利用巴西曲霉（Aspergillus brasiliensis）通过氧化锌纳米颗粒生产柠檬酸：工艺优化、动力学及机理研究

《Systems Microbiology and Biomanufacturing》：Zinc oxide nanoparticle-based citric acid production using Aspergillus brasiliensis: process optimization, kinetics and mechanisms

　　摘要
本研究利用巴西曲霉（Aspergillus brasiliensis）优化了从预处理过的马铃薯皮废料中同时进行纳米粒子基糖化和柠檬酸（CA）生产的过程。该模型具有较高的决定系数（R2）（0.929），并预测出最佳预处理条件分别为：ZnO纳米粒子浓度0.05 wt%、固体装载量19.85%、温度32.5°C和pH值2.03。经过验证的工艺过程产生了1.54 g/L的巴西曲霉生物量和19.85 g/L的柠檬酸浓度，分别比对照实验高出1.19倍和1.38倍。有趣的是，动力学评估还显示，在ZnO纳米粒子体系中，最大特定生长速率（μmax）增加了2.67倍，最大潜在柠檬酸浓度（Pm）增加了1.07倍。ZnO纳米粒子在生长介质中形成的催化微环境和稳定的Zn2+释放可能是促进巴西曲霉高特定生长速率和柠檬酸产量的关键机制。本研究的结果有助于推动基于纳米粒子的废物转化生物工艺的实施，从而改善废物管理并降低柠檬酸生产成本，符合废物管理、环境可持续性和食品经济的循环发展理念。

引言
柠檬酸（CA）广泛应用于化工、制药、食品、化妆品和饮料等行业（Latif等人，2025年）。每年全球柠檬酸产量约为200万吨，预计需求每年增长5%（Latif等人，2025年）。近年来，由于原料成本高昂和产量低下，柠檬酸市场面临压力。因此，需要廉价、易获取且可持续的原料，如木质纤维素生物质，以降低生产成本（Sanusi等人，2025年）。木质纤维素生物质（LCB）是一种天然存在的复合物质，来源于植物干物质。全球陆地生物质和水生生物质储量分别约为1.8万亿吨和40亿吨，其中约50%为木质纤维素。利用可再生木质纤维素生物质生产柠檬酸等生物产品是一种有前景的方法，有助于降低成本（Naidu等人，2025年）。由于木质纤维素生物质通常被视为废物，因此不会对食品安全、森林砍伐、社会不稳定和水资源短缺等社会经济问题构成威胁。此外，将其用于柠檬酸生产可以解决废物处理问题，实现环保的废物管理（Sanusi等人，2021年；Laltha等人，2022年）。多种农业木质纤维素原料，如马铃薯皮废料，可用作生物产品和柠檬酸生物转化的原料（Naidu等人，2025年）。尽管已经从包括香蕉皮（Odu等人，2020年）、红薯皮（Aboyeji等人，2020年）和甘蔗渣（Aboyeji等人，2020年）在内的木质纤维素原料中提取了柠檬酸，但关于利用马铃薯皮废料生产柠檬酸的研究较少。马铃薯是全球第三大重要粮食作物，仅次于水稻和小麦。由于其在食品工业中的广泛使用，产生了大量的马铃薯皮废料（PPW）。马铃薯加工行业产生的废料占马铃薯原料的20%至50%，其主要化学成分包括淀粉和非淀粉多糖（纤维素、半纤维素、木质素和果胶）（Sanusi等人，2021年）。除了需要通过廉价、易获取和可持续的原料（如PPW）来降低工艺成本外，提高工艺效率也是提高柠檬酸产量和生产力的关键。使用纳米粒子作为生物催化剂可以增强工艺效率，通过增加传质和传热、提高底物与细胞的亲和力、促进微生物生长以及利用其较大的表面积、催化特性和氧化还原功能（Sanusi等人，2021年；Mweli等人，2026年）。此外，纳米粒子作为微量营养素和酶辅因子，对其添加到发酵过程中有助于刺激和改善柠檬酸生物工艺的性能（Sanusi等人，2020年）。因此，纳米生物技术有潜力提升产柠檬酸真菌的生物活性。

柠檬酸的生产还受到多种工艺条件的影响，如pH值、操作温度和底物浓度，这些因素可能阻碍或促进真菌向柠檬酸的代谢转化（Odu等人，2020年；Sanusi等人，2020年）。研究表明，对于最佳生产率，pH值应在2至6之间（Odu等人，2020年）。操作温度对柠檬酸发酵至关重要，因为它影响真菌生长动力学、底物利用和柠檬酸的形成。因此，优化这些输入因素有助于促进微生物生长和最大化柠檬酸产量。工艺建模和优化方法对于实现高效、高产和低成本的柠檬酸生产具有重要意义。常用的工艺模型包括响应面法（RSM）和人工神经网络（ANN），这些方法基于统计和数学手段来优化工艺参数以提高产品产量。响应面法可作为分析工具，揭示输入参数与输出之间的相互作用，从而改善代谢性能（Sanusi等人，2020年；Mweli等人，2026年）。目前，关于添加金属氧化物纳米粒子以提升巴西曲霉柠檬酸产量的研究较少，关于在廉价且丰富的马铃薯皮废料同时糖化和发酵过程中使用ZnO纳米粒子作为生物催化剂的研究也较为缺乏。本研究旨在利用巴西曲霉作为发酵微生物，对基于纳米粒子的马铃薯皮废料糖化和柠檬酸生产进行建模和优化。此外，还使用了改进的Gompertz模型和逻辑模型来评估在最佳条件下的巴西曲霉生长和柠檬酸生产动力学。

材料与方法
**ZnO纳米粒子的合成**
将0.02 mol/L的ZnSO4·7H2O溶解在20 mL无菌蒸馏水中，然后缓慢加入1 mol/L的NaOH溶液，调整pH值至11.29。将此溶液置于微波辐射下（700 W，Samsung，ME9114S1）处理3分钟（1分钟开启，10秒关闭）。用蒸馏水冲洗白色沉淀物，并在70°C下干燥（Aruwajoye等人，2025年）。随后使用扫描电子显微镜（SEM，ZEISS，Model ZEISS-EVO/LS15，英国）和透射电子显微镜（TEM，JEM-1400，JEOL，美国）评估纳米粒子的元素组成和粒径（Aruwajoye等人，2025年）。

**工艺建模与优化**
采用Box-Behnken设计的响应面法（Design Expert 12.0，Stat Ease Inc，美国）生成了29次独立的SSF实验（表1）。根据文献选择了四个独立变量：pH值、ZnO纳米粒子浓度、工艺温度和固体装载量，柠檬酸浓度作为响应输出（Sanusi等人，2022年；Bishop等人，2024年；Naidu等人，2025年）。输入参数的范围分别为pH值2–7、ZnO纳米粒子浓度0–0.05 wt%、温度27–45°C和固体装载量5%–20%，并根据表1进行实验。使用Design Expert软件，将实验数据拟合到二次多项式模型方程中，表示输入参数与柠檬酸浓度之间的关系（方程1）。

**底物预处理和液化**
新鲜马铃薯皮在烤箱中干燥后粉碎成细粉（≤2 mm）。干燥底物含有38%的淀粉、7%的纤维素、9%的半纤维素和5%的木质素，其他成分（41%）包括水分、灰分、粗蛋白和脂肪（Sanusi等人，2022年）。然后按照先前建立的预处理方法对底物进行预处理（Aruwajoye等人，2020年）。简要来说，将0.92 mL的HCl溶液加入25 mL蒸馏水中，与粉碎后的底物混合后置于121°C下高压灭菌10分钟。将预处理后的酸性水解物中和至pH值7，以便加入125.3单位/g的α-淀粉酶（液化酶）。随后将其置于摇床中（100 r/min），在90°C下孵育60分钟。最后在96°C下灭活液化酶10分钟。

**柠檬酸SSF工艺条件**
**接种物制备**：巴西曲霉在28°C下，在改良的Sabouraud葡萄糖琼脂-Emmon培养基上培养7天（Laltha等人，2022年）。接种物（1×10^6孢子/mL）通过孢子悬浮液制备在无菌蒸馏水中。
**发酵液制备**：发酵液包含酵母提取物（2.25 g/L）、KH2PO4（0.2 g/L）和MgSO4（0.2 g/L），并在121°C下灭菌15分钟。SSF在50 mL工作体积的锥形瓶中进行，每个瓶子含有预处理和液化的马铃薯皮废料、调整后的pH值和不同浓度的ZnO纳米粒子，以及20 mL发酵液和10%的巴西曲霉接种物。最后加入15单位/g的β-葡萄糖苷酶（Sigma Aldrich，南非）以完成糖化阶段。然后在指定温度下（表1）以150 r/min的速度孵育168小时。定期取样并储存在-20°C下进行进一步分析。

**验证实验**
在柠檬酸模型预测的最佳参数下进行验证实验。每24小时收集一次样品，持续168小时，测定柠檬酸浓度和巴西曲霉生物量。验证实验使用不含ZnO纳米粒子的对照组进行。

**分析方法**
储存样品在10,000 r/min下离心10分钟，通过滴定法测定上清液中的柠檬酸浓度，并通过化学计量计算进行外推（Laltha等人，2022年）。使用Neubauer细胞计数室测定巴西曲霉生物量。然后根据预定的标准校准曲线，根据孢子计数与生物量干重（g/L）的相关性计算细胞干重。
柠檬酸产率按照方程2计算：
$$\text{柠檬酸产率}\,(\text{g/l/h)} = \frac{\text{最大柠檬酸浓度}\,(\text{g/l)}}{\text{发酵时间}\,\(\text{h}\)}$$
此外，Richards曲线（方程3）描述了巴西曲霉生长过程中不同时间（t）的生物量（X）、初始细胞浓度（X0）、最大细胞浓度（Xmax）和最大特定生长速率（μmax）之间的相关性（Eregie等人，2024年；Adebule等人，2025年）：
$$X = \frac{{X}_{0}\text{exp}\left(\mu_{max}t\right)}{1\left[\left(\frac{{X}_{0}}{{X}_{max}}\right)\left(1-\text{exp}\left(\mu_{max}t\right)\right)}$$
此外，柠檬酸生产实验数据被拟合到改进的Gompertz动力学模型（方程4）中。该模型将柠檬酸浓度（P）（g/L）与最大柠檬酸浓度（Pm）（g/L）、最大柠檬酸生产速率（rp, m）（g/L/h）和延迟时间（tL）（h）联系起来：
$$\text{P} = P_{m}\cdot\text{exp}(-exp\,\left[\frac{{r}_{p.m}\cdot\text{exp}\left(1\right)}{{P}_{m}}\right]\cdot\left({t}_{L}-t\right)+1$$

**结果与讨论**
**ZnO纳米粒子的表征**
TEM显微图像显示了ZnO纳米粒子的不规则形状（图1）。此外，图1显示ZnO纳米颗粒的粒径分布较窄（11–99纳米），平均直径为50纳米。由于纳米颗粒的生物技术和催化潜力依赖于其尺寸，因此本研究中ZnO纳米颗粒的平均粒径可能处于影响A. brasiliensis细胞吸收的柠檬酸作用范围内。例如，?ztürk等人（2024年）报告称，纳米颗粒的形状和大小显著影响其细胞摄取。图2显示了合成ZnO纳米颗粒的SEM-EDS元素组成，主要为锌（75.01%）和氧（24.99%）。高比例的锌元素对ZnO纳米颗粒的基本性质、生物化学功能性和反应性至关重要，正如本研究所展示的那样。像锌离子这样的金属离子可以在柠檬酸生物加工过程中的酶促反应中作为辅因子。由于酶促反应具有特异性，因此激活这些金属离子的条件也具有特异性。具体来说，柠檬酸生物加工过程需要锌离子等关键离子。锌是一种在柠檬酸发酵中必需的矿物质，尽管其需求量仅为微摩尔级别。锌在细胞周期（繁殖）和酶促活性中也非常重要，因为负责柠檬酸产生的酶需要锌作为辅因子，因此ZnO纳米颗粒的添加提高了柠檬酸的生物加工效率（在本研究中，柠檬酸产量增加了1.24倍）。已知较低浓度/剂量的ZnO纳米颗粒具有催化潜力，而高剂量时则可能表现出抗菌特性（Sanusi等人，2020年）。这些特性取决于它们的尺寸、形状和表面积。在生物化学过程中使用纳米颗粒作为补充剂或催化剂是最近的技术之一（Mweli等人，2026年）。在本研究中，评估了添加ZnO纳米颗粒的营养培养基中A. brasiliensis细胞的生长和柠檬酸产量反应。

图1
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TEM显微图（在120 kV电压下获得，放大倍数≤2,5000）

图2
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合成ZnO纳米颗粒的SEM-EDS元素百分比谱

表1显示了实验条件及相应的柠檬酸（CA）浓度。所获得的反应数据用于生成多项式方程（方程6），以说明柠檬酸浓度与发酵输入变量之间的关系。该多项式方程提供了基于实验的数据来预测柠檬酸产量。
$$\begin{aligned}
&\text{柠檬酸浓度} \\
&=7.36-0.27A-2.92B+0.20C+3.20D-0.98AB \\
&+1.12AC-0.80AD-1.40BC-0.40BD+0.48CD \\
&+1.28A^2+2.02B^2+0.97C^2+0.39D^2
\end{aligned}$$
（5）
其中Y代表方程（5）中的柠檬酸浓度，A、B、C和D分别代表氧化锌纳米颗粒、温度和固体负荷。

此外，使用方差分析（ANOVA）来评估拟合模型的有效性（表2）。柠檬酸浓度的F值为17.99，P值<0.0001，表明参数和模型具有显著性；而高F值表明响应趋势可以通过回归方程来解释。模型的决定系数（R2）值为0.929，表明所开发的模型可以解释观察到的实验数据中超过92%的变异。另外，根据分配给每个实验参数的P值（表2），pH值和固体负荷（P值≤0.0001）分别显著影响了柠檬酸的产量。生产过程中遇到的低pH值（约2）降低了不希望出现的微生物污染风险，并阻碍了草酸和葡萄糖酸等不希望出现的有机酸的形成，这可能对下游加工产生积极影响，使产品回收更加容易（Laltha等人，2022年）。固体负荷参数影响SSF过程中的质量和传热效率。当固体负荷较高时，肉汤粘度增加，从而降低了酶的扩散速度，这可能对真菌细胞生长和柠檬酸的形成产生负面影响（Arshad等人，2025年）。pH值和温度的交互作用显著影响柠檬酸浓度（P值=0.0389）。温度对SSF过程有双重影响，因为它同时影响酶促和微生物代谢过程。温度影响酶促活性和糖释放的糖化效率（Duan等人，2021年）。

表2 RSM模型的方差分析（ANOVA）

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表1显示了各种实验运行下的柠檬酸浓度。当纳米颗粒浓度为0.025 wt%，pH值为2，温度为45°C，固体负荷为12.50%时，柠檬酸SSF过程产生了较高的柠檬酸浓度（15.69 g/L）。另一方面，当纳米颗粒浓度为0.05 wt%，pH值为7，温度为36.5°C，固体负荷为5%时，柠檬酸浓度非常低，仅为3.20 g/L。

图3a-c展示了RSM图表，显示了各种输入参数的相关效应及其对最终CA浓度的影响。图3a显示了温度（°C）和ZnO NP（wt%）的交互效应。随着ZnO NP浓度从0增加到0.03 wt%，同时温度从28.0°C增加到38.2°C，产生的CA浓度从9 g/L降低到5 g/L。而当ZnO NP浓度和过程温度同时从0.03 wt%增加到0.05 wt%，温度从28°C增加到45°C时，CA浓度从5.5 g/L略微增加到7.2 g/L。图3b显示了在保持温度和固体负荷不变的情况下，pH值和ZnO NP（wt%）对CA浓度的交互效应。当pH值从2增加到7，同时ZnO NP浓度从0增加到0.03 wt%时，CA浓度从13 g/L急剧下降到7 g/L。进一步增加ZnO NP浓度从0.03 wt%到0.05 wt%时，CA浓度从7 g/L增加到13 g/L。这种CA浓度的增加可以归因于ZnO NP的添加及其对柠檬酸生物加工的改善作用。已知像ZnO NP这样的金属氧化物纳米颗粒在低浓度/剂量下具有催化倾向，而在高剂量下可能表现出抗菌特性（Sanusi等人，2020年）。这些特性取决于它们的尺寸、形状和表面积。在生物化学过程中使用纳米颗粒作为补充剂或催化剂是改进生物化学过程的最新技术之一（Mweli等人，2026年）。在本研究中，评估了添加ZnO NP的营养培养基中A. brasiliensis细胞的生长和柠檬酸产量反应。

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三维响应面图，显示了温度（°C）和ZnO纳米颗粒浓度（%）、pH值和ZnO纳米颗粒浓度（%）、固体负荷（%）以及温度（°C）和pH值、pH值和固体负荷对柠檬酸浓度的交互效应

RSM模型的验证
通过在最佳条件下进行验证实验来确认柠檬酸浓度（表3）。对于纳米颗粒浓度、pH值、温度和固体负荷，预测的最佳条件分别为0.05 wt%、2.029、32.48°C和19.849%。根据这些设定点，模型预测柠檬酸浓度将达到17.80 g/L。与模型预测值相比，实验验证显示柠檬酸浓度略高，为19.85 g/L。这证明了所开发的RSM模型具有高准确性和精确性，以及其良好的预测潜力。添加ZnO NP后的优化发酵（19.85 g/L）使柠檬酸产量比对照实验（14.41 g/L）提高了38%。显然，最大柠檬酸浓度与本研究中实施的优化工艺条件有关，尤其是ZnO NP的添加和适宜的pH值。极端工艺条件（如温度超过50°C）已被报道会抑制酶活性和微生物生长（Sanusi等人，2020年）。酶在特定的温度和pH范围内表现最佳（Duan等人，2021年）。因此，对于酶功能不利的条件，如低温（<30°C）和高pH值（>3），可能会影响柠檬酸的初始产量。这可能会对SSF过程产生连锁效应，因为酶会失去活性并无法与底物上的活性位点结合（Laltha等人，2022年）。柠檬酸生物加工需要锌等微量营养素来促进A. brasiliensis的代谢活动，从而提高柠檬酸产量。图3c展示了固体负荷和ZnO NP浓度对柠檬酸产量的交互效应。当固体负荷从5%增加到20%，ZnO NP浓度从0.03 wt%增加到0.05 wt%时，CA浓度从3 g/L增加到12 g/L。同样，在图3d中，当温度从28°C增加到45°C，pH值从5降低到2时，CA浓度从7 g/L增加到13 g/L。CA浓度的增加可以归因于温度和pH值的协同效应。在这种情况下，温度和pH值的协同效应是反比的。先前的研究已经报道了温度和pH值输入参数对生物加工的明显影响（Sanusi等人，2020年；Walters等人，2024年）。通常，极端温度（>45°C）会通过细胞膜、蛋白质和酶的变性对生物加工效率产生不利影响，进而影响整个过程的性能。此外，极端温度（>50°C）被报道会完全抑制酶活性和微生物生长（Sanusi等人，2020年）。酶在特定的温度和pH范围内表现最佳（Duan等人，2021年）。图3E展示了pH值和固体负荷的交互效应。当固体负荷从5%增加到20%，同时pH值从5降低到2时，CA浓度从10 g/L增加到15 g/L；而如果pH值同时从5增加到7，则CA浓度没有进一步增加。图3F显示了固体负荷和温度的交互影响。当固体负荷从5%增加到20%，同时温度从38.2°C降低到28.0°C时，CA浓度从2 g/L增加到10 g/L。相反，如果温度从38.2°C增加到45.0°C，同时固体负荷从5%增加到20%，CA产量从2 g/L略微增加到12 g/L。固体负荷对过程的影响可能归因于发酵肉汤的摩尔浓度，这主要受溶解溶质量的影响。这影响了混合速率、传质效率和糖化效率，从而影响整个过程的性能。pH值是生物加工中的另一个重要参数。系统的pH值影响营养物质的吸收速率（Sanusi等人，2020年）。在极端pH值下，由于细胞质膜的净负电荷下降，营养物质的吸收受到负面影响。因此，当前模型中考虑了固体负荷和pH值的重要性。

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表3显示了优化条件下柠檬酸浓度的验证实验结果。对于纳米颗粒浓度、pH值、温度和固体负荷，预测的最佳条件分别为0.05 wt%、2.029、32.48°C和19.849%。基于这些设定点，模型预测柠檬酸浓度将达到17.80 g/L。与模型预测值相比，实验验证显示柠檬酸浓度略高，为19.85 g/L。这证明了所开发的RSM模型的高准确性和精确性，以及其良好的预测潜力。添加ZnO NP后的优化发酵（19.85 g/L）使柠檬酸产量比对照实验（14.41 g/L）提高了38%。显然，最大柠檬酸浓度与本研究中实施的优化工艺条件有关，尤其是ZnO NP的添加和适宜的pH值。极端工艺条件（如温度超过50°C）已被报道会抑制酶活性和微生物生长（Sanusi等人，2020年）。酶在特定的温度和pH范围内表现最佳（Duan等人，2021年）。因此，不利于酶功能的条件，如低温（<30°C）和高pH值（>3），可能会影响柠檬酸的初始产量。这可能会对SSF过程产生连锁效应，因为酶会失去活性并无法与底物上的活性位点结合（Laltha等人，2022年）。柠檬酸生物加工需要锌等微量营养素来促进A. brasiliensis在生物加工过程中的最佳代谢活动（Sanusi等人，2020年）。此外，本研究中ZnO NP的影响可能归因于氧化-还原效应，为柠檬酸生产提供了相对有利的生化环境。文献表明，较低的氧化-还原值有利于生物加工，如柠檬酸生产（Sanusi等人，2020年）。在指数阶段（>96小时）之后，柠檬酸浓度没有进一步增加，这可能是由于系统中底物和营养物质的浓度减少，因为它们已经被代谢掉了。

表3 优化柠檬酸生产模型的验证
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当前研究中添加ZnO NP的工艺获得的较高柠檬酸产量（0.21 g/L/h）相比对照实验（0.19 g/L/h）有11%的提高。此外，图4a显示了ZnO NP添加工艺和对照实验中A. brasiliensis的增殖情况，两者在增殖阶段似乎没有延迟。尽管A. brasiliensis的生长曲线相当，但ZnO NP添加工艺的A. brasiliensis生物量积累（1.54 g/L）高于对照实验（1.29 g/L）。同样，如上所述，ZnO纳米颗粒（NP）补充过程中A. brasiliensis生物量浓度的提高可以归因于ZnO NP对A. brasiliensis生长和繁殖的影响（因为微生物活动在细胞代谢过程中依赖于金属营养素如锌）。Mweli等人（2026年）认为，纳米颗粒确保了由于纳米颗粒腐蚀而产生的必需离子的分布，从而在发酵过程中维持了离子的持续供应。图4显示了在CA生物加工过程中，与对照组相比，A. brasiliensis在ZnO NP存在下的生长情况，以及在不同时间点下的柠檬酸产生情况。此外，使用ZnO NP和土豆皮废弃物作为底物的实验结果与文献中的CA生产数据进行了比较。例如，本研究的CA生产值（19.85 g/L）与Aboyeji等人（2020年）（4.36 g/L）和Laltha等人（2022年）（使用A. niger和A. brasiliensis发酵甜薯皮废弃物和香蕉假茎）报告的值相当。同样，与本研究相比，Zafar等人（2021年）使用橙皮作为底物，并共培养A. niger和A. fumigatus，在最佳发酵条件（pH 6、温度50°C、接种量6 mL、发酵期6天）下报告的CA浓度为0.115 g/L。Zafar等人（2020年）使用Rhizopus stolonifera和A. niger进行固态发酵后，经过工艺优化（温度30°C、pH 5.5、底物浓度25 g橙皮）后，CA生产量为0.0077 g/L。与本研究相比，观察到的CA产量较低。当前研究与以往研究之间的差异可能归因于所实施的不同工艺条件，包括：真菌种类、接种量、温度、搅拌、pH值、酶浓度、纳米颗粒的添加、氮源、固体装载量、吸附剂类型和浓度等。尽管先前报告中的CA浓度相当，但本研究使用ZnO NP纳米生物催化剂和廉价底物来获得高CA产量的方法具有工业化的潜力，这使得该发酵方法具有吸引力。这些发现有助于实施基于废弃物的CA生物加工，从而实现废物、能源和环境的可持续性，以改善废物管理和价值化。

**动力学评估**
图4A显示了A. brasiliensis的生长动力学，展示了添加和未添加氧化锌纳米颗粒（控制组）时其生长模式随时间的变化。与对照组相比，添加ZnO的实验没有明显的滞后期（少于24小时），而对照组的滞后期为40小时。ZnO NP下柠檬酸生产的短滞后期表明，A. brasiliensis适应培养基所需的时间较短，并且在SSF过程中产生了足够的葡萄糖。虽然分生孢子萌发的滞后期可能持续数小时，但不理想的条件和压力因素可能会将这一时间延长至数天，这可以解释在没有ZnO NP的实验中观察到的较长滞后期（Hamill等人，2020年）。显然，添加纳米颗粒的实验中观察到的较短滞后期可以归因于ZnO NP的存在。像锌这样的金属用于细胞结构材料，在防止细胞死亡以及提高细胞抵御压力的能力方面起着关键作用。之后，添加ZnO NP的A. brasiliensis生长呈指数增长直至48小时，然后略有平稳，随后继续增长至96小时。另一方面，在没有ZnO NP的对照组实验中，A. brasiliensis的生长在40小时后呈指数增长，并持续增长至72小时。此外，A. brasiliensis的生长数据符合Richard函数回归，相关系数（R2）较高。添加ZnO NP时的最大特定生长速率（μmax）为0.16 h?1，是对照组（0.06 h?1）的2.67倍。考虑到μmax作为动力学生长参数的重要性，它对产品产量和生产力有显著影响，因此添加ZnO NP的实验中获得的高μmax是理想的（Sanusi等人，2020年）。同样，添加ZnO NP时的最大A. brasiliensis生物量浓度（Xmax）为1.14 g/L，而对照组为1.12 g/L。μmax和Xmax的差异可以归因于ZnO NP的存在与否，这进一步强调了ZnO NP对A. brasiliensis代谢活动的积极影响，从而增强了CA生物加工。ZnO用于细胞结构材料，促进细胞内的ATP合成，有助于物质的吸收和定向输送到生长因子的合成，从而改善细胞适应性，缩短滞后期，提高代谢活动，进而提高整个过程的生产力。此外，它还可以提供适宜的生化条件，提高发酵过程中金属离子的生物利用度，有利于细胞生长和活动，这不可避免地影响细胞和酶的功能及生产力（Sanusi等人，2021年；Ndaba等人，2025年；Sivagurunathan等人，2026年）。

**柠檬酸生产动力学**
图4B显示了SSF过程中柠檬酸产量随时间的变化。添加ZnO NP的实验中，从0小时到96小时的CA生产率高于对照组从0小时到48小时的产量。添加ZnO NP的实验中观察到的最高CA浓度为19.85 g/L，而对照组为14.41 g/L。最大CA浓度与A. brasiliensis生长的峰值相吻合，表明CA产量尤其在细胞指数生长阶段较高（Laltha等人，2022年）。在指数生长阶段，除了ZnO NP提供的Zn离子等最佳条件外，还有足够的底物来维持A. brasiliensis的代谢、生长和高产量的柠檬酸生产。因此，如本研究添加ZnO NP的实验所获得的较高生长速率（第3.5.1节）对于高CA产量非常重要（Sanusi等人，2020年；Adeoye和Lateef，2022年）。此外，柠檬酸生产的实验数据符合改进的Gompertz模型，R2值＞0.70（表4）。最大柠檬酸生产速率（rp.m）分别为每小时1.680 g/L和2.771 g/L。添加ZnO NP的实验中观察到的滞后期（tL）为2.39小时，而对照组为1.54小时，表明A. brasiliensis需要更长时间来适应含有ZnO NP的发酵培养基。使用ZnO NP的接种可以促进细胞活动，提高生长速率，从而降低滞后期并获得较高的柠檬酸生产速率（rp.m）。尽管rp.m较低且tL较长，但添加ZnO NP的SSF过程的Pm为15.0 g/L，而对照组为14.0 g/L。这表明添加ZnO NP主要有利于柠檬酸的生产，但产量较低，这可能是由于锌等微量元素在CA生产中的重要性（Mweli等人，2026年）。在发酵介质中使用纳米生物催化剂可能是提高柠檬酸产量的新方法。

**ZnO NP的触发机制**
可能促进CA产量提高的触发机制包括：（1）调节pH值，以有利于A. brasiliensis吸收对其代谢和生长至关重要的营养素如锌；（2）降低氧化还原电位（ORP），提供适宜的生长环境。适宜的生长条件可以促进蛋白质/酶活性的增加，以及ZnO NP与代谢中间体的结合，从而提高生产力（Mweli等人，2026年）。ZnO NP释放到发酵介质中，产生多种调节作用。基本上，ZnO NP在生长介质中的影响可以归纳为以下步骤：（1）由于ZnO NP的尺寸及其释放的Zn2?离子（来自ZnO NP的方程式（6））渗透并整合到细胞膜中，调节细胞内部pH值和介质的pH值，从而提高营养物质的吸收；（2）ZnO NP使生长介质的ORP降低，为A. brasiliensis的繁殖提供适宜的生长微环境；（3）随着ZnO NP持续释放Zn2?离子以及纳米颗粒的大表面积与体积比，确保与A. brasiliensis、酶和底物的稳定相互作用，从而提高代谢活动，进而提高生产力。Zn2?离子可以在各种生化氧化还原反应中直接作为电子供体（因为Zn2?离子是从ZnO NP中释放的（方程式（6））。可以说，ZnO NP（或Zn2?离子）的吸收与A. brasiliensis的代谢活动密切相关，这会影响pH值、ORP和生化氧化还原反应。稳定的pH值（纳米缓冲能力的潜在结果）有助于A. brasiliensis维持理想的生理状态，从而提高代谢和酶活性，有利于高CA产量。高CA产量在很大程度上依赖于高细胞增殖，这是由于代谢活动的增强（如在含有ZnO NP的介质中观察到的）。此外，采用当前的柠檬酸生产策略获得了较高的特定生长速率（HSGR），HSGR有利于高CA产量，因为它是初级代谢物生物加工的主要驱动力（Mweli等人，2026年）。据报道，改进的特定生长速率有可能触发呼吸发酵细胞活动，从而提高发酵生产力。因此，适宜的营养组成或生长介质应包含所需的微量营养素，如锌纳米颗粒，这些颗粒已被证明可以增强细胞代谢活动，从而提高代谢活性，进而提高CA产量（Sanusi等人，2020年）。

**结论**
本研究通过同时进行糖化和发酵过程，优化了从预处理过的土豆皮废弃物中生产柠檬酸的过程。在最佳工艺条件下（ZnO NP浓度-0.05 wt%，固体装载量-19.85%，温度-32.5°C，pH-2.03），获得了最大柠檬酸浓度19.85 g/L，比对照组（14.41 g/L）提高了1.38倍。添加ZnO NP的实验中获得的最大特定生长速率（μmax）为0.61 h?1，最大柠檬酸浓度（Pm）为15.00 g/L，而没有ZnO NP的实验中分别为0.06 h?1和14.41 g/L。这些发现表明，在柠檬酸生物加工中添加ZnO NP可以显著提高产量和生产力，从而实现从废弃土豆皮中工业生产CA的目标。