基于儿童癌症患者来源类器官建立的儿科癌症研究

《Cancers》：Establishment of Patient-Derived Organoids for Pediatric Cancer Research Muhammad Younis, Tarlan Arjmandi, Mohammad Haque, Katherine McClain, Thussenthan Walter-Angelo, Franklin Back, Divya Gandra, Abigail Moore, Chandrika Behura and Giselle Saulnier Sholler + 4 authors

背景/目标：儿科癌症主要是由基因组和表观遗传改变驱动的发育失调性疾病。精确模拟这些发育差异对于理解儿童癌症的独特生物学至关重要。患者来源类器官（PDOs）提供了一个强大的体外平台，能够重现肿瘤异质性、可塑性、微环境（包括免疫细胞）及疾病相关特征。方法：在此，研究人员描述了从儿科脑肿瘤、颅外实体瘤活检及骨髓穿刺液样本中建立PDOs的逐步方案，包括肿瘤处理、类器官培养/传代和冷冻保存。结果：此外，研究人员展示了将PDOs用于进一步实验分析的应用，如荧光成像、Western blotting（WB）、流式细胞术和免疫组织化学（IHC），以研究肿瘤发生的潜在病理生理学。结论：将类器官技术扩展到儿童恶性肿瘤领域，对于阐明儿科肿瘤生物学和推进治疗策略具有非凡的前景，代表了技术与临床需求的长期融合。

本研究由Muhammad Younis、Tarlan Arjmandi、Mohammad Haque等学者共同完成，发表于《Cancers》期刊。该研究聚焦于儿科癌症模型构建领域，针对儿童肿瘤独特的生物学特性，建立了系统的患者来源类器官（PDOs）培养与分析体系。

研究背景与现状

儿童癌症与成人恶性肿瘤在发病机制上存在本质区别。成人癌症通常源于长期积累的基因突变，而儿童肿瘤多由发育程序的失调驱动，伴随显著的表观遗传改变和谱系特异性致癌事件。传统的二维（2D）细胞培养模型虽然有助于基础分子机制的研究，但缺乏真实的组织结构、细胞间通讯及三维（3D）空间布局，无法反映肿瘤的异质性、细胞谱系转变以及对治疗的反应。尽管类器官技术在成人癌症研究中已广泛应用，但在儿科实体瘤领域的发展相对滞后，主要受限于技术难度、样本获取困难以及儿童肿瘤非上皮来源的生物多样性。因此，开发能够忠实保留原发肿瘤特征、模拟体内微环境的生理相关模型迫在眉睫。

研究目的与意义

本研究旨在建立一套标准化的儿科癌症PDOs构建流程，涵盖从神经外科活检到骨髓穿刺液的多种样本类型，并利用多维度的分析技术验证其生物学保真度。这一工作不仅填补了儿科肿瘤3D建模的技术空白，也为后续的药物筛选、生物标志物发现及个性化医疗提供了坚实的实验基础。

关键技术方法

研究人员采用了多中心临床试验（NCT04715178, NCT03581240）获取的儿科癌症患者样本，包括神经母细胞瘤（NB）、尤文肉瘤（EWS）、骨肉瘤（OS）、横纹肌肉瘤（RB）、弥漫性内生性脑桥胶质瘤（DIPG）、髓母细胞瘤（MBL）、肝母细胞瘤（HP）及多层菊形团胚胎性肿瘤（ETMR）。关键技术手段包括：（1）利用Matrigel基质胶进行3D类器官培养与传代；（2）通过酶消化（胶原酶IV、Dispase II、TrypLE Express）实现类器官的机械与生化解离；（3）采用Western blotting检测增殖（PCNA）、干性（Nanog、SOX2）、间质（Vimentin）及癌基因（N-myc）蛋白表达；（4）应用流式细胞术分析类器官内的免疫细胞亚群（CD45、CD3、B220、CD11b）；（5）结合H&E染色与Ki-67免疫组化评估组织学特征；（6）利用Cyto3D活死细胞试剂盒进行细胞活力分析。

研究结果

1. 患者来源类器官的建立与生长动力学

研究人员成功构建了八种不同类型的PDOs，并优化了培养条件。通过测试不同细胞密度（5×10³、1×10⁴和5×10⁴细胞/孔），确定1×10⁴细胞/50μL Matrigel为最佳接种浓度。结果显示，PDOs在两周内表现出显著的生长动态和结构形态学变化，且经冻存复苏后仍保持良好的增殖能力，证明了该模型系统的稳定性和可扩展性。

2. PDOs保留肿瘤的增殖、干性及异质性细胞组成

Western blot分析证实，所有PDOs均保留了关键的肿瘤生物学特征。N-myc蛋白在神经母细胞瘤类器官中高表达，PCNA证实了活跃的细胞增殖，而Nanog和SOX2的表达则揭示了癌症干细胞（CSCs）群体的存在。值得注意的是，骨肉瘤PDOs表现出较低的Vimentin（波形蛋白）表达，反映了其特定的间质特征。这些结果表明PDOs在蛋白水平上忠实地维持了原发肿瘤的分子图谱。

3. 骨髓穿刺液来源的类器官构建

除了实体瘤组织，研究人员还创新性地利用骨髓穿刺液建立了NB和EWS的类器官模型。流式细胞术分析显示，这些类器官不仅包含肿瘤细胞（CD45^?），还保留了CD3⁺T细胞、B220⁺B细胞和CD11b⁺髓系细胞等多种免疫细胞亚群。进一步分析显示，神经母细胞瘤模型中存在CD44（间质标记）和PHOX2B（去甲肾上腺素能标记）共表达的异质性细胞状态，证实了该类器官能够有效模拟体内肿瘤微环境的复杂性。

4. PDOs重现肿瘤的组织学特征

组织病理学分析显示，NB和MBL来源的PDOs经H&E染色后呈现出与原发肿瘤相似的组织结构。Ki-67免疫组化染色呈阳性，表明类器官内存在高比例的增殖细胞。此外，Cyto3D活死细胞染色结合Sartorius Incucyte系统成像，直观地展示了类器官内部细胞的活力分布，验证了该模型适用于药物敏感性测试和细胞毒性评估。

讨论与结论

研究人员在讨论中指出，传统2D模型在模拟肿瘤结构、发育背景及免疫复杂性方面存在固有缺陷，而PDOs的出现为解决这些问题提供了理想的替代方案。特别是对于罕见且样本量小的儿童癌症，PDOs能够从微小的活检组织或体液样本中扩增出大量具有代表性的活体材料，这对于研究肿瘤内异质性、耐药性机制及复发原因至关重要。

结论部分强调，本研究成功建立了反映儿科实体瘤多样性特征的PDOs模型。这些模型不仅在组织学结构和谱系特异性标记物表达上保留了原发肿瘤的特征，还重现了肿瘤微环境中的免疫组分。所开发的类器官模型可作为临床前研究的稳健平台，为儿科癌症的精准医疗策略转化奠定基础，并为早期临床试验的候选治疗方案筛选提供有力依据。尽管PDOs目前缺乏功能性血管系统且在长期培养中可能存在基质细胞丢失的风险，但其与自体免疫细胞共培养及体内验证的潜力，仍使其成为推动儿童癌症研究的重要工具。