《Journal of Animal Science and Biotechnology》：Improvement of chicken genome editing efficiency in vitro using ribonucleoprotein-mediated CRISPR/Cas9 delivery
编辑推荐：
背景：由于鸟类（包括鸡）单细胞合子难以操作，基因组编辑主要依赖于原始生殖细胞（Primordial Germ Cells, PGCs）的操作。虽然基于质粒的成簇规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关蛋白9（Clustered Regularly Inters
背景：由于鸟类（包括鸡）单细胞合子难以操作，基因组编辑主要依赖于原始生殖细胞（Primordial Germ Cells, PGCs）的操作。虽然基于质粒的成簇规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关蛋白9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-Associated Protein 9, CRISPR/Cas9）递送已被广泛应用，但其存在核酸酶激活延迟、脱靶效应增加、细胞毒性以及无法应用体内筛选策略等局限性。结果：本研究在Leghorn雄性肝癌（Leghorn Male Hepatoma, LMH）细胞和PGCs中，针对deleted in azoospermia like (DAZL)、chicken vasa homologue (CVH)和stimulated by retinoic acid 8 (STRA8)三个基因座，比较了质粒和核糖核蛋白（Ribonucleoprotein, RNP）介导的CRISPR/Cas9递送效率。RNP递送在两种细胞类型中均显示出相当或更高的细胞活力和编辑效率。插入/缺失（Insertion/Deletion, indel）谱分析显示，RNPs产生了更广泛和多样的突变模式，这与DNA修复途径向有利于较大缺失的微同源介导的末端连接（Microhomology-Mediated End Joining, MMEJ）转变一致。脱靶分析进一步表明，RNP递送显著降低了脱靶编辑并提高了特异性。结论：这些发现共同表明，RNP递送提高了效率，降低了细胞毒性，并增强了精确度，为鸡的基因工程提供了更可靠的平台。
论文解读：RNP介导的CRISPR/Cas9递送显著提升鸡基因组编辑效率
研究背景与意义
鸡（Gallus gallus）作为全球主要的蛋白质来源及生物技术模型，其基因组编辑技术在改善生产性能和疾病抗性方面具有重要价值。然而，与哺乳动物不同，鸟类单细胞合子因卵黄不透明且在产出时已发育至Eyal-Giladi and Kochav (EGK) stage X，导致无法直接进行显微注射操作。因此，原始生殖细胞（PGCs）成为实现种系遗传修饰的主要途径。尽管CRISPR/Cas9系统因其简便性和灵活性被广泛应用，但传统的质粒递送方式存在诸多弊端，包括依赖转录和翻译导致的核酸酶激活延迟、持续表达引发的细胞毒性和脱靶效应增加，以及在PGCs中编辑效率低且难以在体内进行筛选等问题。相比之下，核糖核蛋白（RNP）递送作为一种替代策略，已在哺乳动物中显示出高效、低毒和瞬时活性的优势，但在禽类系统中的系统性比较分析仍然有限。为此，研究人员开展了此项研究，旨在评估RNP递送在鸡体细胞（LMH）和PGCs中的可行性，相关成果发表在《Journal of Animal Science and Biotechnology》。
关键技术方法
本研究主要采用脂质体转染技术将质粒或RNP复合物导入LMH细胞和培养的鸡PGCs。研究人员设计了靶向DAZL、CVH和STRA8三个生殖细胞相关基因的sgRNA。RNP组采用TrueCut? Cas9蛋白与体外转录（IVT）的sgRNA按1:1摩尔比预组装。在转染后48小时收集细胞，提取基因组DNA（gDNA）。利用下一代测序（NGS）结合CRISPResso2软件进行indel频率和突变谱分析，采用Microhomology-Predictor工具预测MMEJ相关编辑模式。利用Cas-OFFinder预测脱靶位点，并通过Tracking of Indels by Decomposition (TIDE)分析和T7内切酶I (T7E1)实验验证脱靶活性。细胞活力通过台盼蓝染色法测定。
研究结果
Enhanced cellular viability and genome editing efficiency by RNP in LMH cells
研究人员通过比较RNP和质粒在LMH细胞中的递送效果发现，RNP组的细胞活力（75.02% ± 3.87%）显著高于质粒组（58.47% ± 3.43%）。NGS分析显示，RNP介导的编辑效率在所有靶位点均显著高于质粒，其中DAZL位点的差异最为显著（71.82% ± 2.76% vs. 5.13% ± 0.30%）。这表明RNP在体细胞中具有更低的细胞毒性和更高的编辑效能。
Enhanced genome editing efficiency by RNP in PGCs
在PGCs这一关键的生殖系细胞中，虽然两种递送方式的细胞活力无统计学差异（RNP: 84.27% ± 5.17% vs. Plasmid: 81.95% ± 2.26%），但RNP组的编辑效率同样全面优于质粒组。特别是在CVH位点，RNP实现了7.94% ± 0.53%的编辑效率，而质粒组仅为0.94% ± 0.42%。这证实了RNP在难以转染的PGCs中具有显著的效率优势。
Distinct indel profiles with RNP in LMH cells
通过对indel谱的分析，研究人员发现RNP递送产生的独特突变模式更多。具体而言，RNP诱导的缺失（deletion）分布更广，且indel尺寸更大。统计显示，RNP组中≥3 bp的缺失比例在三个位点均显著增加（如STRA8: 58.72% ± 0.96% vs. 38.53% ± 0.67%）。这表明RNP改变了DNA修复的结局，倾向于产生大片段缺失。
RNP-mediated editing shifts DNA repair toward MMEJ in LMH cells
为了探究indel变化的机制，研究人员分析了DNA修复途径。结果显示，RNP介导的编辑显著增加了MMEJ相关修复的比例。在CVH和STRA8位点，RNP组的MMEJ贡献率分别达到56.18% ± 4.48%和39.41% ± 0.57%，均显著高于质粒组。这解释了为何RNP能产生更多具有特定微同源性（microhomology）的大片段缺失。
Reduced off-target activity with RNP in LMH cells
脱靶效应分析表明，RNP递送具有更高的特异性。通过TIDE分析和T7E1实验检测预测的十个脱靶位点发现，RNP组在保持高靶向编辑活性的同时，几乎未检测到脱靶位点的编辑信号，其特异性比率（ON/OFF）远高于质粒组。这归因于RNP在细胞内瞬时、快速的活性特征。
结论与讨论总结
研究人员在结论中指出，本研究通过定量比较证实，RNP介导的CRISPR/Cas9递送在鸡细胞中具有显著优势。首先，RNP通过绕过转录和翻译步骤，减少了细胞应激，从而在维持甚至提高细胞活力的同时，实现了更高的编辑效率，尤其是在PGCs中克服了传统方法的低效瓶颈。其次，RNP诱导的DNA双链断裂（DSB）更倾向于通过MMEJ途径修复，导致更广泛的突变谱和更大的缺失，这对于需要移码突变的基因敲除应用尤为有利。最后，RNP的瞬时活性特性有效降低了脱靶效应，提高了编辑的精确性。尽管本研究受限于体外分析且未量化RNP的转染效率，但其结果为鸡的基因修饰提供了一个强大而灵活的策略，并为未来在体内胚胎系统中应用RNP介导的基因组编辑奠定了坚实基础。
