解码用于氧四环素生产废水的全规模耦合处理工艺：工艺性能、转化路径及微生物群落特征

《Water Cycle》：Decoding a Full-Scale Coupled Treatment Process for Oxytetracycline Production Wastewater: Process Performance, Transformation Pathways, and Microbial Community Characteristics

　　洪刘|田田仁|梁梁石|石康周|永志陈|娟马|韩鹏月
兰州交通大学环境与市政工程学院，中国兰州730070

摘要
土霉素（OTC）是一种广泛使用的广谱抗生素，其生产过程中产生的废水含有极高浓度的有机物、铵氮（NH4+-N）和残留抗生素，对生态环境和人类健康构成重大风险。本研究采用了一个集厌氧发酵（UASB）、生物脱氮脱碳和高级氧化技术于一体的全规模联合处理系统，对土霉素生产废水进行处理，成功将OTC浓度从29.9～32.98 mg/L降低到0.007～0.064 mg/L，整体去除效率达到约97.9～99.98%。通过LC–MS信号演变分析和文献对比，推测OTC最终转化为低毒性的小分子，如C4H10O和C4H3O2。该联合工艺有效将COD和NH4+-N浓度分别从10,726～8,398 mg/L和2,354～1,818 mg/L降低到20～98 mg/L和3～37 mg/L。微生物群落分析显示，硝化菌（Nitrosomonas）、反硝化菌（Ottowia和OLB8）以及参与有机化合物转化的细菌属（如Terrimonas和Thauera）显著富集，表明它们在氮转化和抗生素降解过程中具有协同作用。在A/O工艺中经常观察到亚硝酸盐积累，这可能表明在特定操作条件下发生了部分硝化作用，可能与亚硝酸盐氧化菌（NOB）受到抑制有关。这一现象表明该系统在适宜条件下支持部分硝化–反硝化过程。此外，将系统升级为AOA或AOAO配置可能成为未来废水处理厂的有前景策略，提高稳定性、工艺多样性和能源效率，为土霉素生产废水的先进处理和标准化升级提供可行且可扩展的解决方案。

1. 引言
四环素类抗生素是全球产量和用量第二大的抗生素类别，中国是最大的生产国[1]、[2]、[3]。它们广泛应用于人类医学、畜牧业和水产养殖，是最常用的抗生素之一。其中，土霉素作为一种典型的发酵衍生四环素，由于在医疗和养殖行业的广泛应用，其产量持续增长[4]、[5]。土霉素生产废水含有高浓度的有机物、铵氮和残留抗生素，属于中国最难处理的复杂污染物之一[6]。如果这些污染物进入水环境，将对生态系统和人类健康造成长期危害[7]。目前的治疗方法包括物理化学方法、生物处理和联合工艺。物理化学技术如吸附、高级氧化和光催化具有反应速度快和操作灵活等优点，但成本较高且可能存在二次污染[8]、[9]。生物方法更为经济，但受抗生素抑制影响，需要较长的适应期[10]。结合这两种优势的联合工艺已成为全规模处理厂的主流选择[11]、[12]。特别是使用臭氧或二氧化氯的高级氧化工艺，在难降解抗生素降解方面表现出很强的协同效应（例如Biswal & Balasubramanian, 2022; Zango et al., 2025），为本研究将生物处理与氧化处理相结合提供了理论依据。实际运行中存在工艺适应性不足、出水水质波动和处理效率不稳定等问题，部分原因是系统设计忽略了抗生素的持续抑制作用和进水特性的变化。此外，传统硝化–反硝化工艺耗碳量大，与减排目标相悖[13]。大多数处理厂仅依赖COD和NH4+-N等常规指标进行操作控制，忽略了土霉素及其代谢物的影响。对污染物转化过程和微生物反应的认识有限，导致工艺优化缺乏科学依据。因此，亟需更高效、节能的处理策略。

土霉素生产废水具有高NH4+-N的特点[14]。现有研究表明，此类废水在硝化过程中易积累亚硝酸盐，表明存在较大的工艺优化潜力[15]、[16]。然而，大多数处理厂仅关注总氮（TN），忽视了亚硝酸盐这一关键中间体的动态变化，导致工艺控制不精确，错失了快速脱氮的机会。通过在亚硝酸盐阶段控制氨氧化，可以减少25%的氧气消耗和40%的有机碳需求，显著降低能耗和运行成本[17]、[18]、[19]，同时减少污泥产生，便于后续污泥处理和处置[20]。分析亚硝酸盐积累规律为优化快速硝化提供了理论基础，并推动了基于稳定亚硝酸盐供应的新型脱氮技术（如Anammox）的发展[21]。然而，关于全规模抗生素废水处理厂中亚硝酸盐稳定积累及其工程意义的研究仍有限。这些系统在长期运行中是否能够维持部分硝化作用，以及这种现象如何与抗生素降解过程相互作用，仍需进一步探讨。本研究重点关注亚硝酸盐积累，以发挥快速硝化–反硝化的潜力，为技术创新和可持续污泥管理提供基础。

选择厌氧发酵作为初始处理阶段，是因为土霉素生产废水含有大量易水解的碳水化合物和蛋白质，这些物质来源于玉米淀粉和大豆粉等发酵底物。在厌氧条件下，这些成分可转化为挥发性脂肪酸（VFAs），不仅提高生物降解性，还为后续反硝化过程提供内部碳源。通过对一个全规模土霉素生产废水处理厂一年的监测，本研究分析了常规指标（COD、NH4+-N、NO2--N、NO3--N）、土霉素含量及功能性微生物。研究目标包括：（1）探讨“厌氧发酵 + 厌氧/缺氧 + 高级氧化”系统中难降解有机物和土霉素的变化及去除情况；（2）定性和定量分析土霉素的代谢途径及代谢产物；（3）阐明A/O工艺中的氮转化途径和微生物协同作用，识别关键功能菌种；（4）基于长期运行数据和实际条件提出优化工艺。通过明确这些方面，本研究旨在弥合全规模工程性能与抗生素降解和氮转化机制理解之间的差距，为工艺优化和抗生素废水处理系统的可持续升级提供科学支持。

这项全规模分析不仅评估了污染物去除效果，还探讨了驱动土霉素降解和氮转化的生化及微生物机制。这些发现将工程实践与基础理论联系起来，使研究超越了技术评估，迈向机制探索。尽管生物–氧化联合系统已在抗生素废水处理中得到广泛应用，但仍存在一些关键知识空白。首先，大多数现有研究基于实验室或中试规模反应器，而全规模制药废水处理厂的长期运行数据有限；其次，不同处理单元中土霉素的转化途径在真实工程条件下的表征不足；第三，高抗生素废水系统中亚硝酸盐积累现象及其快速硝化潜力尚未得到系统评估。因此，本研究旨在调查全规模OTC生产废水处理厂的长期运行性能，利用LC–MS分析确定潜在的OTC转化途径，并分析与氮转化和有机污染物去除相关的微生物群落变化。研究结果为OTC的降解行为和快速硝化在真实工业废水条件下的可行性提供了新见解。

2. 材料与方法
2.1. 水样和污泥来源
采样时间选在四个不同季节的稳定运行期：T1（2023年1月13日，冬季）、T2（2023年5月13日，春季）、T3（2023年8月14日，夏季）和T4（2023年11月16日，秋季），以反映季节性运行条件变化。除了这些季节性采样外，全年还持续监测常规运行参数（温度、溶解氧、pH值和氮物种）。进水经过预处理单元后进入A/O系统，该单元主要去除大颗粒和悬浮固体，使进水特性相对稳定。水样从母液和各主要处理单元采集；污泥样从厌氧池和好氧池采集。所有样本在4°C下运输至实验室并离心分离水和污泥。污泥在–20°C下冷冻48小时，冷冻干燥后储存在–20°C。水样通过0.45 μm膜过滤以检测常规参数（NH4+-N、NO2--N、NO3--N），通过0.22 μm膜过滤以检测VFAs、3D-EEM荧光、土霉素和代谢产物。

2.2. 工艺流程图
土霉素生产废水的处理工艺流程主要包括三个部分（图1）：

2.3. 分析项目和检测方法
2.3.1. 常规分析项目和检测方法
本实验使用的常规水质指标及其检测方法见表S1。水样在分析前通过0.45 μm膜过滤。

2.3.2. 挥发性脂肪酸（VFAs）和三维激发-发射矩阵（3D-EEM）荧光光谱测定
挥发性脂肪酸（VFAs）测定：水样通过0.22 μm膜过滤后用10%（v/v）H3PO4溶液酸化至pH 4.0，然后转移到2 mL GC自动进样瓶中。分析使用Agilent 7890A气相色谱仪（配备火焰离子化检测器FID和DB-WAXetr柱（30 m × 530 μm × 1 μm）。进样器和检测器温度分别设定为220 °C和250 °C[22]。

2.3.3. 三维激发-发射矩阵（3D-EEM）荧光光谱测定
激发波长范围设定为200至400 nm（5 nm步长），发射波长范围设定为250至550 nm（5 nm步长）。扫描范围覆盖了样品中的所有荧光峰。每个样品的EEM扫描时间约为15分钟。使用超纯水（Milli-Q?）通过Milli-qEEM程序消除瑞利和拉曼散射效应[23]。三维激发–发射矩阵（3D-EEM）荧光光谱使用Hitachi F-7000荧光光谱仪（Hitachi High-Technologies，日本）进行测量。

2.3.4. 土霉素定量及转化和降解产物的定性分析
液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）定量：使用Shimadzu LC-MS 8040三重四极杆质谱仪进行分析。质谱参数如下：雾化气体流量3 L/min，脱溶剂管线（DL）温度250 °C，加热块温度400 °C，干燥气体流量15 L/min，数据采集时间4.20 min。LC系统采用二元高压梯度模式，总流量为0.300 mL/min；初始流动相B浓度设为15.0%（v/v）。柱温维持在35 °C。

2.3.5. 功能性微生物分析
由于生化反应阶段微生物种类复杂且数量众多，功能性微生物更具代表性。分析主要集中在生化反应阶段的厌氧池和好氧池。污泥样本在四个时间点采集：2023年1月13日（T1）、5月13日（T2）、8月14日（T3）和11月16日（T4）。首先使用冷冻干燥机将污泥样本冷冻干燥，然后使用Fast DNA Kit（Bio101，Vista，CA）提取总DNA。每个样本稀释十倍后用于PCR扩增。使用引物V3V4-1扩增细菌16S rRNA基因的V3–V4高变区，正向引物为338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′），反向引物为806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）。PCR产物纯化后用于Illumina MiSeq高通量测序[24]。测序数据经过质量过滤、OTU聚类、稀疏曲线分析、多样性指数计算、分类学分类和群落结构分析。高通量测序工作由广东Meagher Genetics Technology Co., Ltd.（中国）完成。原始测序数据已存入NCBI序列读取档案（SRA），访问号为PRJNA1433857.3。

**结果与讨论**

3.1. 四环素生产废水的长期运行特性
四环素制药废水具有高氨氮、高有机物质含量和显著的抗生素残留物[25]。本研究在甘肃省酒泉市的一个全规模四环素生产废水处理厂进行。该全规模处理系统包括预处理、生物处理（A/O）和高级氧化单元，如图1所示。水解酸化和厌氧发酵可以降解有机物，并将四环素等大分子转化为更小的可生物降解化合物，从而提高废水的可生物降解性[26]。在预处理过程中可能会去除大量四环素化合物，减少对后续氮去除过程的抑制[27]。A/O系统采用传统的硝化-反硝化工艺去除氮，同时消耗大量的COD作为碳源[28]。在长期运行中，好氧区的溶解氧浓度维持在约0.5–1.5 mg/L，温度根据季节变化在10–30 °C之间。

如图2所示，对出水质量的长期监测和在线pH值显示，出水始终符合中国发酵制药工业排放标准（GB 21903-2008），平均值为pH≈7、COD 50 mg/L、NH4+-N 25 mg/L、TN 45 mg/L，最高值分别为pH <8、COD <120 mg/L、NH4+-N <40 mg/L、TN <70 mg/L。然而，COD、NH4+-N和TN存在波动。COD最初下降后再次上升，这归因于进水COD浓度升高和四环素浓度变化抑制了厌氧发酵过程中的微生物活性[29][30]。第110天左右COD急剧下降，第150–300天之间的最低值可能是由于操作调整（如HRT、曝气、碳源补充）和负荷减少所致[31]。NH4+-N和TN的趋势高度相关：两者都先下降（0～75天），然后上升（75～125天），再次下降（125～200天），最后趋于稳定，反映了进水的波动和操作变化。

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**图2. 长期监测期间污染物去除的动态特性**

3.2. 整个处理过程的深入分析
四环素生产废水的处理主要目标是去除有机物和氮化合物。为了提高处理效率和稳定性，对整个过程进行全面分析至关重要。四环素生产废水含有高水平的有机物，这是处理的主要对象。四环素制造过程中引入的硫酸根离子进一步增加了处理的复杂性。自养和异养微生物都在反硝化过程中参与氮的转化，明确它们各自的作用和贡献仍然是一个关键的研究挑战。尽管四环素作为一种发酵产生的抗生素具有相对较高的生物降解性，但在生物系统中完全矿化仍然很困难。因此，对其代谢途径和中间产物的深入研究是必要的。

3.2.1. 关键污染物的命运和转化特性分析
为了阐明氧四环素（OTC）生产废水中污染物的转化和去除途径，对每个处理单元进行了详细分析（图3），重点关注氮物种（NH4+-N、NO2--N、NO3--N）和有机污染物（OTC、COD、VFAs）。

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**图3. 处理过程中污染物的变化趋势：**
(a) 氮物种（NH4+-N、NO2--N、NO3--N）和亚硝酸盐积累率（NAR）；
(b) 化学需氧量（COD）、氧四环素（OTC）和挥发性脂肪酸（VFAs）。

在整个处理过程中，NH4+-N出现了显著的变化（图3a）。NH4+-N主要来源于母液，而树脂再生废水中的NH4+-N含量很少。将这些流体在酸碱中和池中以大于1:1的比例混合，有效稀释了NH4+-N和其他污染物。除了稀释作用外，预处理阶段观察到的快速下降部分可能归因于物理化学过程，如pH值引起的沉淀、抗生素化合物在污泥颗粒上的吸附以及易降解有机底物的水解。这些机制共同解释了前端单元中多个参数的快速下降，而不意味着生物处理性能被高估。随后的A/O过程是NH4+-N去除的核心单元，其中功能性微生物促进了硝化和反硝化[32][33]。值得注意的是，亚硝酸盐的积累率达到99.9%，表明在某些操作条件下可能发生了部分硝化（方程式1）。

实现捷径硝化需要抑制亚硝酸盐氧化菌（NOB）并富集氨氧化菌（AOB）[34]。估计的游离氨浓度（FA ≈ 9.63 mg/L）可能抑制了亚硝酸盐氧化菌（NOB）[35]，因为FA >1 mg/L会强烈抑制NOB[36]。此外，高有机负荷和残留的OTC也可能影响NOB的活性，促进亚硝酸盐的积累[19][37][38]。操作参数如低DO、适宜的温度和pH值也有助于抑制NOB。与传统硝化相比，捷径硝化可以显著减少氧气和碳的需求[39][40]。尽管出水质量符合排放标准，但年间的波动表明需要升级工艺以实现稳定的捷径硝化-反硝化。

COD和OTC在整个过程中表现出相似的趋势（图3b），因为OTC是COD的来源之一，并被代谢为中间产物[26]。在厌氧发酵和A/O处理过程中，COD都显著下降，A/O阶段的COD去除速度更快，这归因于更丰富的微生物多样性。有趣的是，在高级氧化阶段COD略有增加，可能是由于顽固有机物分解为更小的可氧化分子。尽管如此，最终出水COD始终符合标准。VFAs在厌氧阶段之前持续增加，随后在A/O池中急剧下降，表明微生物更偏好VFAs作为碳源。

**总结：**当前的处理过程有效地去除了主要污染物，符合排放限制。A/O阶段显著的亚硝酸盐积累表明捷径硝化的可行性，支持其在工艺优化和节能方面的应用。

3.2.2. 使用三维激发-发射矩阵（3D-EEM）荧光光谱对有机物的定性和定量分析
三维激发-发射矩阵（3D-EEM）荧光光谱为废水处理系统中的溶解有机物（DOM）和有机污染物提供了分子指纹[41]。特定的光谱区域对应不同的成分：区域I（酪氨酸类蛋白质，可生物降解）；区域II（色氨酸类蛋白质，难生物降解）；区域III（富里酸类有机物，顽固的腐殖质部分）[42][43]；区域IV（可溶性微生物副产物，SMPs，可生物降解）；区域V（腐殖酸类有机物，化学惰性大分子）[44]。

在本研究中，应用3D-EEM追踪了氧四环素废水处理过程中有机物的命运（图4）。原始废水（图4a）在区域V显示出明显的峰值（Ex/Em = 250–380/400–500 nm），表明存在大量的顽固腐殖质类物质。在预处理过程中（中和至预UASB；图4b–d），区域V的荧光强度逐渐下降——这是由于pH值引起的沉淀、水解和厌氧活动——伴随着蓝移，表明腐殖质通过芳香性的降低或含氧基团的增加而结构简化[45][46]。UASB厌氧发酵后（图4e），区域III（富里酸类）和IV（SMPs）的荧光强度显著增加，表明顽固有机物（包括OTC代谢物）转化为可生物利用的部分[47][48]，而区域V的残留信号表明形成了新的腐殖质物质。在好氧和浮选阶段（图4e–h），区域III和IV的荧光强度下降，反映了异养微生物的降解作用，尽管腐殖质物质仍然存在[49]。高级氧化（图4i）通过自由基介导的腐殖质结构断裂，显著降低了区域V的荧光强度，实现了有效的脱色和顽固污染物的去除[8][50][51]。

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**图4. 处理过程中关键处理单元出水的三维激发-发射矩阵（3D-EEM）荧光光谱：**
(a) 酸碱中和池；
(b) 初级沉淀池；
(c) 水解酸化池；
(d) UASB反应器；
(e) 厌氧池（A-Tank）；
(f) 好氧池（O-Tank）；
(g) 二级沉淀池；
(h) 浮选单元；
(i) 高级氧化过程（AOP）单元。

3.2.3. 氧四环素及其代谢物的定性和定量分析
氧四环素（OTC）作为一种代表性的四环素抗生素，在环境科学和分析化学中引起了广泛的研究兴趣，因为它在制药废水中的环境命运和代谢转化机制备受关注[52]。通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）对处理单元中的代谢物进行系统分析，揭示了OTC的复杂降解行为[53]。OTC通过发酵大分子有机物（如玉米淀粉和大豆粉）合成，这些材料具有较高的生物降解性，因此容易被生物化学方法去除。在整个废水处理过程中，OTC的降解主要发生在厌氧发酵、生物化学反应和高级氧化阶段。微生物降解和共代谢驱动了OTC在厌氧/生物化学单元中的转化[54]，而化学氧化在高级氧化阶段实现了高效的去除[55]。本研究重点关注了来自原始进水（图5a）、厌氧发酵（图5b）、生物化学反应（图5c）和高级氧化（图5d）的LC-MS色谱图。定性和半定量分析系统地识别了处理链中的代谢物，并阐明了三种可能的降解途径（图5和6）。

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**图5. 关键处理单元出水的质谱图：**
(a) 母液；
(b) UASB反应器；
(c) 生物反应单元；
(d) 高级氧化过程单元。

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**图6. 氧四环素（OTC）在整个处理过程中的代谢途径。**

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**图7. 不同时间段微生物门类的相对丰度**
制造过程从初级种子培养开始，经过二级种子培养和发酵罐发酵，然后是压滤、脱色/结晶和最终分离/干燥。这一序列不可避免地会产生富含OTC的废水，其中包括结晶分离液和干燥液体，导致主要的OTC（C22H24N2O9，m/z=461）与小分子中间产物（如琥珀酸（m/z=118）、脱羧后的四环素片段（m/z=247）和C20H37NO9（m/z=435）共存。厌氧发酵依赖于兼性厌氧菌的胞外酶来介导双重机制：通过污泥表面将OTC从水相吸附转移到固相（非破坏性途径），同时通过微生物代谢进行实质性降解。据推测，水解产酸菌有助于OTC的环状断裂，而产氢甲烷菌则降解产生的小分子[19][37][38]。如图6所示的途径I，OTC（C22H24N2O9）首先通过微生物转化发生脱羟基作用形成C22H24N2O8（m/z=445）[25][56][57]，随后通过C4位的N-甲基化作用转化为C20H22N2O8（m/z=419）[57]。甲烷菌和异养微生物协同作用进一步降解残留的有机物。

途径I导致厌氧发酵出水中的OTC浓度略有下降，A/O生物化学处理进一步降低了其浓度（图5）。除了硝化-反硝化细菌用于去除氮外，A/O系统还含有许多异养微生物，它们利用有机污染物获取能量和生长，显著减少了水中的有机碳负荷。在途径I中，C20H22N2O8在生物化学阶段经历了两阶段转化：首先通过LC-MS谱图检测到的中间产物推断出C2酰胺基团的初步水解；随后C10羟基的氧化可能归因于氧化生物转化过程，最终形成C21H12NO7（m/z=390）[58]。途径II的核心反应也发生在生物化学阶段，其中C20H37NO9（m/z=435）经历了三步骨架重排：（1）β-酮脱羧作用在C4位发生脱氨基，形成亚胺中间体；（2）β-氧化作用断裂C2-C3键，释放出乙酰基（-CH2COOH）；（3）C12a位的羧基受到亲核攻击，发生分子内酯化，生成五元内酯C19H22O6（m/z=345）[59]。这些转化基于质谱碎片模式和文献比较提出，而不是通过特定关键酶的确认。在途径III中，C22H24N2O8通过苯环断裂、酰胺解离和羟基化作用转化为C18H24O2（m/z=274）[60]。这个中间体经历了双羟基去除；剩余的烷基链随后发生β-酮断裂和甲基重排，缩合为水溶性C4H6O3（m/z=102，暂定鉴定为甲基丙烯酸酯）[58]。需要强调的是，这些途径的分配基于代谢物的鉴定和文献报道，而不是通过功能基因或酶水平的分析。此外，由于全规模系统的复杂性和单四极质谱仪识别的局限性，一些中间产物的分配是基于m/z值和文献比较，而不是通过真实标准进行确认的。因此，结构解释可能存在一定的不确定性。此外，本研究侧重于转化趋势，而不是完整的元素质量平衡；并非所有中间产物的碳和氮都进行了严格量化，因为一些产物可能进一步矿化或被纳入生物质和污泥中。增强微生物多样性驱动复杂的反应网络，在质谱检测中产生更丰富的差分m/z特征。生化反应器的出水在进入高级氧化系统之前，会先在二次澄清器中进行固液分离，从而显著减少有机污染物，包括土霉素（OTC）及其副产品和代谢物（图5）。该处理厂采用芬顿氧化法，其中过氧化氢生成高活性的·OH自由基来分解难降解的有机物。在途径I中，C20H22N2O8通过脱烷基化、CO2羧基化和脱氢-芳香化转化为C21H12NO7（m/z=390），随后通过环裂解生成C4H10O（m/z=74）和C4H3O2（m/z=83）。途径II直接通过β-断裂从C19H22O6生成C4H3O2。这些途径的协同作用显著降低了OTC的含量。LC–MS分析表明OTC浓度降至分析方法的检测限以下。然而，这一结果并不一定意味着完全矿化。最终出水主要含有小分子：C4H10O和C4H3O2。发酵产生的土霉素（OTC）废水不可避免地会产生高浓度的OTC，因此需要有效处理。降解特性分析证实，综合工艺——中和/初次沉淀/水解酸化/UASB/A/O/二次澄清/浮选/高级氧化——能够高效净化含OTC的废水。尽管出水符合发酵制药废水的排放标准，但由于存在低毒性的小分子产物（C4H10O和C4H3O2），残余COD仍较高。完全解毒需要对循环化合物的风险控制策略进行进一步研究。还应注意的是，所提出的降解途径主要基于LC-MS光谱解释和与先前报道的转化机制的比较。由于废水基质的复杂性以及缺乏所有中间化合物的准确标准，某些代谢物的归属可能存在不确定性。因此，本研究中提出的途径应被视为假设的转化途径，而不是完全验证的生化机制。

3.3. 微生物群落组成及其潜在功能作用
分析了四个季节时间点的微生物群落组成，以探讨微生物动态与污染物去除性能之间的联系。需要注意的是，以下功能解释是根据分类学归属和文献报告推断的，因为本研究未进行功能基因或转录组分析。
在运行过程中观察到门组成的时间和相对丰度的变化。所有四个采样时期（T1-T4）的核心优势门包括拟杆菌门（Bacteroidota）、变形菌门（Proteobacteria）、疣微菌门（Verrucomicrobiota）、绿弯菌门（Chloroflexi）、厚壁菌门（Firmicutes）和放线菌门（Actinobacteriota）。拟杆菌门在T1-T4期间的相对丰度最高（峰值41.77%），通过分泌纤维素酶/蛋白酶降解大分子有机物。尽管高浓度OTC会抑制其活性[61]，但长期运行导致了适应性富集。这种门主要栖息在厌氧区域，通常与废水系统中的反硝化过程相关[62]。变形菌门是第二丰富的门（T1:27.26%；T2:32.38%；T3:44.24%；T4:29.22%），包含许多参与氮转化的属[63]。疣微菌门（T1-T4: 13.93%-4.82%）、绿弯菌门（7.89%-2.17%）和厚壁菌门（8.51%-1.07%）也有显著存在。Zhang等人报告在抗生素暴露下疣微菌门富集[64]，表明其可能具有OTC降解作用。绿弯菌门被报道参与废水系统中的硝化和反硝化过程[65]，而厚壁菌门在OTC压力下由于形成内生孢子而增加丰度，从而增强环境适应性[66]。总体而言，这些门可能基于生态关联参与有机物降解和氮转化，尽管仅凭16S rRNA数据无法直接确认其在OTC降解中的具体作用[67]。
在属水平上识别出典型的硝化菌、反硝化菌和OTC降解菌（图8）。所有四个时期的核心属（T1-T4）——OLB8、Limnobacter、Thauera和Truepera——的相对丰度分别为10.99%、29.27%、5.17%和4.43%。OLB8和Thauera被广泛认为是反硝化菌，可能有助于系统中亚硝酸盐的还原[68]。在本研究中，Thauera的相对较高丰度被解释为活跃的反硝化能力的标志，而不是OTC降解的直接证据。尽管一些报告表明Thauera可以参与某些芳香族或难降解化合物的降解[69]，但在这里其作用应被视为在反硝化条件下的可能共代谢或间接贡献，而不是确认的OTC特异性降解功能。

图8. 长期监测期间功能微生物群落属水平的时间序列热图。
亚硝酸盐积累来源于两种机制：部分硝化和硝酸盐还原为亚硝酸盐。Limnobacter是一种硝酸盐还原菌[70]，在反硝化过程中与OLB8和Thauera协同作用，维持亚硝酸盐积累。Truepera表现出对极端条件（如抗生素压力）的高适应性，与Thauera协同作用降低系统中的OTC水平[71]。
特定时期的属被识别出来：unclassified_f_NS9_marine_group（T1-T2期间分别为28.54%和15.12%）与硝化相关环境有关[72]；Nitrosomonas在T3-T4期间主导氨氧化（1.67%-3.41%）[73]。在典型周期中观察到亚硝酸盐积累的波动（图3a），微生物群落动态表明进水变化驱动了生态演替，从而破坏了亚硝酸盐积累的稳定性。Pseudomonas（T4:18.23%）和Ottowia（T1-T2:3.79%-7.12%）是常见的反硝化菌，可能支持氮的去除。unclassified_f_Xanthobacteraceae被报道在碱性条件下降解芳香化合物[74]，这可能表明其对OTC的芳香结构具有耐受性；然而，其在此过程中的具体参与尚未直接证实。Liu等人进一步报道了其在将氨基酸转化为氨方面的作用，促进了后续的硝化-反硝化过程[75]。Ferruginibacter和Terrimonas在T3中被检测到，具有不同的功能：前者在降解有机物的同时还原硝酸盐/亚硝酸盐[25]；后者在抗生素浓度下丰度增加[76]，可能表明其对含OTC环境的耐受性，从而降低系统负荷。

总之，根据分类学归属和先前报道的生态作用，几个属被初步关联到硝化、反硝化或抗生素耐受性。然而，这些分类代表的是推断的功能倾向，而不是该系统中特定代谢活动的直接证据。例如，unclassified_f_NS9_marine_group和Nitrosomonas与硝化相关环境相关，而Arenimonas主要作为异养菌参与有机物降解，而不是直接硝化；反硝化菌（Ottowia、OLB8、Limnobacter、Pseudomonas）和耐抗生素或潜在的共代谢分类单元（Terrimonas、unclassified_f_Xanthobacteraceae、Thauera、Truepera、LD29、Ferruginibacter）。这些分类反映了推断的功能倾向，而不是该系统中特定代谢途径的直接证据。低丰度属包括unclassified_f_Parachlamydiaceae、unclassified_f_AKYH767、unclassified_f_AKYH767、unclassified_f_AKYG1722、Enterococcus、Bryobacter和Moheibacter——在生化过程中协同作用。微生物多样性有助于长期运行稳定性。尽管属组成和丰度存在季节性变化，但硝化、反硝化和OTC降解的集体功能生物量保持一致，有效去除有机物、氮污染物和抗生素。

4. 环境意义和未来展望
目前，土霉素生产废水的处理依赖于厌氧发酵结合A/O工艺，可以满足当前的“发酵制药工业废水排放标准”（COD ≤ 100 mg/L，BOD ≤ 30 mg/L，NH4+-N ≤ 15 mg/L）。然而，高能耗、过量的醋酸钠添加和运行不稳定显著限制了工艺效率。基于本研究的长期运行表现，尽管现有的厌氧–A/O配置实现了有效的污染物去除，但仍存在一些工程限制。
AOAO和AOA工艺通过多阶段生物处理解决了这些问题：(1) AOAO工艺：增加了额外的厌氧/好氧阶段（图9），使得难降解有机物（如土霉素）的降解更彻底，提高了氮和磷的去除效率。重复的厌氧-好氧序列增强了解毒作用，减少了抗生素残留，并改善了氧气和碳的利用。这种分阶段配置可能有助于逐步有机转化和负荷缓冲，从而在进水条件波动的情况下提高工艺稳定性。(2) AOA工艺：引入厌氧区，利用内部碳源加强反硝化，从而减少对外部碳的依赖并提高氮的去除效率。厌氧和厌氧条件也有助于抗生素化合物的分解[77]。引入厌氧区可以增强内源性碳的利用，从而减少外部碳的需求并降低运行成本。

这两种升级工艺可能比传统的A/O配置具有优势：(1) 提高COD、NH4+–N和抗生素的去除效率；(2) 减少能源和碳源消耗；(3) 提高对负荷变化的适应性；(4) 更好地符合严格的排放标准。应强调，这些提出的配置是基于本研究的运行洞察得出的前瞻性优化策略，而不是在此进行的直接实验验证。
总之，将现有的A/O系统改造为AOAO或AOA配置是一种可行且有效的策略，有助于提高土霉素废水的处理效果，符合节能、运行稳定性和环境安全的目标。因此，未来的研究应通过试点规模或全规模验证研究进一步评估AOAO和AOA工艺的工程可行性、经济性能和长期稳定性。

5. 结论
通过对全规模土霉素（OTC）废水处理厂进行全年监测，发现厌氧发酵、厌氧/好氧（A/O）处理和高级净化的联合工艺能够有效去除有机物、氮和OTC。预处理（水解酸化和UASB）去除了易降解的有机物，并将大分子OTC转化为较小的分子。在A/O过程中观察到的亚硝酸盐积累表明，在某些运行条件下可能发生了部分硝化。生物过程进一步促进了有机物的降解和残留OTC的去除。后续的高级处理（浮选和氧化）消除了持久性污染物。尽管出水符合发酵制药废水的排放标准，但在生化处理过程中观察到水质波动和显著的亚硝酸盐积累。这些发现为工艺优化提供了机会。AOA和AOAO工艺为提高处理效率和降低能耗提供了有希望的替代方案。未来的研究应采用宏基因组学和代谢组学方法进一步阐明降解机制。

Tiantian Ren：撰写——原始草稿，可视化；Hong Liu：撰写——审阅与编辑，监督，概念化；Shikang Zhou：数据管理；Liangliang Shi：监督；Yongzhi Chen：监督；Hanpeng Yue：数据管理；Juan Ma：监督