一种来自中国北部的新Metaphire属（寡毛纲，巨蚓科）物种，其线粒体基因组数据已获得

《ZooKeys》：A new species of the genus Metaphire (Oligochaeta, Megascolecidae) from northern China with data from the mitochondrial genome

　　刘青宇|赵慧峰|阿斯佩·M·诺尼永|张玉峰|张文琪|张振江|董彦杰
中国辽宁省沈阳市沈阳师范大学生命科学学院，邮编110034
菲律宾棉兰老岛纳awan市棉兰老州立大学环境与生命科学学院
https://ror.org/01f51gm92

**摘要**
本研究描述了一个新物种——Metaphire wenanensis Liu & Zhao（新种），该物种的鉴定结合了形态特征和分子数据。该新种被归入M. houlleti组，其特征为在6/7–8/9位置有三对精巢孔，且在阴门前后均无生殖器标记。精巢通过一个盘状腔与体壁相连，该腔位于精巢与体壁之间。利用线粒体基因组数据分析了M. wenanensis Liu & Zhao（新种）在M. houlleti组中的系统发育位置。这是近几十年来在中国北方首次记录到巨蚓科（Megascolecidae）的新物种。

**引言**
蚯蚓构成了大型动物群生物量的重要组成部分，是大多数栖息地中土壤动物群落的关键组成部分（Shukla等人，2024年），在土壤生物系统中发挥着关键作用。作为土壤生态系统的重要驱动因素，对其分类和系统发育的研究不仅有助于我们理解其生态功能，对生物多样性保护也具有重要意义。目前全球已记录有超过6000种蚯蚓，主要分布在陆地生态系统中（姜和邱，2024年）。巨蚓科（Megascolecidae）属于寡毛纲（Oligochaeta）中最大的科之一（孙，2013年）。该科包含85个属，其中Amynthas（Kinberg，1867年）和Metaphire（Sims & Easton，1972年）属的物种数量最多（Misirlio?lu等人，2023年），在中国分别约有476种和135种及亚种（赵等人，2025年）。巨蚓科蚯蚓的特点是阴门位于第15节或之前，第18节（偶尔为第17节或第19节）有一对雄孔（徐和小肖，2011年），在中国蚯蚓群落中占主导地位。Amynthas和Metaphire属的物种合计占中国蚯蚓总数的89%（赵等人，2025年）。然而，巨蚓科在中国的分布并不均匀；四川省、广西壮族自治区、台湾省和海南省等省份记录的物种数量均超过79种（孙，2013年；赵，2015年；姜，2016年；孙等人，2018年；董等人，2024年；金等人，2024年）。而在中国北方进行的巨蚓科调查中，仅记录了19种/亚种（徐和小肖，2011年；董等人，2024年；韩等人，2024年，2026年；赵等人，2025年）。相比之下，中国北方地区（包括北京市、天津市、河北省和山东省）的巨蚓科分类研究相对有限，主要集中在北京市和天津市，仅记录了10种/亚种，其中大多数为广泛分布的种类，如A. hupeiensis（Michaelson，1895年）、A. pingi（Stephenson，1925年）、A. carnosus carnosus（Goto & Hatai，1899年）、A. carnosus naribunji（Blakemore，2013年）、M. guillelmi（Michaelsen，1895年）、M. tschiliensis（Michaelsen，1928年）、M. vulgaris（Chen，1930年）、M. asiatica（Michaelsen，1900年）、M. schmardae（Horst，1883年）和M. houlleti（Perrier，1872年）（黄等人，2006年；徐和小肖，2011年；张等人，2017年；韩等人，2024年）。这些记录主要来自19世纪和20世纪，除了A. carnosus naribunji（韩等人，2024年，这是在中国新发现的物种）。这表明中国北方的巨蚓多样性呈现出南方更多、北方较少的明显模式。因此，将研究重点转向中国北方地区尤为重要。

在Metaphire属中，M. houlleti组是一个定义明确的核心组，其特征为在6/7–8/9位置有三对精巢孔，双精巢结构，且阴门后方无生殖器标记（Sims和Easton，1972年）。该组包含56个已描述的物种，其中大多数分布广泛。Sims和Easton（1972年）对该组的命名和描述做出了重要贡献，为该组的分类研究奠定了基础。此外，该组中的10个物种在1972年后在印度（M. manipurensis Tiwari & Yadav，2024年（Tiwari等人，2025年））、泰国（M. khaoluangensis Bantaowong & Panha，2016年；M. khaochamao Bantaowong & Panha，2016年；M. songkhramensis Chanabun & Panha，2023年（Bantaowong等人，2016年；Ratmanee等人，2023年）和越南（M. acampanulata Nguyen，Ly，Lam，Nguyen & Nguyen，2022年；M. amplectens（Michaelsen，1934年）；M. honbaensis（Gates，1941年）；M. dorsobitheca（Thai & Huynh，1992年）；M. catbaensis（Thai & Le，1993年）；M. dalatensis Phan，Lam & Nguyen，2026年（Michaelsen，1934年；Thai等人，1992年；Thai和Le，1993年；Nguyen等人，2022年；Phan等人，2026年）也有报道。近二十年来，中国对该组的研究进展迅速，确认了26个物种，包括20个最初由Sims和Easton（1972年）描述的物种，以及M. sanmingensis Sun & Jiang，2018年（孙等人，2018年）、M. hanbaiduensis Dong & Sun，2024年（董等人，2024年）、M. donganensis Jin & Jiang，2024年（金等人，2024年）、M. liaoningensis Han & Zhao，2025年（赵等人，2025年）、M. jinhensis Ren，2025年和M. ebianensis Ren，2025年（Ren等人，2025年）。

由于可靠的分类特征有限以及标本成熟度的限制，蚯蚓的分类工作颇具挑战性（Pop等人，2003年）。自20世纪90年代以来，分类学家开始使用DNA序列作为物种鉴定的工具。然而，蚯蚓的研究起步较晚，直到2003年才发表第一篇相关论文（Pop等人，2003年）。尽管如此，分子数据已被证明是界定蚯蚓物种不可或缺的方法（Pop等人，2003年；Chang和Chen，2005年；Chang等人，2007年、2008年、2009年；Chang和James，2011年）。其中，线粒体细胞色素c氧化酶亚基I（COX1）基因已被证明对蚯蚓物种鉴定非常有效且准确（Pérez-Losada等人，2005年，2012年；Chang等人，2009年；Rougerie等人，2009年；Chang和James，2011年；Porco等人，2012年）。虽然COX1条形码技术对物种界定很有用，但在解决物种以上的系统发育关系时存在局限性（Chang和James，2011年）。目前，线粒体基因组（mitogenome）已被证明是解决蚯蚓系统发育关系的强大工具（Sun，2013年；赵等人，2015年；张等人，2016c；Sun等人，2018年；赵等人，2022年）。与单基因标记相比，线粒体基因组在系统发育研究中具有显著优势，其高突变率、无内含子以及较长的长度（>10,000个碱基对）使其成为更优的选择（张等人，2016c）。线粒体基因组的综合数据还便于研究关键的基因组特征，如基因内容和排列，从而成为详细准确的蚯蚓系统发育研究的重要资源。

本研究描述了来自中国北方河北省廊坊市文安县的一个新巨蚓科物种——M. wenanensis sp. nov.。此外，还利用13个蛋白质编码基因（PCGs）的线粒体基因组数据对该新物种进行了系统发育分析，旨在验证其分类地位，并探讨其在M. houlleti组中的进化位置，以及其在中国北方的分布背景。

**材料与方法**
2023年5月10日，在中国河北省廊坊市文安县兴隆宫镇采集了蚯蚓标本。通过挖掘和手工分选的方式采集蚯蚓。采集到的蚯蚓在现场立即用100%乙醇保存，随后在实验室中置于-20°C条件下保存，以进行后续的形态学和分子分析。模式标本及其他副模标本均保存在中国河北省廊坊师范学院（C-HLU）。

**形态学检查**
使用立体显微镜（ZEISS）和ZEN 3.3 pro软件对14个具有阴门的标本（凭证ID：LFWA_01–14）的外部和内部形态特征进行了检查，以帮助识别和测量小器官及其他用于形态分析的特征。测量了体长和直径，并记录了雄孔、雌孔、精巢、前列腺腺、砂囊和盲肠等形态特征（单位：毫米）。物种鉴定和分类依据遵循Sims和Easton（1972年；徐和小肖，2011年）。

**DNA提取、扩增和测序**
使用TIANGEN Genomic DNA Kit DP304-03（北京，中国）从每个标本的后部区域提取了总基因组DNA。随后，对指定为LFWA_01的M. wenanensis sp. nov.标本以及M. sanmingensis和M. tschiliensis的7个个体进行了高通量测序，采用DNBseq平台（武汉，中国）的配对末端150 bp测序策略。根据Zhao等人（2022年）的方法对原始测序数据进行了清洗处理。线粒体基因组序列使用MitoZ v2.4（Meng等人，2019年）进行组装和映射，并使用在线工具MITOS2（https://usegalaxy.org/root?tool_id=toolshed.g2.bx.psu.edu%2Frepos%2Fiuc%2Fmitos2%2Fmitos2%2F2.1.3%20galaxy0）进行注释。线粒体基因组序列及其注释随后提交至GenBank（表1提供了访问号）。

**表1. 本研究分析的标本信息及在线可用的DNA数据**
| 标本ID | 物种 | 基因标记 | 访问号 |
| --- | --- | --- | --- |
| LFWA_02–LFWA_14 | M. wenanensis sp. nov. | COX1 | PX55289–PX55290 |
| | M. tschiliensis | COX1 | PP52763–PP52767 |
| | M. tschiliensis | COX1 | PP52757–PP52757 |
| | M. liaoningensis | COX1 | PP52773–PP52773 |
| | M. guillelmi | COX1 | PP52773–PP52773 |
| | M. guillelmi | COX1 | KT429017 |
| | M. vulgaris | COX1 | KJ137279 |
| | M. vulgaris | COX1 | PQ72081–PP52781 |
| | M. trutina | COX1 | AY96080–AY96214 |
| | M. sanmingensis | COX1 | KY7743–KY77438 |
| | M. donganensis | COX1 | PP49709–PP497094 |
| LFWA_01 | M. wenanensis sp. nov. | mitogenome | PX369608 |
| | M. sanmingensis | mitogenome | PZ099867 |
| | M. tschiliensis | mitogenome | PP507116 |
| | M. tschiliensis | mitogenome | PP504842 |
| | M. tschiliensis | mitogenome | PP504841 |
| | M. tschiliensis | mitogenome | PP507117 |
| | M. tschiliensis | mitogenome | PP504838 |
| | M. tschiliensis | mitogenome | PP504839 |
| | M. liaoningensis | mitogenome | PP507115 |
| | M. liaoningensis | mitogenome | PP504837 |
| | A. gracilis | mitogenome | KP68858 |
| | A. corticis | mitogenome | KM199290 |
| | A. aspergillum | mitogenome | KJ830749 |
| | M. vulgaris | mitogenome | KJ137279 |
| | A. aspergillum | mitogenome | OR161103 |
| | A. triastriatus | mitogenome | KT429016 |
| | M. guillelmi | mitogenome | KT429017 |
| | A. carnosus | mitogenome | KT429008 |
| | M. posthuma | mitogenome | MW222472 |
| | A. deogyusanensis | mitogenome | OK55882 |
| | M. megascolidioides | mitogenome | LC726529 |
| | M. tosaensis | mitogenome | LC726512 |
| | A. yambaruensis | mitogenome | LC726555 |
| | A. carnosus | mitogenome | LC726524 |
| | A. robustus | mitogenome | LC726556 |
| | A. californica | mitogenome | LC726499 |
| | A. hupeiensis | mitogenome | LC726513 |
| | A. tappensis | mitogenome | LC726521 |
| | A. tokioensis | mitogenome | LC726526 |
| | A. agrestis | mitogenome | LC726525 |
| | A. glaucus | mitogenome | LC726553 |
| | Polypheretima elongata | mitogenome | LC726551 |
| | Perionyx excavatus | mitogenome | EF494507 |

COX1基因通过聚合酶链反应（PCR）扩增，使用的正向引物为LCO1490（5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’）（Folmer等人，1994年），反向引物为COIE（5’-TATACTTCTGGGTGTCCGAAGAATCA-3’）（Bely和Wray，2004年）。PCR混合物的总体积为25微升，包含1微升的DNA模板、17.25微升的无菌蒸馏水、2.0微升的dNTP混合物、2.5微升的反应缓冲液、0.25微升的Easy Taq聚合酶（TransGen Biotech Co., LTD，北京，中国）、1.0微升的LCO1490和1.0微升的COIE。热循环参数设置为：初始变性步骤在95°C下进行5分钟，随后是35个循环，每个循环包括在95°C下变性30秒、在51°C下退火30秒以及在72°C下延伸30秒。过程以在72°C下进行5分钟的最终延伸步骤结束。扩增的PCR产物被送往天益汇源生物科技有限公司（北京，中国）进行Sanger测序。COX1序列已存入GenBank，本研究中包含的其他序列也从GenBank中检索（登录号见表1）。这些序列之间的遗传距离使用Kimura 2参数（K2P）模型计算（Kimura 1980），该模型在MEGA 5.0中实现（Tamura等人，2011年）。

为了初步推断物种假说，对COX1标记应用了两种方法：自动分区组装物种（ASAP）的距离矩阵方法（Puillandre等人，2021年）和广义混合Yule共祖（GMYC）的系统发育方法（Fujisawa和Barraclough，2013年）。ASAP是一种基于COX1的自动化物种界定方法，旨在识别独特的条形码间隙，即遗传距离阈值，从而确定两个个体是否属于同一物种。ASAP的主要优点之一是它比任何依赖于树重建的方法都要快得多，并且可以在线执行（https://bioinfo.mnhn.fr/abi/public/asap）。ASAP也不太容易出现匹配错误。GMYC是一种使用单基因座数据的物种界定统计方法，它通过分析基因树的分支模式来区分物种，应用Yule模型来描述物种间的多样化，并应用中性共祖模型（Hudson 1991）来描述物种内的分支。GMYC分析使用R语言中的splits v. 1.0-19包（Ezard等人，2017年）进行。GMYC的输入文件使用BEAST包v. 1.7.5（Drummond等人，2012年）准备，包括设置Yule过程树先验和对数正态松弛时钟模型。使用TreeAnnotator（包含在BEAST包中）生成Newick格式的超度量、分叉和有根树，并作为GMYC分析的输入。最终树在FigTree v. 1.4.4中可视化（Rambaut 2022）（http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/）。

来自34种蚯蚓的分类群的线粒体基因组数据被用来推断M. wenanensis sp. nov.在密切相关的分类群中的系统发育位置（登录号见表1）。Perionyx excavatus Perrier, 1872被用作外群。使用gbseqextractor_v2.py脚本（Meng等人，2019年）从GenBank文件中提取了13个PGCs。系统发育重建使用了最大似然（ML）和贝叶斯推断（BI）框架进行。ML分析在RAxML 8.0中实现，采用快速爬山算法在GTRGAMMAI模型下识别最优树拓扑结构，通过1000次快速自举复制来评估分支支持。对于使用MrBayes v. 3.2.6（Ronquist等人，2012年）进行的贝叶斯分析，执行了两百万次马尔可夫链蒙特卡洛（MCMC）迭代，直到分裂频率的平均标准差降至0.01以下。通过jModelTest 2.1（Darriba等人，2012年）使用赤池信息量准则选择了核苷酸替换模型，结果为PGCs选择了GTR+I+G。收敛诊断和燃烧期评估在Tracer v. 1.7.2（Rambaut等人，2018年）中进行，所有参数的有效样本量（ESS）均超过200。

**分类学**
- 科：Megascolecidae Rosa, 1891
- 属：Metaphire Sims & Easton, 1972
- 分类单元：Animalia
- Crassiclitellata
- Megascolecidae AAAA7A8E-2D29-512B-81B1-E42DCB2B0C4A
- Metaphire wenanensis https://zoobank.org/D80A893A-443F-4D7D-B21E-B3AA7F4F488D
- Liu & Zhaosp. nov.

**图1** 下载：下载高分辨率图像（1MB）
**图1.** 新种Metaphire wenanensis sp. nov.的正模标本（LFWA_01）。A. 前口；B. 雄性孔的腹视图；C. 子房囊区域的腹视图；D. 背孔；E. 食道；F. 腹肠盲肠；G. 右侧子房囊；H. 左侧前列腺；I. 精液囊。
- 缩写：amp = 精液囊；div = 憩室；dp = 背孔；mp = 雄性孔；prg = 前口；sp = 子房囊孔；sv = 精液囊。
- 刻度尺：1毫米。

**图2.** 新种Metaphire wenanensis sp. nov.的正模标本（LFWA_01）的线描图。A. 子房囊区域的腹视图；B. 雄性孔；C. 右侧子房囊。
- 缩写：amp = 精液囊；div = 憩室；mp = 雄性孔；sp = 子房囊孔。
- 刻度尺：1毫米。

**图3.** 基于COX1序列的M. houlleti组的物种界定。MORPHO：形态学界定；ASAP：自动条形码间隙发现；GMYC：广义混合Yule共祖模型。分支附近的数字表示贝叶斯后验概率。新种用红色标示。

**材料检查**
**正模标本：**
- 一个环节动物（LFWA_01），采集于河北省廊坊市文安县兴隆宫镇（38.90973°N, 116.23225°E，海拔5米）。采集日期：2023-05-10。采集者：赵慧峰。
**副模标本：**
- 五个环节动物[LFWA_02, 03, 05–07]，与正模标本数据相同。
- 八个环节动物[LFWA_04, 08–14]，与正模标本数据相同。所有类型和其他标本保存在C-HLU中。

**描述：**
- 中等大小，长度90–105毫米，直径7–10毫米，环节数105–110个。前口有突起。第12/13节之间有背孔。第6/7–8/9节之间腹侧有三对子房囊孔。第18节腹侧有雄性孔，分布在身体周围约1/3的位置。第14节腹侧有一个雌性孔。环节带呈环状，跨越第14–16节，没有刚毛。生殖器标记缺失。第IX–X节有食道。盲肠从第XXVII节开始，向前延伸至第XXIII节。第VII–IX节有三对子房囊；精液囊几乎呈椭圆形，表面光滑，精液囊导管长而粗，基部膨大。憩室起源于精液囊导管膨大部分的下方，近端细长，向远端显著弯曲。第XI–XII节有精液囊。第XVI–XIX节有一对发育良好的前列腺，呈囊状，带有细长的U形前列腺导管。

**外部特征：**
- 长度90–105毫米。身体颜色黄白色，背面比腹面深；环节带呈淡黄白色。宽度7–10毫米，环节数105–110个。前口有突起（图1A）。第12/13节有第一个背孔（图1D）。第14–XVI节环节带呈环状；没有刚毛。刚毛排列方式：每环42根（V节）、48根（XII节）、56根（XX节）。雄性孔之间的刚毛数量：第V节10–11根。雌性孔位于第14节腹侧的裂缝状开口中。

**内部特征：**
- 第IX–X节有食道。第XI–X节有简单的肠盲肠，从第XXVII节开始向前延伸至第XXIII节；然而，有些盲肠延伸至第XXII节（图1F）。第VII–IX节有三对子房囊；精液囊几乎呈椭圆形，表面平坦光滑，长度1.09–2.56毫米，宽度1.37–1.93毫米；精液囊导管长而粗，基部膨大，长度0.91–1.52毫米；憩室起源于精液囊导管膨大部分的下方，近端细长，向远端显著弯曲，接受器长度1.09–3.01毫米。憩室连接到精液囊导管的一个盘状腔室。腔室面积1.66–2.48平方毫米，附着在身体壁上（图2C）。

**睾丸囊：** 第XI节有一对。第XI和XII节有两对发育良好的精液囊，后者较大（图1I）。前列腺在第XVI–XIX节成对出现，呈囊状。

**词源：**
- 物种名称指的是河北省廊坊市文安县的类型产地。

**分布：**
- 中国北方（河北省）

**栖息地：**
- 标本采集自淡水河岸边的河岸土壤中。土壤类型为富含有机物的沙壤土，采集深度约为20厘米。植被覆盖以柳树（Salix spp.）为主。

**备注：**
- 新种Metaphire wenanensis sp. nov.属于M. houlleti组，该组约有56个物种。该组的特征是在第6/7–8/9节有三对双室子房囊孔，孔的位置和环节带的形态具有一致性。新种在形态上与M. tschiliensis、M. vulgaris和M. guillelmi相似。M. wenanensis sp. nov.的关键区别特征包括：第一个背孔从第12/13节开始（而M. vulgaris和M. tschiliensis是从第11/12节开始）；没有前节和后节生殖器标记；雌性孔不显著（与M. tschiliensis的第14节上的单个腹孔相反）（表2）。

**表2.** 新种M. wenanensis sp.与其他物种的比较
| 特征 | M. wenanensis sp. nov. | M. sanmingensis | M. donganensis | M. tschiliensis | M. vulgaris | M. liaoningensis | M. guillelmi |
|--------------|--------------|------------|-------------|-------------|-------------|-------------|
| 长度（毫米） | 90–105 | 55–113 | 55–113 | 91–159 | 120–215 | 125–190 |
| 宽度（毫米） | 7–10 | 4–5.5 | 4.6–7 | 6.5–7 | 5–8 | 7–8 |
| 环节数 | 105–110 | 55–8 | 67–8 | 111–111 | 11–16 | 59–124 |
| 第一个背孔位置 | 12/13 | 11/12或12/13 | 12/13 | 11/12 | 12/13 | 12/13 | 12/13 |
| V节上的刚毛数量 | 42 | (V) | 23–32 | (V) | 45–50 | (V) | (V) | (V) |
| 子房囊孔间距 | 0.21–0.27 | C | 0.33 | C | 0.29–0.30 | C | C |
| 雄性孔间距 | 0.24–0.29 | C | 0.33 | C | 2/5 | C |
| 雄性孔之间的刚毛数量 | 10–11 | 8–9 | 18–13 | 10–17 | 12–22 | 14–21 |
| 前节生殖器标记 | 缺失 | 存在 | 缺失 | 存在 | 存在 | 缺失 | 缺失 |
| 后节生殖器标记 | 缺失 | 存在 | 缺失 | 缺失 | 存在 | 缺失 | 缺失 |
| 食道 | 第IX–XX–XI | 第IX–XIX | 第IX–XIX | 第IX–XIX | 第IX–XX |
| 盲肠 | 第XXVII–XXIII | 或某些XXII | 第XXVII–XXIV | 第XXVII–XXII | 第XXVII–XXII |
| 附属腺 | 缺失 | 缺失 | 缺失 | 存在 | 存在 | 缺失 | 缺失 |
| 精液囊基部腔室 | 存在 | 缺失 | 缺失 | 缺失 | 缺失 | 缺失 |

**M. wenanensis sp. nov.在形态上也与M. liaoningensis相似。**
- 两个物种的前一个背孔都从第12/13节开始，并且第18节有成对的前列腺。相似之处还体现在雄性孔的数量和位置、子房囊以及食道上。然而，两个物种在生殖器标记和附属腺方面有所不同：M. wenanensis sp. nov.没有前节和后节生殖器标记以及附属腺，而M. liaoningensis有前节生殖器标记和第VII、XIII、IX节的三对乳头状附属腺。新种的精液囊特征非常独特。与其他所有M. houlleti组成员不同，M. wenanensis sp. nov.的精液囊导管和憩室之间有一个盘状腔室。据我们所知，这一独特的解剖结构在所有比较的M. houlleti物种中是独一无二的。

**分子物种界定：**
- 基于COX1基因的K2P分析显示，M. wenanensis sp. nov.的种内遗传距离范围为0%至2.1%。新种与其他M. houlleti物种组的物种之间的种间遗传距离范围为15.2%（与M. donganensis相比）至19.9%（与M. vulgaris相比）（表3）。具体来说，该研究将形态学分类的M. tschiliensis划分为三个MOTU（分子操作单元），而M. trutina和M. donganensis各自被划分为两个MOTU。尽管ASAP方法与形态学分类相比存在一些细微差异，但其表现优于GMYC方法，这一发现得到了其他关于蚯蚓分子物种划分研究的证实（Goulpeau等人2022年；Liu等人2025a、2025b年）。尽管ASAP、GMYC和形态学分类的结果之间存在一些差异，但这三种方法在划分M. wenanensis新种时显示出高度一致性，将其归为一个与其他物种不同的独立MOTU。因此，M. wenanensis新种被确认为M. houlleti组中的一个独立新物种。

**线粒体基因组特征**
M. wenanensis新种（正模标本LFWA_01）的线粒体基因组是一个长度为15,092 bp的环状分子（图4A）。它包含37个基因，其中包括13个蛋白质编码基因（PCGs，11,117 bp）、2个核糖体RNA基因（rRNAs，2,047 bp）、22个转运RNA基因（tRNAs，1,400 bp）以及一个假定的控制区（528 bp）。该线粒体基因组的基因排列与其他M. houlleti组成员相同（图4A、B）（Zhang等人2016a；Zhao等人2025年）。

**系统发育分析**
M. wenanensis新种和M. sanmingensis的线粒体基因组被可视化展示（图4A、4B）。结合公开数据，13个线粒体基因组中的PCGs揭示了M. wenanensis新种与其他M. houlleti组物种之间的系统发育关系（图4C）。结果表明，M. tschiliensis、M. vulgaris、M. guillelmi、M. liaoningensis和M. wenanensis新种形成了一个得到强烈支持的单系群（后验概率=100%，自助法值=100%），而M. sanmingensis则聚集在该单系群之外。这一发现表明，目前定义的M. houlleti组可能不是一个单系群。在主要单系群内部，M. wenanensis新种代表了一个与其他四个物种明显分离的独立谱系，这支持了其作为新物种的地位。同时，这个新物种在M. houlleti组中相对处于较基部的位置，尽管由于该组中超过50个物种没有线粒体基因组数据，并非所有物种都被包含在内。

**讨论**
本研究描述了M. wenanensis新种，这是近一个世纪以来首次在中国北方，特别是河北省文安县发现的巨蚓科（Megascolecidae）新物种。分子数据为物种划分提供了强有力的支持。M. wenanensis新种与其他M. houlleti组成员之间的K2P距离（15.2–19.9%）显著超过了Jeratthitikul等人（2017年）提出的蚯蚓物种分化的最低遗传距离阈值（13%），也高于Nguyen等人（2021年）报告的Metaphire属内物种间差异的值。这进一步支持了将M. wenanensis新种认定为一个独立物种的观点。ASAP和GMYC方法都将该新物种划分为一个独立的MOTU。同时，形态学特征也支持该新物种属于M. houlleti组的地位。该物种群的特点是在精巢基部具有独特的盘状腔结构（Xu和Xiao 2011；Jiang 2016；Han 2025）。

值得注意的是，基于是否存在交配囊来区分Metaphire属和Amynthas属的做法受到了分子系统发育研究的挑战，这些研究一致认为这两个属是非单系的（Zhang等人2015年）。尽管如此，形态学仍然是蚯蚓分类学中描述和鉴定物种的主要依据，目前尚未对该组进行全面的修订。在本研究中描述的新物种中，交配囊发育良好，在解剖过程中清晰可见，符合将它们归入Metaphire属的传统形态学标准（Sims和Easton 1972）。因此，根据当前的分类惯例，我们将M. wenanensis新种归入Metaphire属。我们认识到，未来结合更广泛的分子和形态学数据的综合研究可能会最终导致这些属的重新分类。

基于目前可用的有限线粒体基因组数据（56个已描述物种中的5个），系统发育分析表明M. wenanensis新种可能代表M. houlleti组中的一个基部谱系（图4）。然而，现有数据还表明M. sanmingensis并未与M. wenanensis新种、M. tschiliensis、M. guillelmi和M. vulgaris聚类在一起（图4C），这表明M. houlleti组可能不是一个单系群。这一观察结果进一步强调了当前系统发育框架的临时性质。由于样本数量有限，这些分类和关系应被视为初步结论。下文讨论的地质和生物地理学观察结果为这一物种可能的古老起源提供了背景信息，但并未独立证明这一点。

首先，模式产地位于海河流域，这是华北平原形成和演化过程中的关键水文框架。该河流系统的新近纪时期开始形成河流格局，具有相对较长的地质历史（Wu等人2008年），可能为古代土壤动物群提供了稳定的长期栖息环境。其次，巨蚓科是一个进化上古老的谱系，在早侏罗世完成了其主要辐射演化（Qiu和Bouche 1998年）。随后在晚白垩世开始了物种水平的多样化，祖先谱系从晚白垩世到新生代早期开始在中国定居（Jiang和Qiu 2018年）。因此，在这个前寒武纪起源的地质稳定克拉通——华北平原中发现该科的潜在残余谱系，在系统发育和生物地理学上是合理的。未来需要开展更广泛的线粒体基因组采样研究，以更全面地测试进化关系并修订该组的定义，因为初步数据表明其并非单系群。

**结论**
本研究报道了一个新的物种M. wenanensis新种，属于M. houlleti组，并提供了其COX1基因和线粒体基因组的数据。该新物种分布于河北省文安县，是中国北方首次记录的巨蚓科新物种。中国的巨蚓科蚯蚓分布不均，更多记录来自中国南方。未来的研究应重点扩展对华北地区的调查，以更好地了解M. wenanensis新种的地理分布，并加深对华北地区巨蚓科蚯蚓的分类和分布认识。

**利益冲突**
作者声明不存在任何竞争利益。

**伦理声明**
未提交伦理声明。

**人工智能使用**
作者对稿件的内容负全责，包括任何人工智能的使用情况。在准备本稿件过程中未使用任何人工智能工具。

**资金支持**
本研究得到了中国科技基础资源调查计划（2025FY100800）、河北省自然科学基金（C2025408018）、廊坊市科技支持计划（2025013067）以及国家自然科学基金（32470459）的资助。

**作者贡献**
概念设计：Liu Q.和Zhao H.；标本鉴定：Liu Q.和Zhao H.；方法学和实验：Liu Q.、Zhang Z.和Zhang W.；数据分析：Liu Q.、Dong Y.和Zhao H.；初稿撰写：Liu Q.、Dong Y.和Zhao H.；审稿和编辑：Liu Q.、Aspe NM.、Zhang Y.和Zhao H.

**作者ORCID**
Q. Liu：https://orcid.org/0009-0009-1325-2251
H. Zhao：https://orcid.org/0000-0003-4243-9671
N.M. Aspe：https://orcid.org/0000-0003-0025-6017
Y. Zhang：https://orcid.org/0000-0002-4066-6355
Y. Dong：https://orcid.org/0009-0004-3360-3673

**数据可用性**
支持本研究所有发现的数据均包含在正文中。