利用CRISPR介导的大肠杆菌W代谢工程实现大豆乳清中棉子糖的选择性生物纯化

《Microorganisms》：CRISPR-Mediated Metabolic Engineering of Escherichia coli W for Selective Biopurification of Stachyose from Soybean Molasses Haotian Wang, Guoyu Liu, Jia Liu, Yifei Zhu, Jingmei Huang, Shiwei Liu, Huaping Pan, Yafang Li, Yan Zou and Peng Yuan + 6 authors

大豆乳清是酒精法生产大豆浓缩蛋白的副产物，富含棉子糖及其他功能性低聚糖，但其高含量的蔗糖及其他可发酵非目标糖阻碍了棉子糖的高效纯化。本研究系统比较了四种常用微生物底盘或生产菌株——大肠杆菌W、大肠杆菌BL21、酿酒酵母魏恩斯蒂芬34/70及毕赤酵母GS115——的糖利用模式，以筛选适用于选择性富集棉子糖的宿主。其中，大肠杆菌W在快速消耗非目标糖的同时保留棉子糖方面表现最佳。基于此菌株，研究人员应用CRISPR-Cas9工程策略，删除了内源性α-半乳糖苷酶基因melA并过表达了蔗糖通透酶基因cscB。所得菌株能从大豆乳清中选择性地、近乎完全地去除蔗糖及其他非目标糖，将棉子糖占总可溶性固形物（TSS）的比例从<30%提高至>90%。进一步优化氮源水平、接种量及初始°Brix改善了发酵性能。这些结果展示了一种从大豆乳清中选择性富集棉子糖的有效生物预纯化策略。

该研究针对大豆乳清中棉子糖纯化难题，开发了一套结合底盘筛选、基因工程与工艺优化的集成策略。大豆乳清作为大豆蛋白生产的副产物，虽富含棉子糖等益生元，但高浓度的蔗糖及复杂的单糖组分导致传统物理分离方法成本高昂且效率低下。现有生物纯化方法常面临非目标糖去除不彻底与目标寡糖降解之间的权衡瓶颈。为此，研究人员首先筛选了四种微生物底盘在棉子糖保留与蔗糖消耗上的差异，锁定大肠杆菌W为最优宿主，进而利用CRISPR-Cas9技术对其进行代谢重塑，并结合响应面法优化发酵参数。研究结果表明，该策略成功实现了棉子糖纯度的大幅提升，为植物源副产物中功能性低聚糖的提取提供了新范式。该成果发表于《Microorganisms》。

研究人员主要采用以下关键技术方法：首先，对四种微生物底盘（大肠杆菌W、大肠杆菌BL21、酿酒酵母魏恩斯蒂芬34/70及毕赤酵母GS115）进行糖利用模式的系统比较，以鉴定合适的宿主。其次，利用CRISPR-Cas9基因组编辑系统对大肠杆菌W进行代谢工程改造，通过同源重组删除内源性α-半乳糖苷酶基因melA，并在该位点整合组成型启动子J23100驱动的蔗糖通透酶基因cscB表达盒。第三，采用高效液相色谱（HPLC）定量分析发酵过程中果糖、葡萄糖、蔗糖、棉子糖等可溶性糖的组成变化。最后，通过单因素实验结合Box-Behnken响应面设计，对氮源水平、接种量和初始可溶性固形物含量（°Brix）等关键工艺参数进行优化。

研究结果如下：

1. 1.
   大豆乳清中糖的种类与含量
   研究人员通过HPLC分析确认大豆乳清的主要糖分构成为蔗糖（53.20%）、棉子糖（26.24%）及水苏糖（6.76%），呈现出以蔗糖为主导的碳水化合物谱。这种高糖背景虽然增加了分离难度，但也表明通过选择性去除非目标糖可实现棉子糖的富集。
2. 2.
   不同底盘菌株在大豆乳清中的蔗糖消耗与棉子糖保留情况
   通过比较四种菌株的发酵行为，发现大肠杆菌W表现出最快的蔗糖消耗速率（12-36小时内急剧下降）及最高的棉子糖保留率（比例增至81.79%）。相比之下，酿酒酵母魏恩斯蒂芬34/70虽能快速消耗蔗糖，但同时几乎完全降解了棉子糖；大肠杆菌BL21和毕赤酵母GS115的蔗糖利用率较低。因此，大肠杆菌W被选为进一步工程化的底盘。
3. 3.
   构建并PCR验证melA缺失与cscB过表达的工程菌株
   研究人员构建了两种工程菌株：大肠杆菌W melA^?（删除melA基因）和大肠杆菌W melA^?cscB⁺（在melA位点整合J23100-cscB表达盒）。通过PCR基因分型验证，确认melA基因已被成功删除（扩增片段由2308 bp变为952 bp），且J23100-cscB表达盒已正确整合（扩增出799 bp片段）。
4. 4.
   通过melA缺失与cscB过表达实现大豆乳清中棉子糖的选择性保留与富集
   发酵分析显示，亲本大肠杆菌W和melA^?菌株在消耗蔗糖和棉子糖的同时伴随有甘露三糖的积累。而工程菌株melA^?cscB⁺在72小时内将蔗糖降至1%以下，同时最大程度保留了棉子糖，使其占总可溶性固形物（TSS）的比例从约27%提升至约92%，且未检测到明显的甘露三糖积累，证明了该工程策略的有效性。
5. 5.
   棉子糖纯度的工艺参数筛选与响应面优化
   单因素实验表明氮源水平、接种量和初始°Brix均影响棉子糖纯度，其中°Brix影响最为显著。通过Box-Behnken响应面优化，建立了二次多项式回归模型。预测的最优条件为：氮源（磷酸氢二铵）5.9 g/L、接种量1.5%、初始可溶性固形物2 °Brix。在此条件下，验证实验获得的棉子糖纯度达90.91 ± 0.52%（60小时），与预测值高度吻合。

讨论部分总结指出，大豆乳清不仅是低成本原料，其固有的糖分构成使其特别适合通过生物预纯化实现棉子糖的选择性富集。底盘依赖性的糖利用模式是决定选择性的关键，大肠杆菌W因其高效的蔗糖基础代谢特性优于其他测试菌株。结合melA缺失与cscB过表达的策略证明，选择性生物纯化依赖于目标糖保护与非目标糖消耗的协调调控；阻断α-半乳糖苷酶途径减少了棉子糖损失，而过表达cscB则通过维持后期的蔗糖摄取通量，间接抑制了细胞转向替代性寡糖转化路径。工艺优化进一步证实，初始°Brix是控制富集效果的最关键因子，存在一个最佳的底物浓度窗口。尽管实验室规模取得了成功，但未来仍需关注放大过程中的批次差异及潜在的副产物转化机制。

结论部分阐明，本研究成功利用大豆乳清作为底物，通过整合底盘筛选、CRISPR-Cas9代谢工程和发酵工艺优化，实现了棉子糖的选择性生物富集。大肠杆菌W被证明是最佳底盘，melA基因的删除与cscB基因的过表达显著提高了棉子糖纯度。该工作为从大豆乳清中富集棉子糖提供了一种实用策略，并为植物源副产物中棉子糖家族寡糖的选择性生物纯化构建了通用框架。