在单细胞生物Paramecium tetraurelia的有性生殖过程中，两种Tfdp蛋白在生殖细胞核减数分裂和体细胞核碎片化中扮演双重角色

《Marine Life Science & Technology》：Dual roles of two Tfdps in germline nuclear meiosis and somatic nuclear fragmentation during sexual reproduction in the unicellular organism Paramecium tetraurelia

摘要：减数分裂由相位特异性基因调控，以协调对有性生殖至关重要的核结构和细胞骨架动态。纤毛虫Paramecium tetraurelia在营养生长期间在一个细胞内具有核二型性，包含两个生殖细胞微核（MICs）和一个体细胞大核（MAC）。在有性生殖过程中，MICs经历减数分裂，而MAC发生变形和碎片化，这为研究各种核事件的调控提供了独特的模型。转录因子DP（TFDP）能与E2Fs异二聚化，并结合到细胞周期调控基因的启动子中的特定DNA序列上，从而激活或抑制这些基因的表达。在本研究中，我们在P. tetraurelia中发现了16个TFDP同源物，这代表了该基因家族的显著扩展及其功能域的多样化。进一步研究了Tfdp1a和Tfdp1b的功能，它们在有性生殖期间特异性表达，并定位于旧MAC和新MAC中。它们的缺失导致MIC在中期停止减数分裂，旧MAC无法碎片化，以及胞质分裂失败。转录组分析显示，TFDP1A/1B的敲低主要导致基因下调，其中超过60%的下调基因在有性生殖期间特异性高表达。功能注释和富集分析表明，涉及减数分裂、DNA复制和DNA修复的蛋白质显著下调。关键的是，多个下调的减数分裂调控因子对于同源染色体的正确分离和姐妹染色单体的分离至关重要，这为观察到的MIC减数分裂停滞提供了机制基础。本研究揭示了Tfdp1a/1b作为P. tetraurelia独特减数分裂过程的重要调控因子，为了解核动态和双核系统中有性生殖的调控提供了重要见解。

引言：有性生殖利用遗传重组产生具有多样基因型的后代，从而赋予适应性优势，维持世代间的进化多样性。这一过程的核心是减数分裂，它通过两个连续的分裂（减数分裂I和II）使染色体数目减半，通过程序性的同源染色体配对和重组引入遗传变异（Kleckner 1996; Moens 1987; Zickler and Kleckner 2015）。减数分裂I和II都分为四个阶段：前期、中期、后期和末期（Wilkins and Holliday 2009）。每个过渡阶段都受到检查点机制和相位特异性调控基因的调控，这些基因协调染色体和细胞骨架动态的顺序控制，例如周期蛋白、周期蛋白依赖性激酶（CDKs）和转录因子（Farini and De Felici 2022; Gao et al. 2024; Handel and Schimenti 2010; Palacios-Blanco and Martín-Castellanos 2022）。转录因子DP（TFDP）蛋白是E2F转录因子的保守伴侣，是细胞周期和DNA复制的关键调控因子（Helin 1998; Müller and Helin 2000; Ramirez-Parra et al. 2007）。TFDP和E2F都具有DNA结合域（E2F/DP家族翼螺旋DNA结合域），可以识别细胞周期调控基因启动子中的DNA序列（Blake and Azizkhan 1989; Thalmeier et al. 1989）。虽然所有8种E2F蛋白都调控细胞周期，但它们的作用方式不同：E2F1至E2F3作为转录激活因子，而E2F4至E2F8作为转录抑制因子（Kent and Leone 2019综述）。在人类和灵长类动物中已经鉴定出三种TFDP，而在其他哺乳动物中只鉴定出两种。TFDP1和TFDP2与E2Fs的结合直接增强了异二聚体的DNA结合亲和力和转录激活/抑制能力（Bandara et al. 1993; Helin et al. 1993; Wu et al. 1995）。TFDP3与TFDP1和TFDP2的不同之处在于，TFDP3/E2F复合物的DNA结合能力较弱，无法与E2F共识序列相互作用；此外，TFDP3抑制E2F介导的转录激活（Huang et al. 2021; Milton et al. 2006; Qiao et al. 2007）。E2Fs和TFDPs共同促进了E2F/TFDP复合物的功能复杂性。

纤毛虫是一类多样的单细胞真核生物，在从生态学和分类学到基因组进化和表观遗传学等多个生物学领域成为了极其有价值的研究模型（Gao et al. 2025; Lyu et al. 2024; Ma et al. 2025; Wang et al. 2022, 2025a, b; Ye et al. 2025; Zhang et al. 2025）。它们的核二型性以及独特的有性生殖过程也为研究核事件及其在减数分裂细胞周期中的调控提供了独特的机会。纤毛虫在一个共同的细胞质内拥有两种不同类型的核：一个负责基因表达的转录活跃的多倍体体细胞大核（MAC）和一个保持遗传完整性的转录沉默的二倍体生殖细胞微核（MIC）。在某些物种（如Paramecium tetraurelia）的有性过程（接合或自配）中，MIC经历减数分裂和有丝分裂产生单倍体配子核，随后MAC发生变形和碎片化；然而，协调MIC和MAC中这些时空同步事件的分子机制仍然知之甚少。尽管对E2F/TFDP在有丝分裂调控中的功能进行了广泛研究，但它们在纤毛虫中的减数分裂和核动态中的作用仍大部分尚未探索。在本研究中，我们使用blastp技术在P. tetraurelia中搜索了Tfdp蛋白，并鉴定出16个具有不同表达模式的Tfdp同源物。对Tfdp1a和Tfdp1b的研究表明，它们同时调控MIC的减数分裂和MAC的碎片化。值得注意的是，我们发现许多与减数分裂、DNA复制和DNA修复相关的基因的表达依赖于Tfdp1a和Tfdp1b。我们的结果为了解P. tetraurelia中有性生殖期间MIC减数分裂和MAC碎片化的调节机制提供了见解。

材料与方法：
- **Paramecium tetraurelia的培养和自配诱导**：Paramecium tetraurelia，51菌株，七型 mating类型，按照先前描述的方法（Beisson et al. 2010b）使用小麦草粉（WGP，Pine international，Lawrence，KS）培养基进行培养，然后用Klebsiella pneumoniae感染，并添加0.8 mg/L的β-谷甾醇（Shanghai Yuanye Bio-technology）。通过饥饿诱导自配。
- **基因沉默**：TFDP基因的全长DNA片段被扩增并克隆到L4440质粒中，然后转入Escherichia coli的HT115（DE3）菌株。PCR使用的引物列在补充表S1中。
- **RNAi介导的基因沉默**：按照Beisson et al. (2010c)的方法进行。简要来说，含有特定沉默构建的细菌在LB培养基中培养过夜，然后以1:100的比例稀释到1×WGP培养基中，并在37°C下孵育过夜。再将培养物以1:5的比例稀释到1×WGP培养基中，在37°C下培养1.5小时，使OD600达到0.07至0.1之间。向培养基中添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至最终浓度0.4 mmol/L，并孵育过夜以产生双链RNA（dsRNAs）。然后向沉默培养基中添加β-谷甾醇，收集P. tetraurelia，用10 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4）洗涤，以约200个细胞的密度接种到沉默培养基中。
- **生存测试**：经过自配的细胞被转移到含有0.2×WGP（感染了K. pneumoniae并添加了0.8 mg/L β-谷甾醇）的单独孔中，以恢复到营养阶段，每个孔中一个细胞。连续三天监测细胞的生长情况。与对照组相似生长的细胞被归类为健康的，否则为病态的（细胞数量少于对照组）或死亡的（只有一个细胞或没有活细胞）。
- **DNA制备和显微注射**：使用5 min? TA/Blunt-Zero克隆试剂盒（Vazyme Biotechnology）将TFDP1A或TFDP1B的整个基因及其侧翼序列（TFDP1A上游431 bp和下游218 bp；TFDP1B上游200 bp和下游275 bp；引物见补充表S1）克隆到pCE2载体中。在基因的终止密码子TGA之前插入了一个密码子优化的Flag-HA序列（序列见补充表S1）。GFP标记的CENH3A和PTIWI09质粒的构建方法如先前发表（Bouhouche et al. 2011; Lhuillier-Akakpo et al. 2016）。从细菌中提取质粒并使用酶消化进行线性化处理。然后，使用苯酚氯仿（pH 8.0）纯化DNA，并使用Ultrafree-MC离心过滤器（Millipore）进行清洗，方法如Wang et al. (2024)所述。
- **恢复到营养阶段的Paramecium tetraurelia**：将经过自配的细胞恢复到营养阶段并培养4到6个分裂周期。如先前描述（Beisson et al. 2010a）将纯化的DNA注入大核中。通过PCR扩增构建物特异性区域来筛选成功注射的细胞，然后用于后续实验。
- **免疫荧光**：收集约150,000个细胞，并用10 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4）洗涤两次。细胞用2% paraformaldehyde在1×PHEM缓冲液（10 mmol/L EGTA, 25 mmol/L HEPES, 2 mmol/L MgCl2, 60 mmol/L PIPES (pH 6.9)中固定10分钟，然后用1% Triton X-100在1×PHEM缓冲液中渗透10分钟。用3% bovine serum albumin（BSA）在Tris缓冲盐溶液（0.15 mol/L NaCl, 10 mmol/L Tris–HCl）中封闭1小时，其中含有1% Tween 20, 10 mmol/L EGTA, 2 mmol/L MgCl2（TBSTEM），接着在4°C下用1:500稀释的Rabbit抗-HA一抗（3724S，Cell Signaling Technology）孵育过夜，然后用3% BSA在TBSTEM中洗涤三次，最后用1:4000稀释的山羊抗兔Alexa Fluor 546二抗（A-11071，Invitrogen）孵育一小时。
- **成像**：对于注射了GFP标记构建物的细胞，收集约150,000个细胞并用75% EtOH固定。成像前用1×PBS洗涤三次，用DAPI染色，然后铺展在玻璃载片上。
- **逆转录定量PCR（RT-qPCR）**：使用HiScript III All-in-one RT SuperMix Perfect for qPCR试剂盒（R333-C1，Vazyme Biotechnology）将总RNA（1 μg）逆转录生成第一链cDNA。然后使用ChamQ Blue Universal SYBR qPCR Master Mix（Q312，Biotechnology）在Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR系统上进行定量PCR（qPCR）。使用内参基因ACT1-1作为内部对照。qPCR使用的引物列在补充表S2中。
- **氨基酸序列比对和系统发育树构建**：从Uniprot数据库下载了Homo sapiens、Mus musculus、Drosophila melanogaster和Caenorhabditis elegans中的TFDP和E2F的氨基酸序列， accession号见图1A。从Tetrahymena thermophila（Dpl1: TTHERM_00107000, Dpl2: TTHERM_00047010, Dpl3: TTHERM_00016410）和P. tetraurelia（基因ID见图1A）的数据库中下载了Tfdps序列。使用ETE3的系统分析管道（https://www.genome.jp/tools-bin/ete）对氨基酸序列进行比对，并使用默认参数构建最大似然（ML）树（Huerta-Cepas et al. 2016）。树使用ITOL网站（https://itol.embl.de/）进行可视化（Letunic and Bork 2007）。

图1：P. tetraurelia中的Tfdp1a和Tfdp1b。P. tetraurelia中Tfdp同源物的最大似然树和域预测。P. tetraurelia中的Tfdps用粗体表示。Homo sapiens和Mus musculus中的E2Fs被用作外群。E2F/DP家族的翼状螺旋DNA结合域和异二聚化域分别用蓝色和浅绿色的矩形标示。B 图显示了在P. tetraurelia中TFDP基因的表达谱，其中TFDP1A和TFDP1B分别用橙色和紫色表示。Veg：营养期；Mei：减数分裂；Frg：旧的大核（MAC）碎裂；Dev1-4：新大核的发育。C 使用AlphaFold3预测的Tfdp1a和Tfdp1b的蛋白质结构。E2F/DP家族的翼状螺旋DNA结合域用绿色标示。

蛋白质结构预测
TFDP蛋白的域是通过InterPro（https://www.ebi.ac.uk/interpro/）进行预测的。蛋白质结构是使用AlphaFold Server（https://alphafoldserver.com/）（Abramson等人，2024年）预测的，并使用PyMol（Schrodinger 2015年）进行可视化的。

RNA提取和mRNA-seq分析
大约300,000个细胞被离心，用10 mmol/L Tris（pH 7.4）洗涤两次，然后在液氮中冷冻直到进行RNA提取。按照制造商的协议，使用RNAiso Plus（TaKaRa）提取总RNA。提取的RNA被送到Novogene公司进行文库制备和测序，以获得成对的2×150 bp读段。使用fastp（v0.24.0）和默认参数过滤成对读段，以去除接头和低质量读段（Chen等人，2018年）。然后，使用Hisat2（v2.2.1）和参数-t –dta –no-mixed –no-discordant –min-intronlen 20将读段映射到P. tetraurelia菌株51的MAC基因组上（https://paramecium.i2bc.paris-saclay.fr/files/Paramecium/tetraurelia/51/sequences/ptetraurelia_mac_51.fa）。使用featureCounts（v2.0.6）（Liao等人，2014年）量化基因水平的读段计数。使用DESeq2（v1.44.0）进行差异表达分析，并识别出调整后的p值小于0.1且相对于对照组变化至少两倍的差异表达基因（DEGs）（Love等人，2014年）。使用ggplot2（v3.5.1）构建主成分分析（PCA）、热图和火山图。使用g:Profiler（https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost）（Kolberg等人，2023年）对DEGs进行基因本体（GO）富集分析。对于京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析，首先使用eggnog-mapper（http://eggnog-mapper.embl.de/）对P. tetraurelia菌株51的蛋白质序列进行注释，然后使用在线平台OmicShare（https://www.omicshare.com/tools/）进行分析（Cantalapiedra等人，2021年；Mu等人，2024年）。GO和KEGG分析的可视化使用WeiShengXin网站（https://www.bioinformatics.com.cn/）完成。使用GSEA（v4.4.0）进行基因集富集分析（Subramanian等人，2005年）。

结果
在Paramecium tetraurelia中的转录因子DPs
为了识别P. tetraurelia中的转录因子DPs（TFDPs），我们使用了来自Homo sapiens、Mus musculus、Drosophila melanogaster、Caenorhabditis elegans和Tetrahymena thermophila的TFDPs，对P. tetraurelia的蛋白质序列进行blastp搜索。总共识别出了16个P. tetraurelia中的Tfdps同源物（图1A）。根据它们是否起源于ParameciumDB中注释的全基因组复制（WGD）事件（Aury等人，2006年），这16个Tfdps被分为九组（Tfdp1-9）。属于同一组的Tfdps在系统发育树上聚集在一起，并且具有更高的氨基酸序列相似性（图1A）。
在H. sapiens、M. musculus和D. melanogaster中，TFDPs的长度保守范围为405到446个氨基酸（aa），除了C. elegans（598 aa）（图1A）。T. thermophila中的三个DP样蛋白（Tfdps-like proteins）显示出明显的延长（776、816和836 aa）。相比之下，P. tetraurelia中的Tfdps明显较短，长度为229–356 aa，极端情况为Tfdp6（94 aa）。在人类、小鼠、果蝇和C. elegans的TFDPs中，E2F/DP家族的翼状螺旋DNA结合域与异二聚化域共存，而在T. thermophila中仅保留DNA结合域。在P. tetraurelia中，六个Tfdps保留了这两个域，而其余成员仅保留DNA结合域。DNA结合域的多序列比对显示了显著的保守性，同源物之间的氨基酸序列相似性超过50%（补充图S1；表S3）。

16个TFDPs的表达谱显示了阶段特异性差异（图1B）。ParameciumDB的转录组数据表明，一半的TFDPs在营养期和性发育阶段都表现出低水平的持续表达（平均表达水平<500）（Arnaiz等人，2020年）。在高度表达的TFDPs中，大多数在无性繁殖和有性繁殖（自体受精）期间表现出持续的转录。显著的例外是TFDP1A和TFDP1B，它们在营养生长期间表达几乎不可检测，但在自体受精期间显著上调，尤其是在减数分裂阶段。对这些16个TFDP基因进行RNA干扰（RNAi）介导的基因沉默（单个基因敲低或同源物的双敲低和三敲低）显示，它们在营养生长期间没有影响细胞活力或增殖（补充图S2A、B）。因此，我们后续的研究专门针对TFDP1A和TFDP1B进行了。

TFDP1A和TFDP1B是由一次WGD事件产生的重复基因，它们含有82.97%的氨基酸序列同源性（图1A）。这两种蛋白质都仅保留E2F/DP家族的翼状螺旋DNA结合域，没有其他可识别的域（图1A）。AlphaFold3生成的结构预测进一步显示了它们三级结构的高度相似性，特别是在核心域区域（图1C）。DNA结合域由三个N端α螺旋和两个C端β链组成（图1C；补充图S1B）。预测结构的叠加显示，P. tetraurelia与其他物种（H. sapiens、M. musculus、D. melanogaster、C. elegans和T. thermophila）之间的拓扑重叠几乎完全，所有成对比较的均方根偏差（RMSD）值均低于1.5 ?，表明维持功能结构具有强烈的进化约束。

Tfdp1a和Tfdp1b在有性繁殖期间特异性表达
P. tetraurelia的生命周期包括营养期和有性繁殖（结合或自体受精，以自体受精为例）（图2A）。根据它们的表达谱，TFDP1A和TFDP1B仅在有性繁殖期间表达（图1B）。我们进一步通过工程化带有C端Flag-HA标签的这两种同源物的构建体，并将其微注射到MAC中，然后进行免疫荧光染色来研究它们的蛋白质定位。在营养生长期间没有观察到Tfdp1a或Tfdp1b（图2B、C）。在饥饿状态下，Tfdp1a和Tfdp1b都出现在MAC中（为了区分后来生成的新MAC，这个MAC被称为“旧MAC”）。这种定位在自体受精的开始和进行过程中持续存在，在此期间旧MAC经历了穿线和碎裂。在自体受精的后期阶段，当新的MAC可见时，Tfdp1a和Tfdp1b同时存在于旧MAC片段和新MAC中，尽管在旧MAC中的信号比早期阶段更弱。随着自体受精的进一步进行，Tfdp1a和Tfdp1b最终消失。在整个过程中，在MICs中没有观察到信号（图2B、C）。综上所述，我们得出结论Tfdp1a和Tfdp1b仅在有性繁殖期间表达。

图2
P. tetraurelia中Tfdp1a和Tfdp1b的定位。A P. tetraurelia的有性繁殖（自体受精）。当细胞挨饿时，两个微核（MICs）进行减数分裂以产生八个单倍体核。其中一个单倍体核进行有丝分裂，其产物融合形成合子核，而其余七个核降解。合子核分裂两次，两个成为新的MICs，另外两个发育成新的macronuclei（MACs）。最后，细胞分裂一次，将核分配到两个细胞中。在此过程中，旧MAC逐渐降解。B、C Tfdp1a（B）和Tfdp1b（C）的定位。MICs由白色箭头表示。新MACs由白色圆圈表示。比例尺：10 μm。

Tfdp1a和Tfdp1b的缺失影响MAC碎裂和细胞分裂
在TFDP1A、TFDP1B和TFDP1A/1B敲低情况下，在营养生长期间没有观察到明显的表型异常，表明它们对营养生长是不可或缺的。当细胞挨饿时，EV（空载体）对照细胞可以正常进入自体受精并经历旧MAC碎裂和新MAC的发育（图3A）。相比之下，敲低组出现了严重缺陷。当EV对照在自体受精后期达到100%且可见新MAC时，只有7.94%的TFDP1A KD细胞和4.05%的TFDP1B KD细胞经历了正常的MAC碎裂和新MAC的发育；TFDP1A/1B KD细胞完全未能完成这一过程（图3B、C）。

图3
TFDP1A和TFDP1B敲低对旧MAC碎裂和细胞分裂的影响。A 自体受精后期EV对照中旧MAC的形态。新的macronuclei（MACs）由橙色圆圈表示。比例尺：10 μm。B 自体受精后期新MAC出现时TFDP1A KD、TFDP1B KD和TFDP1A/1B KD中旧MAC的形态。C 自体受精后期具有正常和异常旧MAC的细胞百分比。N表示正常核形态，而1、2、3、4和≥5表示异常细胞中的旧MAC片段数量。n是计数的细胞数量。D 生存测试显示P. tetraurelia在恢复到营养期三天后的存活情况。健康的细胞正常生长；生病的细胞可以分裂，但生长速度比EV对照慢；死亡的细胞一个或多个没有细胞。数据来自八个独立的实验重复。E 正常细胞和V形细胞的照片。F EV对照、TFDP1A KD、TFDP1B KD和TFDP1A/1B KD中正常细胞和V形细胞的百分比。

在TFDP1A、TFDP1B和TFDP1A/1B KD中，分别有18.77%、31.08%和68.58%的细胞在自体受精后期保留了单个卵形的旧MAC而没有碎裂，表明它们在自体受精开始时停滞（图3B、C）。此外，能够碎裂的敲低组中的细胞的旧MAC表现出异常的解体，产生多个大小和形态不规则的核片段，与对照组的MAC碎裂模式不同（图3A、B）。TFDP1A/1B KD中具有两个以上MAC片段的细胞百分比（7.51%）远低于TFDP1A（55.95%）和TFDP1B（43.69%）敲低情况，并且双敲低组中没有形态正常的核，表明双敲低的效果比单敲低更严重（图3C）。然后我们恢复了沉默后的细胞，监测它们的存活能力和进入营养期的能力。八个独立的生物学重复实验显示，TFDP1A、TFDP1B和TFDP1A/1B KD中大多数细胞死亡或生病（图3D）。这种大规模死亡与表现出正常增殖的EV对照形成了鲜明对比。

Tfdp1a和/或Tfdp1b的缺失还引起了细胞核分裂（karyonidal division）期间的严重缺陷，这是自体受精末期的一个关键阶段，该阶段将两个新MAC分配到子细胞中（图2A）。31.9%的TFDP1A KD细胞、44.3%的TFDP1B KD细胞和26.7%的TFDP1A/1B KD细胞在细胞核分裂中期停滞，其特征是V形形态的相互连接的子细胞（图3E、F）。这种表型在EV对照中完全不存在。DAPI染色显示，V形细胞的核是异常的，即使那些MAC停滞的细胞仍然接收到分裂的信号，尽管它们没有经历必要的核事件。因此，V形细胞表现出核事件和细胞分裂的不同步性，表明Tfdp1a和Tfdp1b是P. tetraurelia中有性繁殖期间核和细胞分裂动态的重要协调者。

Tfdp1a和Tfdp1b的缺失破坏了P. tetraurelia中的MIC减数分裂
在自体受精开始时，母体MAC发生碎裂，而MICs参与一系列减数分裂事件（图2A）。因此，我们研究了Tfdp1a和Tfdp1b的敲低是否也影响MIC的减数分裂。由于MICs的大小很小且经常被较大的MAC遮挡，通过DAPI染色直接观察很有挑战性。为了克服这个问题，我们引入并表达了CenH3a-GFP，这是一种在MICs中定位的融合蛋白，可以通过GFP荧光来可视化MIC的动态（Lhuillier-Akakpo等人，2016年）。在EV对照中，与CenH3a相关的GFP信号最初看起来很紧凑（图4A）。然后，MICs发生体积扩张并采用类似纺锤体的形态，随后是第一次减数分裂的延长阶段，产生四个子MIC。这四个核随后进行第二次分裂，最终产生八个单倍体MIC。

图4
TFDP1A和TFDP1B敲低对微核的影响。A 使用CenH3a-GFP标记的EV对照中微核（MICs）的减数分裂过程。根据其形态学特征，MICs可以被划分为四个阶段。B–E 图显示了在EV对照组（B）、TFDP1A KD（C）、TFDP1B KD（D）和TFDP1A/1B KD（E）中不同数量MICs的细胞百分比。（F）显示了处于不同阶段的细胞百分比：膨胀型、纺锤形、延长型和浓缩型。G–I 图分别为TFDP1A KD（G）、TFDP1B KD（H）和TFDP1A/1B KD（I）中MIC阶段的代表性图像。MICs由白色箭头标示。比例尺：10 μm。

在EV对照组中，大多数细胞包含一个MIC，这些细胞对应于减数分裂前的细胞或受精后的个体（图4B）。Paramecium tetraurelia通常有两个MICs，偶尔也会出现一个或三个MICs的情况，极少数情况下会丢失MIC（补充图S3）（Lhuillier-Akakpo等人，2016年）。含有≥8个微核的细胞占细胞总数的6.14%，这表明减数分裂II已经完成（图4B；补充图S3）。相比之下，TFDP1A、TFDP1B和TFDP1A/1B KD中的MIC数量受到了影响。TFDP1A KD和TFDP1B KD的细胞主要包含两个MICs，含有≥8个微核的细胞比例显著降低（分别为3.15%和3.66%）（图4C、D）。TFDP1A/1B KD则表现出以单个微核为主的表型（39.35%），其中大多数细胞处于纺锤形阶段（图4E、F）。同时，含有四个MICs（减数分裂I完成）和≥8个MICs（减数分裂II完成）的细胞数量急剧下降（分别为12.57%和6.14%到0.3%）（图4E）。

在TFDP1A、TFDP1B和TFDP1A/1B KD中，MICs的减数分裂过程存在显著缺陷，导致大量细胞停滞在纺锤形阶段，特别是在赤道板处观察到了明显的信号，这对应于中期染色体的排列时期（图4F–I）。而在EV对照组中，MICs的形态分布较为平衡，纺锤形和延长阶段的细胞分别占21.2%和32.28%（图4F）。TFDP1A、TFDP1B和TFDP1A/1B下调处理后，有65.74%、54.75%和88.51%的细胞处于纺锤形阶段。此外，延长阶段的MICs比例显著降低，尤其是在TFDP1A/1B KD中，只有3.72%的细胞达到这一阶段（而EV对照组中这一比例为32.28%）。

随着自交过程的发展，EV对照组细胞会形成两个新的MICs和两个可见的新MACs，但在TFDP1A、TFDP1B和TFDP1A/1B下调处理的细胞中，MICs仍无法完成减数分裂。这些细胞核重新浓缩，没有永久保持纺锤形，且部分细胞失去了MICs（补充图S4）。总体而言，Tfdp1a和Tfdp1b对于MICs的减数分裂至关重要，它们的缺失会导致MICs在中期停滞。

由于TFDPs是重要的转录调节因子，通过调控基因表达来控制细胞周期，我们推测Tfdp1a和Tfdp1b的缺失也会通过改变基因表达来影响Paramecium tetraurelia的自交过程。因此，我们通过对TFDP1A、TFDP1B和TFDP1A/1B进行mRNA测序来研究它们在转录调节中的作用。转录组数据的主成分分析（PCA）显示对照组（EV）和下调组之间存在明显的聚类模式（图5A）。进一步分析也表明对照组和下调组之间的基因表达模式存在差异，三个下调组在热图中聚集在一起，表明它们的转录谱与对照组相比具有更高的相似性，这与PCA结果一致（图5B）。

**图5** 这张图像的替代文本可能是由AI生成的。

**TFDP1A和TFDP1B下调处理的转录影响。** A. EV对照组、TFDP1A KD、TFDP1B KD和TFDP1A/1B KD的转录组的主成分分析（PCA）。B. 热图显示EV对照组、TFDP1A KD、TFDP1B KD和TFDP1A/1B KD中的基因表达水平。C–E. 火山图显示与EV对照组相比，TFDP1A KD（C）、TFDP1B KD（D）和TFDP1A/1B KD（E）中差异表达的基因（DEGs）。F. 文氏图显示TFDP1A KD、TFDP1B KD和TFDP1A/1B KD中下调DEGs的重叠部分。G. TFDP1A KD、TFDP1B KD和TFDP1A/1B KD中下调DEGs的表达特征。

通过分析下调组与EV对照组之间的基因表达变化，我们首先确认了目标基因的有效沉默。TFDP1A的水平在TFDP1A KD中降低了21.6倍（Log2倍数变化 = –4.43），TFDP1B的水平降低了22.2倍（Log2倍数变化 = –4.47）（补充表S4）。在TFDP1A/1B KD中，TFDP1A和TFDP1B分别降低了14.2倍（Log2倍数变化 = –3.83）和9.3倍（Log2倍数变化 = –3.21）（补充表S4）。值得注意的是，TFDP1A和TFDP1B下调之间没有观察到交叉影响，这一点通过单基因下调实验中未出现相互对应的基因表达变化得到证实。

通过将下调组与EV对照组进行比较，分别在TFDP1A、TFDP1B和TFDP1A/1B KD中检测到481、454和658个差异表达基因（DEGs），其中450、428和639个基因下调（图5C–E）。共有344个基因在所有三个下调组中都下调，占DEGs的显著比例（图5F）。根据Paramecium tetraurelia在营养生长阶段和自交阶段的表达谱，这些基因被分为七类：早期峰值、早期抑制、中间峰值、晚期诱导、晚期峰值、晚期抑制和无变化（表示两个阶段之间没有显著表达变化）（Arnaiz等人，2017年）。除“无变化”类外的其他类别在自交过程中表现出特定的表达模式改变。值得注意的是，在TFDP1A、TFDP1B和TFDP1A/1B下调处理中，下调的DEGs在自交时间过程中的表达变化主要集中在这些类别中（图5G）。此外，中间峰值类别在每个下调组中占DEGs的最大比例（TFDP1A KD占63.11%，TFDP1B KD占67.99%，TFDP1A/1B KD占48.70%）。Paramecium tetraurelia中对于自交功能至关重要的基因主要位于中间峰值、早期峰值和晚期峰值类别中，这三个关键功能类别占了所有下调组中DEGs的60%以上。这些发育关键基因的显著失调可能是导致下调细胞无法完成自交的原因。

当Tfdp1a和/或Tfdp1b缺失时，与转录和细胞周期相关的基因会被下调。随后我们对这些DEGs进行了基因本体论（GO）富集分析。在TFDP1A、TFDP1B和TFDP1A/1B下调处理中，上调的DEGs很少，且没有GO术语富集。因此，这里仅展示下调DEGs的结果（图6A–C）。在所有三个下调处理中，都观察到许多与转录相关的GO术语富集，例如RNA聚合酶II的转录、RNA聚合酶II的转录调控、DNA模板转录、DNA模板转录的调控和基因表达的调控。TFDP1A/1B KD中的DEGs在与细胞周期和DNA损伤反应相关的GO术语中表现出富集（包括细胞周期、细胞周期过程、细胞周期调控、有丝分裂细胞周期、有丝分裂细胞周期过程和DNA损伤反应）（图6C）。

**图6** 这张图像的替代文本可能是由AI生成的。

**TFDP1A和TFDP1B下调处理的转录影响。** A. EV对照组、TFDP1A KD、TFDP1B KD和TFDP1A/1B KD的转录组主成分分析（PCA）。B. 热图显示EV对照组、TFDP1A KD、TFDP1B KD和TFDP1A/1B KD中的基因表达水平。C–E. 火山图显示与EV对照组相比，TFDP1A KD（C）、TFDP1B KD（D）和TFDP1A/1B KD（E）中差异表达的基因（DEGs）。F. 文氏图显示TFDP1A KD、TFDP1B KD和TFDP1A/1B KD中下调DEGs的重叠部分。G. TFDP1A KD、TFDP1B KD和TFDP1A/1B KD中下调DEGs的表达特征。

通过分析下调组与EV对照组之间的基因表达变化，我们首先确认了目标基因的有效沉默。TFDP1A的水平在TFDP1A KD中降低了21.6倍（Log2倍数变化 = –4.43），TFDP1B的水平在TFDP1B KD中降低了22.2倍（Log2倍数变化 = –4.47）（补充表S4）。在TFDP1A/1B KD中，TFDP1A和TFDP1B分别降低了14.2倍（Log2倍数变化 = –3.83）和9.3倍（Log2倍数变化 = –3.21）（补充表S4）。值得注意的是，TFDP1A和TFDP1B下调之间没有观察到交叉影响，这一点通过单基因下调实验中未出现相互对应的基因表达变化得到证实。

通过将下调组与EV对照组进行比较，在TFDP1A、TFDP1B和TFDP1A/1B KD中分别检测到481、454和658个差异表达基因（DEGs），其中450、428和639个基因下调（图5C–E）。共有344个基因在所有三个下调组中都下调，占DEGs的显著比例（图5F）。根据Paramecium tetraurelia在营养生长阶段和自交阶段的表达谱，这些基因被分为七类：早期峰值、早期抑制、中间峰值、晚期诱导、晚期峰值、晚期抑制和无变化（表示两个阶段之间没有显著表达变化）（Arnaiz等人，2017年）。除了“无变化”类外的其他类别在自交过程中表现出特定的表达模式改变。在TFDP1A、TFDP1B和TFDP1A/1B下调处理中，下调的DEGs在这些自交时间过程中的表达变化类别中显著富集（超过90%）（图5G）。此外，中间峰值类别在每个下调组中占DEGs的最大比例（TFDP1A KD占63.11%，TFDP1B KD占67.99%，TFDP1A/1B KD占48.70%）。对于Paramecium tetraurelia的自交过程来说，功能上至关重要的基因主要位于中间峰值、早期峰值和晚期峰值类别中，这三个关键功能类别占所有下调组中DEGs的60%以上。这些发育重要基因的显著失调可能是导致下调细胞无法完成自交的原因。

接下来，我们对这些DEGs进行了基因本体论（GO）富集分析。在TFDP1A、TFDP1B和TFDP1A/1B下调处理中，上调的DEGs很少，且没有GO术语富集。因此，这里只展示下调DEGs的结果（图6A–C）。在所有三个下调处理中，与转录相关的GO术语显著富集，例如RNA聚合酶II的转录、RNA聚合酶II的转录调控、DNA模板转录、DNA模板转录的调控和基因表达的调控。TFDP1A/1B KD中的DEGs在与细胞周期和DNA损伤反应相关的GO术语中表现出富集（包括细胞周期、细胞周期过程、细胞周期调控、有丝分裂细胞周期、有丝分裂细胞周期过程和DNA损伤反应）（图6C）。

**图6** 这张图像的替代文本可能是由AI生成的。

**基因本体论（GO）和KEGG富集分析差异表达基因（DEGs）。** A–C. TFDP1A KD（A）、TFDP1B KD（B）和TFDP1A/1B KD中下调DEGs的GO富集分析。D. TFDP1A/1B KD中下调DEGs的KEGG富集分析。

我们进一步进行了KEGG通路富集分析以确定这些DEGs的功能。鉴于TFDP1A/1B KD表现出最严重的表型缺陷，我们对这一下调组中的DEGs进行了后续的KEGG分析。在前30个显著富集的KEGG通路中，观察到与细胞周期和减数分裂相关的通路显著富集，包括细胞周期（ko04110）、细胞周期—酵母（ko04111）、减数分裂—酵母（ko04113）和卵母细胞减数分裂（ko04114）（图6D）。在这些通路中，我们发现了一些对这些过程至关重要的基因的同源物，如SMC1、Ycs4、Cyclin B、Cyclin E、Cdh1、Cdc20和Cks，它们的表达都下调了（图7A）。此外，多个与DNA复制和修复相关的通路也显著富集，包括DNA复制（ko03030）、碱基切除修复（ko03410）、错配修复（ko03430）和非同源末端连接（NHEJ）（ko03450）（图7B–F）。这些通路中包括Orc1、Mcm4、Mcm5、Dna2、ExoI、Lig1、Ku80、DNA Pol λ、HMGB1、PARP和PARG等基因的同源物，它们的表达都下调了（图7A）。我们选择了其中13个基因进行RT-qPCR验证，并确认它们在TFDP1A、TFDP1B和TFDP1A/1B KD中显著下调（图7G）。

**图7** 这张图像的替代文本可能是由AI生成的。

**TFDP1A/1B KD中差异表达基因的代表性KEGG通路富集。** A. 热图显示了富集通路中相关基因的表达水平，左侧标注了基因名称，右侧标注了Paramecium tetraurelia中的相应基因ID。B–F. 减数分裂（B）、DNA复制（C）、非同源末端连接（NHEJ）（D）、错配DNA修复（E）和碱基切除修复（F）的示意图。所有差异表达的基因都用绿色箭头标示为下调基因。**、**、***和****分别表示P < 0.01、P < 0.001和P < 0.0001。条形图下方的数字代表A中显示的基因ID的最后八位数。

**图6** 和**图7** 的GO和KEGG分析都是针对差异表达基因（DEGs）进行的。为了更全面地了解全局基因表达模式，我们使用TFDP1A/1B KD的数据进行了基因集富集分析（GSEA）。我们的GO和KEGG分析结果一致，表明与减数分裂直接或间接相关的过程，包括染色质、染色体、DNA聚合酶活性、DNA复制、DNA修复、DNA重组和DNA损伤反应，在GSEA中都表现出整体下调趋势（补充图S5）。总之，Tfdp1A/1B的缺失导致参与减数分裂、DNA复制和修复的多条通路失调，从而导致在性过程中无法完成关键的核事件。

另一个导致Paramecium tetraurelia旧MAC碎片化失败的情况是PTIWI09的过表达。当含有PTIWI09基因的质粒被强注射到MAC中时，Paramecium tetraurelia表现出与TFDP1A/1B KD相似的旧MAC表型，无法变形和碎片化（补充图S6A）。我们比较了PTIWI09过表达细胞和TFDP1A/1B KD细胞中的DEGs，确定了338个表达一致的DEGs（238个上调，336个下调）。在这些基因中，29个是功能上已知的基因，与旧MAC碎片化无关。剩余的309个基因中，60个被分类为早期峰值，197个为中间峰值，16个为晚期诱导，5个为无变化（Paramecium数据库中的分类）（补充表S5）。进一步研究这些基因可能会揭示调控旧MAC碎片化的机制。

Tfdp1a和Tfdp1b对于MICs中scnRNA的产生是可有可无的。Tfdp1a和Tfdp1b的缺失导致广泛的基因失调，下调基因中与转录相关的GO术语大量富集（图6A–C）。结合其对微核（MIC）减数分裂的影响（图4），这促使我们研究Tfdp1a和Tfdp1b缺失是否也会影响MIC内的转录活动。在自交过程中，MICs会被转录以产生一类称为scnRNA的小RNA，这些scnRNA与Ptiwi01和Ptiwi09蛋白结合（图8A）（Bouhouche等人，2011年；Furrer等人，2017年）。这些scnRNA对于引导Ptiwi09依次进入旧MAC然后进入新MAC至关重要，最终有助于在新MAC中识别可移动元件（TEs）和TE衍生的内部消除序列（IESs）（图8B）。为了检查scnRNA的生物发生是否受到影响，我们利用了Ptiwi09核定位依赖于scnRNA结合的事实：下调生成scnRNA的核糖核酸酶Dcl2/3会阻止scnRNA的产生，从而使Ptiwi09微核（Micronuclei, MICs）经历双向转录，产生scnRNA，这些scnRNA与Ptiwi09结合形成复合物，并被运输到旧的大核（macro nucleus, MAC）中。与旧MAC基因组互补的scnRNA会被降解，而剩余的scnRNA/Ptiwi09复合物则进入正在发育的新MAC中，以识别转座子（transposons, TEs）和内部消除序列（internally eliminated sequences, IESs），并定位它们从基因组中剔除。图B-F展示了EV（B）、DCL2/3 KD（C）、TFDP1A KD（D）、TFDP1B KD（E）和TFDP1A/1B KD（F）对Ptiwi09定位的影响。比例尺：10 μm。

接下来，我们研究了Tfdp1a和Tfdp1b对Ptiwi09核定位的影响。在敲低TFDP1A、TFDP1B或TFDP1A/1B后，尽管核发育出现异常（包括旧MAC的破碎和无法形成新MAC），仍然观察到了Ptiwi09的存在（图8D-F）。这种持续的核定位表明，即使在没有Tfdp1a和/或Tfdp1b的情况下，scnRNA的产生及其与Ptiwi09的结合仍然正常进行。因此，MICs中的scnRNA转录和生成不依赖于Tfdp1a和Tfdp1b。

**讨论**
在Paramecium tetraurelia中，TFDP基因家族发生了扩张。TFDP家族蛋白是重要的转录调节因子，它们与E2F蛋白形成异二聚体，协调细胞周期、DNA复制、DNA修复、细胞增殖和分化等基本过程（DeGregori和Johnson 2006；Kent和Leone 2019；Ren等人2002）。虽然人类和灵长类动物各拥有三个TFDP同源基因（TFDP1、TFDP2、TFDP3），大多数哺乳动物（如小鼠、狗）保留了TFDP1和TFDP2，但无脊椎动物如果蝇（Drosophila）和秀丽隐杆线虫（C. elegans）仅持有一个TFDP基因（Dynlacht等人1994；Huang等人2021；Miller等人2016）。在纤毛虫中，T. thermophila拥有三个TFDP基因（Zhang等人2018），而我们的同源性分析显示，在P. tetraurelia中这一家族增加了16个同源基因（图1A）。这种显著的扩张可能源于Paramecium谱系中至少进行了三轮全基因组复制事件（Aury等人2006）。P. tetraurelia中扩增的TFDP基因在功能域上存在差异：其中六个基因同时具有E2F/DP家族的翼螺旋DNA结合域和异二聚化域，而另外十个基因仅具有DNA结合域（图1A）。此外，P. tetraurelia中TFDPs的表达模式也各不相同（图1B）。然而，只有TFDP1A和/或TFDP1B的敲低才会影响特定表型，并且仅在自体生殖过程中发挥作用。它们的缺失导致旧MAC的破碎和MIC减数分裂的异常（图3、4）。尽管Tfdp1a和Tfdp1b的序列高度相似，但它们的功能并不完全相同，因为单独缺失任一基因都会导致异常表型。然而，同时敲除这两个基因时观察到的更严重表型表明它们存在部分功能冗余。因此，Tfdp1a和Tfdp1b具有不同的关键功能，但仍存在一定程度的功能重叠。

Tfdp1a和Tfdp1b影响减数分裂相关基因的表达
在P. tetraurelia中，Tfdp1a和/或Tfdp1b的缺失会严重扰乱减数分裂，表现为染色体在中期板对齐但无法分离（图4）。传统上，E2F/TFDP复合物通过转录调控靶基因来控制细胞周期的进展，我们的结果表明Tfdp1a和Tfdp1b在MIC减数分裂中也通过类似的转录机制发挥作用。与TFDP蛋白主要定位在大核中一致，我们认为它们对MIC减数分裂的影响是通过在大核内调节效应蛋白的转录来实现的。

**TFDP1A/1B敲低后的转录组分析**显示基因表达广泛下调（图5）。已知E2F/TFDP复合物在不同细胞周期阶段可作为依赖上下文的转录激活因子或抑制因子（Kent和Leone 2019）。在我们的敲低实验中，下调基因明显增多，这表明在P. tetraurelia中Tfdp1a/1b主要在自体生殖开始时作为转录激活因子。然而，需要注意的是，在P. tetraurelia中实现完全同步的自体生殖非常困难。因此，收集的样本包含了处于不同减数分裂阶段的细胞，观察到的表型和转录组结果代表了群体平均效应。

Tfdp1a和Tfdp1b的缺失导致许多减数分裂相关基因的抑制（例如Smc1、Ycs4、Cyclin B、Cdc20、Cdh1和Cks）（图7A、B、G）。Smc1是cohesin复合体的核心组成部分，对姐妹染色单体的凝聚至关重要，确保染色体正确分离和同源重组（Ishiguro 2019；Lee和Orr-Weaver 2001；Peters和Nishiyama 2012）。Ycs4是酵母中condensin复合体的成分，对减数分裂期间的染色体浓缩、双链断裂形成和同源重组至关重要（Lu等人2019；Sarkar等人2021）。Cdc20和Cdh1是APC/C复合体的关键激活因子，在不同阶段发挥作用并赋予底物特异性（Visintin等人1997）。APCCdc20靶向Securin和Cyclin B（两者都可以抑制Seperase的活性）进行降解，从而激活Seperase切割cohesin复合体，使同源染色体和姐妹染色单体分离（Fan等人2006；Pesin和Orr-Weaver 2008）。APCCdh1具有更广泛的底物特异性，对多种减数分裂细胞周期调节因子的水平调节至关重要（Ostapenko和Solomon 2024；Tanno等人2020）。Cks是MPF（成熟促进因子，由CDK1和Cyclin A/B组成的复合体）活性的调节因子，其缺失会导致APC/C激活和纺锤体组装缺陷（Ellederova等人2019；Polinko和Strome 2000）。所有这些蛋白质都对减数分裂的正常进行至关重要。Tfdp1a和Tfdp1b的缺失导致MIC的减数分裂停留在中期，即同源染色体和姐妹染色单体的分离阶段。Smc1、Cdc20和Cks的功能直接与此过程相关，它们的表达抑制可能解释了MIC减数分裂的失败。除了KEGG注释为减数分裂相关途径的基因外，许多差异表达基因（DEGs）也被注释为细胞周期相关基因，这些基因也可能参与减数分裂的调控；然而，它们的功能需要进一步探索。

**Tfdp1a和Tfdp1b调节DNA修复机制的相关基因**
DNA损伤在减数分裂和有丝分裂期间都会发生，需要及时修复以维持基因组稳定性。在其他生物中，E2F/TFDP复合物已被证明参与这一过程，我们的研究发现Tfdp1a和Tfdp1b在调节DNA损伤修复相关基因中起关键作用（图7D-F）。TFDP1A/1B的敲低导致多个DNA损伤修复途径显著下调，特别是非同源末端连接（NHEJ）、错配修复（MMR）和碱基切除修复（BER）。这些途径在差异表达基因的KEGG分析中也得到了体现。在NHEJ中，Ku70/Ku80异二聚体识别断裂位置，随后核酸酶、聚合酶和连接酶依次作用修复断裂；在我们的敲低实验中，Ku80和缺口填充DNA聚合酶λ（DNA Pol λ）的表达都降低了（Lieber 2008；Lieber等人2010）。在MMR中，外切酶1（EXO1）先切除错配片段，然后由DNA聚合酶δ进行修复，接着由DNA连接酶I（Lig1）完成连接；在敲低实验中，EXO1和Lig1都下调了（Kunkel和Erie 2005；Li 2008）。在BER中，关键下调的因素包括HMGB1（通过弯曲DNA增强AP内切酶活性）、PARP（合成PAR链以招募修复因子）和PARG（修复后的PAR链降解）（Krokan和Bj?r?s 2013；Liu等人2010；Prasad等人2015；Robertson等人2009）。此外，Pol λ参与短段BER的缺口合成，Lig1参与长段BER的连接，在我们的研究中也均下调了。我们在P. tetraurelia中的研究显示，Tfdp1a和Tfdp1b缺失后，许多DNA修复相关基因也下调，表明TFDP蛋白可能也参与了这种生物体的DNA修复过程，类似于在其他生物体中的观察结果。

**TFDP在不同生物体中的多种功能**
TFDP在多种生物体中被发现，并表现出多种功能。哺乳动物的TFDP1和TFDP2与E2F结合形成异二聚体，这对于高亲和力DNA结合和有效的E2F转录调控至关重要（Girling等人1993）。这些异二聚体结合到启动子上的E2F识别序列TTT(C/G)GCGC(C/G)上，从而激活或抑制靶基因，具体取决于参与的E2F成员（Ginsberg等人1994；Humbert等人2000；Morkel等人1997；Sardet等人1995；Wu等人2001）。通过转录调控，TFDP1/2-E2F参与多种基本生命过程，如G1期到S期的转换、细胞凋亡的诱导、细胞周期退出和细胞分化（Cuitino等人2019；Humbert等人2000；Sardet等人1995；Zhu等人1999）。与TFDP1和TFDP2不同，TFDP3会降低E2F的DNA结合活性，并抑制E2F介导的转录活性、细胞凋亡和细胞周期调控（Huang等人2021；Qiao等人2007）。在纤毛虫T. tetrahymena中，Dpl2与E2fl2结合，调节减数分裂相关基因的表达，如DNA修复和染色体分离所需的基因（Zhang等人2018）。因此，Dpl2敲低细胞在后期之前就停滞了减数分裂。与T. tetrahymena类似，我们发现Tfdp1a和Tfdp1b对P. tetraurelia的MIC减数分裂也是必需的。它们的缺失导致染色体分离失败，MIC停留在中期。除了减数分裂外，Tfdp1a和Tfdp1b还调节许多对MAC碎片化至关重要的基因，这是P. tetraurelia有性生殖的重要过程。

TFDP在不同生物体中调节不同的基因集合，控制不同的生物过程。在细胞周期中，TFDP-E2F复合物调节G1期到S期转换和S期DNA复制所需的基因。同样，在P. tetraurelia中，我们也观察到细胞周期转换和DNA复制相关基因下调（图7C），如Mcm（MiniChromosome Maintenance复合体）、Orc（复制起点复合体）、Lig1和Dna2（滞后链合成所需的因子）（Bae等人2002；Blair等人2022；Fagundes和Teixeira 2021；Sun和Kong 2010）。尽管如此，MIC仍能进入M期，说明G1期、S期和G2期已经完成。减数分裂后，其中一个配子核会发生有丝分裂。由于在TFDP1A和/或TFDP1B被沉默时MIC停留在中期，配子核的有丝分裂期间无法进行DNA复制。因此，尽管Tfdp1a和Tfdp1b对减数分裂和DNA复制都是必需的，但后者可能是由于减数分裂失败而间接引起的。