-1的复制，但对CIV无效。这一差异可能与CIV的致病特性、细胞分化状态或IFNL3的给药方式有关。讨论部分指出，虽然PCR检测到了病毒核酸的减少，但病毒滴度的下降更为显著，这提示临床诊断中需注意区分“死病毒核酸”与“活病毒载量”。此外，由于本研究仅限于体外模型和预防性给药，未来的工作需要在犬体内进一步评估IFNL3的安全性、有效剂量以及治疗性给药的潜力，并深入探讨其对CIV不敏感的分子机制。