用于糖尿病骨髓炎抗感染及微环境重塑以促进骨再生的轻度光热响应型H2Se递送水凝胶

《Bioactive Materials》：Mild photothermal-responsive hydrogel with H2Se delivery for anti-infection and microenvironment remodeling to bone regeneration in diabetic osteomyelitis

糖尿病骨髓炎由高血糖微环境加剧，导致细菌感染增加和骨组织破坏，显著提高了截肢风险。目前的抗生素疗法因日益严重的抗生素耐药性和生物膜屏障而疗效受限。为此，研究人员开发了一种基于微凝胶的水凝胶系统，该系统输送H2Se气体并结合轻度光热疗法（MPTT），以实现抗感染、抗炎和成骨的集成治疗。该系统利用Fe3O4纳米颗粒作为光热响应载体封装H2Se供体TDN1042，并通过微流控技术将其构建入硫辛酸修饰的明胶（Gel-LA）微凝胶中。原位注射后，光交联形成TF@GL水凝胶，能够在808 nm近红外（NIR）照射下实现三重调控。首先，MPTT促进H2Se释放，破坏细菌代谢稳态并裂解生物膜。其次，H2Se清除过量活性氧（ROS）以减轻细胞死亡，同时抑制炎症通路（NF-κB和NLR）。最后，TF@GL水凝胶通过激活TGF-β/BMP成骨通路促进成骨分化，其多孔结构增强细胞迁移和营养扩散，加速骨修复。该设计通过气体输送与受控光热效应的时空协同作用，为糖尿病骨髓炎提供了全面的治疗策略，具有有效的抗菌活性、氧化应激缓解和骨再生诱导作用。

研究背景与立项依据

全球约有2000万人受糖尿病溃疡困扰，每年新增100至200万糖尿病骨髓炎患者，面临巨大的经济负担和截肢风险。糖尿病骨髓炎的发病机制受高血糖和微生物感染双重影响，高血糖诱导的氧化应激不仅损伤细胞活性，还削弱免疫系统，为细菌增殖创造温床。一旦细菌穿透皮层和肌肉侵入骨骼，将导致骨破坏和组织坏死。然而，临床常用的抗生素治疗因耐药性和生物膜屏障而效果有限，且糖尿病引起的血管损伤和细胞外基质（ECM）降解严重降低了骨组织的再生修复能力。因此，探索一种能够同时解决复杂感染、纠正微环境紊乱并促进骨修复的多功能策略迫在眉睫。气体疗法作为一种新兴的治疗范式，具有副作用极低的优势，其中硒化氢（H₂Se）作为一种潜在的第四种气体递质，在抗菌和抗氧化方面展现出潜力。结合Fe₃O₄纳米颗粒的光热特性与微凝胶技术的优势，本研究旨在开发一种新型水凝胶系统，以应对糖尿病骨髓炎的复杂病理挑战。

主要关键技术方法

研究人员采用了微流控技术制备负载TDN1042（H₂Se供体）的Fe₃O₄纳米颗粒（TF NPs）及硫辛酸修饰的明胶（Gel-LA）微凝胶。利用扫描电子显微镜（SEM）、X射线衍射（XRD）和zeta电位分析对纳米颗粒及水凝胶进行表征。通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）、蛋白质印迹法（Western blot）和转录组测序（RNA-seq）分析分子机制。体外实验涵盖抗菌率测定、生物膜清除、细胞活性氧（ROS）清除、线粒体膜电位检测及成骨/血管生成相关基因表达分析。体内实验则建立了2型糖尿病大鼠颅骨骨髓炎模型，利用Micro-CT、组织病理学染色（H&E、Masson、免疫组化及免疫荧光）评估体内抗菌效果及骨再生情况。

研究结果

3.1 TF纳米颗粒的合成与表征

研究人员成功合成了立方晶体结构的Fe₃O₄纳米颗粒，并通过元素映射证实了TDN1042在纳米颗粒上的均匀分布。粒径统计显示TF NPs平均直径为202.30 ± 12.97 nm。释放曲线表明，在NIR照射和酸性条件（pH 5.0）下，H₂Se供体的水解及H₂Se的释放速率显著加快，证明了该系统具有pH和NIR双重响应的释药特性。

3.2 TF@GL水凝胶的制备与表征

通过微流控技术制备的TF@GL微凝胶呈均匀球形，直径约300-400 μm。SEM图像显示，该水凝胶具有200-400 μm的孔隙结构，有利于细胞迁移和营养扩散。流变学测试表明其具有良好的弹性模量和稳定的网络结构。压缩实验显示其机械性能优异，且降解实验证实其在胶原酶和过氧化氢环境中能稳定降解。DPPH清除实验表明微凝胶基水凝胶具有出色的抗氧化能力。红外热成像显示，在NIR照射下，水凝胶温度升至约42 °C，属于细胞可耐受的温和光热范围。

3.3 光热TF@GL水凝胶的抗菌能力

针对大肠杆菌（E. coli）和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的体外实验表明，TF@GL + NIR组的抗菌率超过99%。生长动力学曲线显示该组能有效抑制细菌繁殖。SYTO9/PI染色和SEM观察发现，该组处理后的细菌细胞壁破裂、收缩。针对生物膜的共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）和结晶紫染色结果显示，TF@GL + NIR组能显著破坏生物膜结构并减少其厚度，这归因于光热效应、Fe²⁺离子和H₂Se气体的协同作用。

3.4 TF@GL水凝胶诱导细胞内ROS清除并抑制细胞死亡

在过氧化氢（H₂O₂）诱导的氧化应激环境下，TF@GL + NIR组表现出最低的ROS水平。流式细胞术和JC-1染色证实，该系统能有效维持线粒体膜电位（MMP），减少线粒体去极化。Annexin V/PI凋亡检测显示该组细胞凋亡率最低。Western blot和qRT-PCR结果进一步揭示，该系统通过调节Bax/Bcl-2比例，抑制Caspase-3活化，并下调NLRP3、Caspase-1及N-GSDMD的表达，从而阻断细胞凋亡和焦亡通路。

3.5 TF@GL水凝胶的抗炎效应及巨噬细胞极化的转录组分析

免疫荧光和流式细胞术分析显示，TF@GL + NIR组能将脂多糖（LPS）刺激的M1型巨噬细胞有效极化为M2型。转录组测序分析（RNA-seq）的火山图、GO和KEGG富集分析表明，差异表达基因主要集中在炎症和焦亡相关通路。具体而言，TF@GL + NIR处理显著抑制了TNF、NF-κB、NLR等信号通路，下调了IκKα、IκKβ、NF-κB1、IL-1β、NLRP3和Caspase-4等关键基因的表达，阐明了其抗炎的分子机制。

3.6 TF@GL水凝胶的体外成骨与血管生成

细胞骨架染色和CCK-8实验表明，TF@GL + NIR组能促进骨髓间充质干细胞（BMSCs）的增殖。ALP和茜素红S（ARS）染色结果显示，该组在早期成骨分化和晚期基质矿化方面均表现最佳。Transwell和划痕实验证明，该系统能促进人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的迁移和成管能力。转录组分析指出，TGF-β/BMP信号通路和调节干细胞多能性（RPSC）通路被显著激活，关键基因如Smad9、Bmp4和Igf1的上调连接了这两条通路，共同促进骨再生。

3.7 大鼠糖尿病颅骨骨髓炎模型的体内评估

在体内糖尿病大鼠模型中，术后1周的检测显示TF@GL + NIR组具有显著的体内抗菌效果。Micro-CT分析显示，术后4周和8周，该组的骨体积分数（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）和骨密度（BMD）均显著高于对照组。组织学染色（H&E、Masson）和免疫组化（Igf1, Bmp4, Osterix, RUNX2）进一步证实了新骨的形成和成骨相关蛋白的高表达。免疫荧光染色显示，该组能有效降低ROS和NF-κB水平，提高CD31和VEGF的表达，证实了体内抗炎和促进血管生成的协同效应。

结论与讨论

该研究成功构建了一种基于微凝胶的TF@GL水凝胶系统，通过整合轻度光热疗法（MPTT）与H₂Se气体输送，实现了对糖尿病骨髓炎的三重协同治疗。研究表明，该系统不仅能通过物理（光热）和化学（H₂Se）方式高效杀菌、清除生物膜，还能通过清除ROS、维持线粒体功能来抑制细胞凋亡和焦亡。同时，该系统通过调控巨噬细胞从促炎的M1表型向修复性的M2表型极化，并激活TGF-β/BMP信号通路，最终促进了BMSCs的成骨分化和血管生成。这项工作为糖尿病骨髓炎的治疗提供了一种集抗感染、免疫调节和骨再生于一体的创新策略，具有重要的临床应用转化潜力。该研究成果发表于《Bioactive Materials》期刊。