环境DNA与传统采样方法：评估热带淡水生物多样性的最佳结合

《Water Biology and Security》：Environmental DNA or traditional sampling approaches: The best of both worlds for assessing tropical freshwater biodiversity

　　印度·埃利奥特 | 玛琳·康布 | 艾丽丝·瓦伦蒂尼 | 罗多尔夫·埃利·戈兹兰
法国蒙彼利埃大学ISEM、CNRS、IRD，蒙彼利埃

**摘要**
淡水生态系统正面临多种人为压力的影响，导致全球淡水生物多样性下降。因此，为了保护生物多样性，有必要定量且高效地确定群落的物种组成。然而，无论是覆盖一个国家还是整个大陆的大规模生物多样性调查，往往都受到时间限制，使得全面评估变得不可行。尽管如此，这些调查迫切需要既定量、可重复、一致又实用的科学采样方法，以便在不同的人为因素、海拔或地理梯度下生成有意义的生物多样性指数。两种常见的采样方法是传统的物理采样方法和eDNA技术。在水生环境中，传统采样方法通常不全面、耗时且具有侵入性，而eDNA则可以以非侵入性的方式提供更完整的群落信息。目前很少有研究比较传统采样方法和eDNA技术在鱼类和无脊椎动物物种鉴定中的效果，尤其是在热带地区以及大规模、短期的生物多样性调查中。我们的目的是确定eDNA是否可以替代传统分类学采样方法，用于评估法属圭亚那小型淡水系统的生物多样性。研究发现，对于鱼类，eDNA识别出了62个分类单元，而传统采样方法仅识别出13个分类单元（两者共有7个分类单元）；对于无脊椎动物，eDNA识别出的16个分类单元全部也能通过传统采样方法找到，传统采样方法共识别出70个分类单元。通过eDNA识别出的最常见鱼类是Hoplias malabaricus（16个地点）和Krobia aff. guianensis（15个地点），而通过传统采样方法识别出的最常见无脊椎动物科是Libellulidae（14个地点）。我们的发现可能反映了不同物种在DNA释放率方面的根本生物学差异：作为脊椎动物的鱼类通过黏液、鳞片和排泄物向环境中释放更多DNA，而无脊椎动物由于其几丁质外皮，释放的DNA量要少得多。在这种情况下，无脊椎动物的多样性更适合用传统分类学方法进行评估，而鱼类的生物多样性则更适合用eDNA方法进行评估。尽管这些研究是在法属圭亚那进行的，但其结果对大规模、短期的生物多样性调查具有普遍意义，并强调了根据不同物种的DNA释放特征来定制eDNA策略的必要性。

**1. 引言**
全球生物多样性正在下降（Heydari等人，2020；Port等人，2016），特别是两栖动物（Luedtke等人，2023）、哺乳动物（Greenspoon等人，2023）、鸟类（Tscharntke和Batáry，2023）以及昆虫（Forister等人，2019）。根据国际自然保护联盟（IUCN）的红色名录，超过44,000种物种面临灭绝威胁，其中包括25%的淡水鱼类（IUCN，2023）。生物多样性的下降也影响了水生生态系统（Maasri等人，2022；Valentini等人，2016），这些系统受到许多人为因素的负面影响（Dudgeon，2019；Reid等人，2019；Navarro-Ortega等人，2015）。淡水生物多样性的减少影响了生态系统服务（Maasri等人，2022；Navarro-Ortega等人，2015），包括食物生产、气候调节、水净化、养分循环等方面，以及经济效益（Lynch等人，2023）。重要的是，生物多样性还起到了防止人畜共患病的作用，这被称为“稀释效应”（Halliday等人，2020；Keesing和Ostfeld，2021）。在宿主种类多样的生态系统中，这种效应可以稀释病原体负荷，从而降低感染风险。相反，由于栖息地退化和入侵物种的影响，水生生物多样性的丧失增加了新发传染病（EIDs）的风险（Okamura和Feist，2011）。因此，由于森林砍伐、城市化或农业集约化导致的生物多样性丧失预计会通过以下方式增加EIDs的风险：（1）非宿主数量的减少，随后是病原体宿主和媒介的过度增加，从而促进疾病传播；（2）病原体宿主/媒介与家畜/人类之间的互动和接触频率增加（Hassell等人，2017；Jones等人，2013；Morris等人，2016）。因此，监测淡水生物多样性对于减少物种灭绝（Lynch等人，2023；Maasri等人，2022）和EIDs风险（Okamura和Feist，2011）以及改进恢复和保护策略（Darwall等人，2018；Lynch等人，2023）至关重要。

热带淡水生态系统是生物多样性的热点区域（Blackman等人，2021）。然而，通过传统采样和分类学分析来监测这些生态系统非常困难（Port等人，2016）。由于某些物种的流动性（Port等人，2016）或水柱深度大且浑浊（Cilleros等人，2019；Huerlimann等人，2020；Czeglédi等人，2021），采样工作往往不全面。此外，传统的生物多样性监测方法具有高度侵入性（Port等人，2016）、成本高昂（Belle等人，2019；Oka等人，2021）且耗时（Belle等人，2019；Oka等人，2021；Port等人，2016）。环境DNA（eDNA）是一种替代传统采样的方法，因为它：（1）提高了采样准确性和效率（Huerlimann等人，2020；Port等人，2016）；（2）更具伦理性，因为它是非侵入性的（Cilleros等人，2019；Pereira等人，2021；Oka等人，2021；Rees等人，2014）；（3）速度更快（Belle等人，2019；Pereira等人，2021；Rees等人，2014）；（4）成本更低（Belle等人，2019；Pereira等人，2021；Rees等人，2014）。在过去十年中，eDNA在水生系统中被广泛用于研究群落生态（Cantera等人，2019）、监测生物多样性（Huerlimann等人，2020）以及保护工作（Cantera等人，2019；Cantera等人，2022）。该方法能够捕获环境中存在的各种生物的DNA（Belle等人，2019；Rees等人，2014），包括入侵物种、隐秘物种或受威胁物种（Belle等人，2019；Huerlimann等人，2020；Port等人，2016）。

与温带地区相比，热带地区的相关研究较少（Huerlimann等人，2020），这可能导致热带地区的水生生物多样性被低估（Belle等人，2019）。此外，eDNA的一些潜在局限性（Zainal Abidin等人，2022）仍需在热带环境中进行验证。例如，这些地区的紫外线辐射较强和水质酸度较高，可能导致DNA降解速率加快（Cilleros等人，2019）。Schenekar（2023）通过对使用eDNA的淡水系统的研究论文进行回顾，发现存在明显的地理和分类学偏差：只有4.2%的研究集中在南美洲，1.0%集中在非洲，而50.4%的研究仅关注鱼类。尽管如此，eDNA已在热带海洋鱼类（Zainal Abidin等人，2022；Nguyen等人，2020）和热带海洋无脊椎动物（Nguyen等人，2020）的研究中与传统采样方法进行了比较。Valdivia-Carrillo（2021）在加利福尼亚湾的热带海洋生态系统中比较了使用水下视觉调查和eDNA对硬骨鱼类群落的研究。在法属圭亚那（南美洲），Cilleros等人（2019）使用传统采样和eDNA调查研究了河流和溪流中的鱼类多样性，发现一些物种两种方法都能检测到，而另一些物种仅通过一种方法检测到。虽然法属圭亚那淡水鱼类的参考数据库（http://vmcebagn-dev.ird.fr）仍在建设中（Murienne等人，2019），但如今使用eDNA进行淡水鱼类评估已变得更加普遍（Cilleros等人，2019；Cantera等人，2019，2022；Keck等人，2023）。Lefrancois等人（2024）比较了法属西印度群岛中鱼类和甲壳类动物的eDNA和传统电捕鱼方法的效率，发现eDNA在鱼类多样性评估方面更有效，但在甲壳类动物方面效果不一。然而，仍需要进一步的研究来比较热带地区传统采样方法和eDNA方法在淡水无脊椎动物群落中的效率，特别是在目前缺乏此类比较的静水生态系统（如池塘和牛轭湖）中。

在这里，我们使用传统的分类学钥匙和同时进行的eDNA调查，比较了法属圭亚那（南美洲）小型淡水栖息地（静水池塘和牛轭湖）中鱼类和无脊椎动物群落的多样性，以评估eDNA是否可以提供一种非侵入性、更快速的方法来监测热带小型淡水系统的生物多样性。我们选择鱼类作为研究对象，因为之前的研究表明eDNA调查在鱼类群落评估中是可靠的（Cilleros等人，2019；Cantera等人，2019，2022），并对eDNA在类似情况下识别水生无脊椎动物的效率提出疑问。我们假设：（1）鱼类由于会分泌黏液且移动性高，会在静水环境中释放足够的DNA，从而使得eDNA提供的多样性估计与分类学方法相当甚至更好；（2）由于无脊椎动物释放的DNA量较少且移动性较低，eDNA对无脊椎动物的多样性估计效果较差。

**2. 材料与方法**
**2.1. 研究区域**
法属圭亚那是位于南美洲的法国海外领土，具有热带气候，分为雨季和旱季。人类活动主要集中在沿海地区，大部分土地被归类为原始雨林（Gibson等人，2011），形成了生物多样性丰富和多样的热点区域（Cajaiba等人，2020）。共有18个当地称为“Pripri”的淡水溪流或池塘（采样面积在10至20平方米之间）被用于传统采样和eDNA调查，另外还有12个淡水地点仅用于eDNA分析；采样时间介于2015年11月至2016年1月之间（图1，表1，图S1）。传统采样和eDNA采样同时进行，以消除时间效应。这些池塘和溪流全年都有水，且深度适中，可以步行到达。补充材料中提供了一些展示这些地点的图片（图S1）。

**2.2. 传统采样方法**
我们使用了五种刺网（长度10米，网眼大小0.5至3厘米），在不同的微生境中放置过夜以采集鱼类样本。对于无脊椎动物，我们在每个地点选择了五个微生境进行采样，使用面积为1平方米、网孔大小为25厘米×45厘米、网丝直径500微米的抄网进行采集。鱼类和无脊椎动物的采集均符合法国法律（声明编号166344）的规定。需要注意的是，我们的研究目的不是提供全面的群落组成清单，而是确定通过点采样获得代表性定量生物多样性数据的最有效策略。

**2.3. eDNA方法**
**2.3.1. eDNA技术**池塘和溪流的采样协议
采样工具包包括一个无菌水采样勺、一个自支撑的无菌Whirl-Pak袋、一个无菌注射器、手套（以减少污染）、一个VigiDNA 0.45 μM交叉流过滤胶囊（SPYGEN，Le Bourget-du-Lac，法国），以及一瓶80毫升的CL1保护缓冲液（SPYGEN，Le Bourget-du-Lac，法国）。使用手套和无菌水采样勺，在每个采样点边缘等距离的20个位置各采集100毫升水样，最终将这些样本汇集到无菌自支撑塑料袋中，得到大约2升的混合样本。在采集样本之前，先用采样勺轻轻旋转水柱顶部0.10米范围内的水体。采集人员不直接进入水中，以避免衣物或搅动沉积物造成的污染。将混合样本通过轻轻摇晃塑料袋进行均质化处理，然后通过VigiDNA胶囊过滤水样，直到袋中无水或胶囊堵塞为止。过滤完成后，将胶囊中的水倒出，加入80毫升CL1保护缓冲液，并在室温下保存，直到提取DNA。所有20个子样本都使用同一个采样勺进行采集，因为它们在过滤前会被合并到一个袋中。这样做的目的是确保综合样本能够反映该水域的整体生物多样性，而仅使用一个采样勺则无法达到这一效果。此外，我们的目标不是比较同一采样点内的20个单独子样本，而是获得该地点整体水生生物多样性的代表性数据。

**分子生物学和测序**
对于鱼类，eDNA宏条形码分析过程包括：提取每个VigiDNA过滤胶囊中的DNA（采样后几天内进行）、使用12S“teleo”引物进行DNA扩增（每个样本12次重复）、高通量测序及生物信息学分析，具体步骤遵循Pont等人（2018年）的描述。
对于无脊椎动物，DNA提取方法同样参照Pont等人（2018年）的协议。提取的DNA储存在-20°C条件下。无脊椎动物的PCR扩增混合液包含1单位的AmpliTaq Gold DNA聚合酶（Applied Biosystems，Foster City，CA）、10 mM Tris-HCl、50 mM KCl、2.5 mM MgCl2、0.2 mM dNTP、0.2 μM的16S引物“Inse01”（Inse01_F：5'-RGACGAGAAGACCCTATARA-3'；Inse01_R：5'-ACGCTGTTATCCCTAARGTA-3'；Taberlet等人，2018年），以及0.2 μg/μL的牛血清白蛋白（BSA，Roche Diagnostic，Basel，瑞士）。为了区分12个无脊椎动物PCR扩增产物，我们在每个“Inse01”引物中添加了独特的标签（Taberlet等人，2018年），以便在测序过程中能够将每个序列追溯到原始样本。无脊椎动物PCR扩增混合物在95°C下变性10分钟，随后进行3轮50个循环的扩增过程：每次循环包括30秒的95°C、30秒的52°C和1分钟的72°C；此过程重复50次。最后在专用房间内于72°C下进行7分钟的延伸步骤，该步骤在负压条件下进行，并与eDNA提取房间物理隔离。每个DNA提取物进行12次PCR扩增。扩增完成后，通过毛细管电泳（QIAxcel；Qiagen GmbH，Hilden，德国）进行纯化，再使用MinElute PCR纯化试剂盒（Qiagen GmbH，Hilden，德国）进行纯化，随后再次通过毛细管电泳进行定量。纯化后的样本被分成等体积的部分。文库制备和测序工作在Fasteris（Geneva，瑞士）完成，使用MetaFast协议（Fateris，https://www.fasteris.com/dna/?q&equals=content/metafast-protocol-ampliconmetagenomic-analysis）。配对末端测序（2 × 125 bp）在Illumina HiSeq 2500测序仪（Illumina，San Diego，CA，美国）上进行，使用HiSeq SBS Kit v4（Illumina，San Diego，CA，美国）和制造商提供的说明书。

**生物信息学**
序列数据使用OBITools软件包（http://metabarcoding.org/obitools；Boyer等人，2016年）中的程序进行分析。正反向读段通过iluminapairedend程序合并，仅保留对齐得分≥40的读段对。只有成功组装的序列才被保留用于后续分析，未合并的读段被丢弃。然后使用ngsfilter程序将读段分配到相应的样本中。如果序列长度小于20 bp或每个标签组合的出现次数少于10次，则被排除。接着在PCR产物中运行obiclean程序。所有标记为“internal”的序列（很可能为PCR替换或插入/缺失错误）被丢弃。OTU（操作分类单元）的分类鉴定使用ecotag程序和本地参考数据库Teleostei（Cilleros等人，2019年）进行。与本地参考数据库相似度低于98%的MOTU被丢弃。对于无脊椎动物，分析使用ENA数据库第118版中的标准序列（ecoPCR程序；Ficetola等人，2021年，用于模拟引物在参考序列数据库中的扩增）。对于相似度在96%到98%之间的序列，所有物种级别的鉴定结果下调至属级别；对于相似度在90%到96%之间的序列，所有物种和属级别的鉴定结果下调至科级别；最后，与参考数据库相似度低于90%的序列被丢弃。为了解决由于标签跳跃导致的序列错误分配问题（Schnell等人，2015年），所有在每个分类单元和每个文库中出现频率低于0.001的序列也被丢弃。这些阈值是根据经验确定的，旨在去除我们全球数据生成过程中包含的阴性对照样本的所有读段。

**统计分析**
鱼类和无脊椎动物的统计分析使用RStudios（版本2023.12.1 + 402）及以下软件包完成：vegan（版本2.6-4）、cluster（版本2.1.4）、ggpurb（版本0.6.0）和ggplot2（版本3.5.0）。我们还使用QGIS（Quantum Geographic Information System）版本3.34.2制作了采样点的地图。
对于每个采样点，将5个微生境重复样本的传统采样数据合并，以估计整个地点的生物多样性。通过绘制每个地点鱼类和无脊椎动物的分类丰富度（使用eDNA和传统采样方法），可视化alpha多样性（地点内的物种丰富度）。我们进行了Shapiro-Wilk检验，以确定鱼类和无脊椎动物的数据是否遵循正态分布。eDNA鱼类数据（W = 0.979，p值 = 0.933）和传统采样无脊椎动物数据（W = 0.963，p值 = 0.661）遵循正态分布，而传统采样鱼类数据（W = 0.599，p值 = 6.65×10^-6）和eDNA无脊椎动物数据（W = 0.883，p值 = 0.0292）则不遵循正态分布。因此，我们使用wilcox.test函数进行了非参数Wilcoxon秩和检验，以确定两种采样方法下的鱼类和无脊椎动物分类丰富度是否存在差异。我们还绘制了每个地点使用eDNA和传统采样方法（抄网）获得的鱼类Shannon多样性。为了估计beta多样性（地点间的多样性），使用Jaccard距离作为差异指标、平均距离作为聚类方法，对eDNA鱼类数据和抄网无脊椎动物数据进行了层次聚类。
为了测试传统采样和无DNA方法获得的丰富度之间的相关性，我们使用了Pearson相关性分析。
最后，生成了使用eDNA发现的鱼类分类单元和抄网发现的无脊椎动物分类单元的丰富度累积曲线，以评估我们的采样方法在识别法属圭亚那鱼类和无脊椎动物总生物多样性方面的有效性。

**结果**
3.1. 鱼类和无脊椎动物的多样性：比较eDNA与传统采样方法
在30个研究地点中，有18个地点同时使用了eDNA和传统采样方法（表1）。过滤原始测序数据后，共获得1,916,135条无脊椎动物读段和6,602,097条鱼类读段。
共鉴定出82种鱼类分类单元，其中71种在物种级别被鉴定，8种在属级别被鉴定（Ancistrus、Astyanax、Bryconops、Cyphocharax、Krobia、Leporinus、Moenkhausia和Pimodella），3种在科级别被鉴定（Characidae、Pseudopimelodidae和Rivulidae）。在这82种分类单元中，62种通过eDNA检测到，而只有13种通过刺网检测到；此外，有7种鱼类分类单元属于Genus Copella，但无法确定具体物种（表S1：鱼类1至鱼类7，图2A）。我们验证了所有鉴定出的鱼类都属于淡水生物。
对于无脊椎动物，抄网共鉴定出70个科，而eDNA仅鉴定出16个科，且这些科都通过抄网检测到。在鉴定出的70个科中，有一个分类单元仅在门级别被鉴定（Annelid），并单独列出；其中一个物种被鉴定为Euryhynchus amazoniensis，属于Euryrhynchidae，与其他69个科明显不同（详见表S2，图2B）。
eDNA检测到的鱼类分类单元数量多于传统采样方法（W = 315，p值 = 1.063×10^-6；图2A），而传统采样方法检测到的无脊椎动物分类单元数量多于eDNA（W = 18.5，p值 = 5.567×10^-6；图2B）。

**图2.** Venn图显示了法属圭亚那溪流和池塘中鱼类（A）和无脊椎动物（B）的传统采样和eDNA检测到的分类单元重叠情况。
每个地点检测到的分类单元数量用于表示alpha多样性。使用eDNA检测到的鱼类分类单元数量在地点7最多，共有32种。只有地点30的传统采样和eDNA检测到的鱼类分类单元数量相同（图3）。相比之下，传统采样方法检测到的无脊椎动物科数量最多，除了地点1，其中eDNA检测到9个无脊椎动物科，而传统采样方法检测到8个科（图3）。这些结果表明，在法属圭亚那的池塘和溪流中，使用传统方法（如抄网）可以更好地表征无脊椎动物的生物多样性，而使用eDNA可以更全面地估计鱼类生物多样性。因此，后续的多样性分析使用了eDNA数据（鱼类）和传统采样数据（无脊椎动物）。

**图3.** 使用传统采样（灰色）和eDNA（黑色）在每个地点测得的鱼类（A）和无脊椎动物（B）的分类丰富度。

3.2. 法属圭亚那淡水溪流和池塘的Shannon多样性
使用eDNA测得的鱼类Shannon多样性指数在地点30为0，在地点7为3.47，18个地点的平均值为2.57（图4）。使用传统采样数据测得的无脊椎动物Shannon多样性指数在地点26为1.6，在地点5为3.1，18个地点的平均值为2.51（图4）。

**图4.** 用Shannon多样性表示的alpha多样性。黑色圆圈表示使用eDNA测得的鱼类Shannon多样性；白色圆圈表示使用传统采样测得的无脊椎动物Shannon多样性。所有地点使用eDNA（蓝色）和传统采样（红色）测得的鱼类和无脊椎动物的平均Shannon多样性用虚线表示。
由于剩余的12个地点仅使用eDNA进行采样（表1），我们检验了使用eDNA检测到的鱼类分类单元数量与抄网检测到的无脊椎动物科数量之间的相关性。我们假设给定地点的鱼类和无脊椎动物多样性（Shannon指数）可能反映了潜在的宏观和微生境结构，因此可能存在相关性。根据这一假设，可以利用一个分类组的Shannon多样性来估计另一个分类组的预期多样性（当数据缺失时）。然而，未发现相关性（R2 = 0.00046，p = 0.93；图5）。

**图5.** eDNA鱼类丰富度与传统采样无脊椎动物丰富度之间的Pearson相关性。法属圭亚那淡水溪流和池塘中的β多样性研究

我们对结合了eDNA鱼类数据和传统采样无脊椎动物数据进行了层次聚类分析。观察到站点19与21、站点19与1之间存在相似性，站点4与2以及站点3与6之间也存在相似性。站点7也与站点4、2和6相似（图6）。我们还发现站点5和30的差异最大（图6）。总体而言，数据可以分为两组：一组包括站点2、3、4、6、7；另一组包括站点1、8、10、16、18、19、20、21、22、25、26（图6）。第一组中的站点彼此靠近，且位于Petit Saut湖上游，属于原始的淡水环境（原始森林）。然而，尽管站点5也位于Petit Saut湖上游，但它并未被纳入这一组（图6）。第二组中的站点分布更为分散，主要分布在沿海区域，代表受干扰较大的栖息地。站点30位于沿海区域，但并未被纳入第二组（图6）。

下载：高分辨率图片（1MB）
下载：全尺寸图片

图6. 通过Jaccard距离指数对传统采样和无脊椎动物eDNA检测到的平均多样性进行层次聚类分析的结果；以及用虚线标示各站点与其所属簇的对应关系。

3.4. 物种积累曲线
对于鱼类eDNA和无脊椎动物分类学的数据，积累曲线显示我们并未达到饱和状态，这表明我们在法属圭亚那进行的18个站点采样工作不足以完全揭示鱼类和无脊椎动物的全部多样性（图7）。

下载：高分辨率图片（194KB）
下载：全尺寸图片

图7. 通过eDNA检测到的鱼类物种数量（黑色曲线）和通过传统采样检测到的无脊椎动物科数量（红色曲线）的积累曲线。

4. 讨论
4.1. 估算小型热带淡水生态系统中的鱼类和无脊椎动物多样性的最佳方法
在小型热带水体（面积10至20平方米）中，使用eDNA与传统采样方法检测到的鱼类和无脊椎动物的分类丰富度存在明显差异。在法属圭亚纳等热带地区，使用eDNA似乎是准确识别鱼类群落多样性的最有效方法；而对于无脊椎动物，传统采样方法能检测到更多的科。尽管两种方法都检测到了16个共同的无脊椎动物科，但eDNA未能发现任何额外的物种，这表明它低估了这些环境中无脊椎动物科的多样性（Gleason等人，2021年；Van Der Lee等人，2024年）。相比之下，其他在温带（Niemiller等人，2018年；M?chler等人，2019年）和热带淡水地区（Lefrancois等人，2024年）进行的研究发现，eDNA在评估无脊椎动物多样性方面与传统采样方法相当或更有效。对于鱼类，我们的结果与Cilleros等人（2019年）关于热带淡水鱼类多样性的研究一致，他们发现eDNA的效果略优于传统采样方法。在我们的研究中，我们发现eDNA的效果更为显著。实际上，大规模、短期的传统采样方法可能会显著低估法属圭亚那鱼类物种的数量，包括一些稀有物种，如Hemmigramus ora（Zarske等人，2006年），该物种在法属圭亚纳被列为近危物种（UICN法国委员会MNHN，2017年）。事实上，我们仅通过eDNA在一个站点检测到了H. ora。尽管总体而言eDNA的表现优于传统采样方法，但仍有一些鱼类物种只能通过其中一种方法检测到。因此，单独使用任一方法都可能导致某些物种的遗漏。因此，要准确评估法属圭亚那的鱼类多样性，需要结合使用这两种方法。总体而言，我们的结果表明，在法属圭亚那进行生物多样性评估时，可以使用eDNA来研究鱼类，而对于无脊椎动物则仍需依赖传统采样方法。此外，鱼类多样性（eDNA）与无脊椎动物多样性（传统采样）之间缺乏相关性，这使得无法用鱼类多样性来预测无脊椎动物多样性，反之亦然。这意味着在热带地区评估无脊椎动物多样性时，仍需依赖耗时且劳动密集的传统分类学采样方法。

图6中的聚类模式清楚地显示了淡水群落的空间结构，将上游的原始森林区域与受干扰较大的沿海系统区分开来。这种模式反映了环境条件和人为压力对热带淡水生态系统群落组成的强烈影响。上游站点的聚集可能反映了更加均匀且受干扰较小的栖息地，而沿海站点的分布更广，表明环境异质性和干扰程度更高。重要的是，这种结构是由eDNA衍生的鱼类数据和传统采样的无脊椎动物数据共同作用的结果，进一步证明了这两种方法在捕捉β多样性模式方面的互补性。然而，一些异常站点（如站点5和30）的存在表明，局部环境因素（如水文条件或栖息地特征）可能会影响总体趋势。

4.2. 影响传统采样或eDNA方法识别物种的潜在因素
4.2.1. 水生生物的生理学和行为
使用eDNA检测到的鱼类丰富度高于传统采样方法，这可能是由于鱼类释放的DNA量较多（Civade等人，2016年；Lefrancois等人，2024年；Livia等人，2006年；McElroy等人，2020年；Tréguier等人，2014年），而使用网具捕捉所有鱼类物种较为困难。对于无脊椎动物，eDNA与传统方法之间的差异可能是由于它们在水环境中释放的DNA量较少，原因可能包括：(1) 它们具有外部骨骼（Tréguier等人，2014年；Krijn等人，2021年；Lefrancois等人，2024年）；(2) 它们在水柱中的数量较少（Deiner和Altermatt，2014年；Duarte等人，2023年）；(3) 它们的生活阶段，因为幼体比成体更频繁地蜕皮（Tréguier等人，2014年；Duarte等人，2023年）。由于采样发生在雨季开始时，一些无脊椎动物可能在幼虫发育后就已经离开水生栖息地进行繁殖和扩散（Malmqvist，2002年），因此在样本中数量较少。例如，成年白爪小龙虾Austropotamobius pallipes在休眠期eDNA检测率较低，而在蜕皮期间检测率较高（Troth等人，2021年）。对于鱼类而言，体型较大的个体释放更多的DNA到环境中，且成体比幼体释放更多DNA（Duarte等人，2023年）。鱼类的高DNA释放率还与它们通过鳃呼吸有关（Thalinger等人，2021年）。除了数量和生活阶段外，移动性也会影响eDNA或传统采样的效果。由于不同物种的移动性差异较大，传统采样方法的有效性各不相同，没有一种方法能完全捕捉所有物种；相比之下，eDNA可以补充这些方法，检测到那些可能被遗漏的物种。对于无脊椎动物来说情况则相反，它们的移动性较低，因此采样相对简单。正如Thalinger等人（2021年）所建议的，在选择采样方法和数据分析时应考虑生物的生理学和行为特征。

4.2.2. 热带地区特有的非生物因素
两种方法检测效率的差异可能是由于热带环境中的非生物因素，如降雨量大、紫外线辐射强、温度高和pH值低（Pilliod等人，2014年；Strickler等人，2015年；Eichmiller等人，2016年）。由于采样发生在雨季初期，大雨可能会稀释水中的DNA含量。然而，我们排除了这种可能性，因为水柱中的鱼类DNA含量很高，使得eDNA比传统采样方法能更好地识别鱼类群落多样性。也有研究表明，水温过高（>35°C）会影响水中鱼类DNA的含量（Robson等人，2016年）。尽管我们的研究中未测量温度，但之前的观察表明法属圭亚那的水温很少超过30°C（未发表数据）。不过，Lefrancois等人（2024年）在瓜德罗普河中比较了鱼类和甲壳类动物的DNA检测情况，发现第二次采样时水温升高和紫外线暴露并未影响检测效果。然而，很少有研究比较热带地区的季节性模式，因此需要进一步研究以确定哪些非生物因素会影响水中DNA的可用性和检测性。此外，水流也是影响DNA检测性的一个因素（Harrison等人，2019年）。不过，我们的研究是在整个季节中水流静止的小池塘和溪流中进行的。尽管如此，站点5检测到的鱼类物种数量较少，这可能是由于该站点的流速较高所致。综上所述，鱼类和无脊椎动物检测能力的差异主要由它们的生物学特性决定：鱼类通过黏液释放更多DNA，并且由于移动性较强而难以被捕获；而无脊椎动物由于具有外骨骼，释放的DNA较少，但更容易通过传统采样方法捕获。

4.2.3. 方法学偏差
两种方法都存在采样偏差。虽然eDNA方法每个地点仅过滤了2升水样，但样本涵盖了每个地点内的多种微生境。传统采样方法则在每个地点针对五种不同的微生境进行采样，以捕捉更多物种并更好地反映地点的异质性。然而，eDNA方法的局限性，特别是针对热带地区的遗传参考数据库的可用性和可靠性（Taberlet等人，2012年），可能影响了我们对无脊椎动物多样性的识别。在我们的研究中，我们使用了12S基因标记来检测鱼类，16S基因标记来检测无脊椎动物。虽然12S标记在鱼类群落中的应用可能导致一些近缘物种的误识别（Sales等人，2021年），但它是最适合识别鱼类多样性的标记（Zainal Abidin等人，2022年）。尽管这种标记的参考数据库不如线粒体细胞色素c氧化酶亚基I基因（COI）数据库完整，但这些引物不够特异。Poyntz-Wright等人（2024年）的元分析表明，16S、18S和COI基因标记在检测河流大型无脊椎动物方面都不如传统采样方法有效。Ficetola等人（2021年）在测试不同标记以建立参考数据库时发现，Inse01引物（16S基因标记）能够特异性地识别许多昆虫物种，但非昆虫物种的识别效率较低。他们的结果还显示，使用Euka02引物针对18S标记时识别范围较广，但容易误识别近缘物种；而使用BF1_BR2-COI引物进行COI扩增时只能识别部分无脊椎动物物种。Meyer等人（2021年）在使用Ficetola等人建立的参考数据库比较法属圭亚那溪流DNA样本中的COI、16S和18S基因标记时认为，至少需要两种基因标记才能准确识别无脊椎动物。因此，即使有特定的参考数据库，也强烈建议使用多种基因标记来评估无脊椎动物多样性。因此，选择用于估计热带淡水生物多样性的遗传方法主要取决于所研究的特定分类群。12S遗传标记似乎适用于鱼类多样性评估，而对于无脊椎动物，由于参考数据库的不完整性，eDNA宏条形码分析面临挑战。尽管如此，使用Inse01引物进行16S分析在参考数据库更加完善后可能会提供更好的结果。最后，传统的分类学方法也存在识别局限性，因为它们的准确性取决于进行识别的专家以及可用的鉴定关键，这可能会引入人为错误（Valentini等人，2016；Zainal Abidin等人，2022）。

4.3 实现采样效率的最佳方法
分类丰富度缺乏“平台期”表明，仅采样18个地点不足以检测该地区所有鱼类或无脊椎动物的生物多样性。实际上，虽然发现了69个鱼类分类群，但2017年法属圭亚那已知有349种淡水鱼类（UICN Comité fran?ais MNHN，2017）。然而，这里研究的淡水系统是水流缓慢的小池塘和小溪，而大多数鱼类生物多样性存在于亚马逊河流中。同样，Zainal Abidin等人（2022）发现，在马来西亚的一个河口使用12S或COI遗传标记并采样54个地点（每个地点1升水）也无法识别所有存在的鱼类生物多样性。据我们所知，没有其他研究比较过热带淡水生态系统中eDNA采样与传统网具采样的效果。我们的结果表明，在法属圭亚那的小型淡水系统中，无论是水样采集（每个地点采集2升水）还是使用网具采样（鱼类用刺网，每个微生境用抄网，每个地点5次采样）都不足以全面评估鱼类和无脊椎动物的多样性。

5. 结论
我们的目标是评估在大规模研究中，eDNA是否可以作为一种有效的方法来获得可靠的生物多样性数据，并能够在国家层面进行生物多样性评估。我们发现，在法属圭亚那的小型热带淡水溪流和池塘中，选择用于生物多样性评估的采样方法应考虑多个因素，包括所研究的特定分类群（鱼类与无脊椎动物）以及地点内的栖息地多样性。事实上，这些分类群的生理特性和行为可能使它们更适合某些采样方法。将eDNA宏条形码分析的结果与刺网采样和刺网采样进行比较时，eDNA在鱼类鉴定方面似乎更有效，而刺网采样在无脊椎动物鉴定方面更有效。然而，需要增加针对热带生态系统的eDNA研究，以丰富热带地区的参考数据库，因为这是由于数据库不完整性导致物种鉴定错误的主要限制。

**作者贡献声明**
India Elliott：撰写——初稿，正式分析，数据管理。
Marine Combe：撰写——初稿，调查，监督。
Alice Valentini：方法学，正式分析。
Rodolphe Elie Gozlan：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，验证，资源管理，项目协调，资金获取，正式分析，数据管理，概念化。

**伦理声明**
所有采样均遵循《名古屋议定书》进行，该议定书旨在确保公平公正地分享利用遗传资源所带来的利益，包括遵守有关访问和事先知情同意的国家法规。

**资助**
本研究得到了法属圭亚那亚马逊生物多样性研究中心（LabEx CEBA，http://www.labex-ceba.fr/）和国家研究署（ANR-17-CE35-0006-01 PRIME，http://www.agencenationale-recherche.fr/）的支持。IE由蒙彼利埃大学的IDIL研究生项目资助，该项目由法国政府（France 2030计划）通过国家研究署（ANR-21-SFRI-0004）提供资金支持。REG是《Water Biology and Security》期刊的编委会成员，未参与本文的编辑审查或发表决定。