罗萨·罗克斯伯格（Rosa roxburghii Tratt）的提取物通过肠道微生物群-氨基酸代谢及JAK2/STAT3通路抑制机制缓解小鼠的肺纤维化症状

《Food Science & Nutrition》：The Extract of Rosa roxburghii Tratt Alleviates Pulmonary Fibrosis in Mice via Gut Microbiota-Amino Acid Metabolism and JAK2/STAT3 Inhibition

　　**摘要**

肺纤维化（PF）是一种不可逆的慢性肺病，其特征是组织修复的紊乱导致细胞外基质（ECM）过度沉积。Rosa roxburghii Tratt（RRT）具有抗炎和抗氧化作用，显示出减轻器官纤维化的潜力。在本研究中，我们评估了RRT不同极性提取物（RRTEs）的生物活性成分和抗氧化能力，并探讨了最佳提取物在缓解PF方面的多靶点机制。RRT的乙酸乙酯提取物（EAE）表现出最高的生物活性成分和最强的抗氧化能力。EAE干预改变了PF小鼠的肠道微生物群组成，增加了有益细菌的数量并减少了病原菌的种类。代谢组学分析发现了11个与PF相关的潜在血清生物标志物，这些标志物参与了7条代谢途径。值得注意的是，EAE通过调节血清素来缓解L-色氨酸代谢的紊乱。此外，EAE还通过JAK2/STAT3途径抑制上皮-间充质转化（EMT）和炎症细胞因子的生成。总之，EAE的抗PF作用可能与肠道微生物群的结构、氨基酸代谢紊乱（尤其是色氨酸代谢）的纠正以及肺部的JAK2/STAT3信号通路的调节有关。这些发现为EAE对抗PF的治疗潜力提供了新的见解。

**缩写**

5-HT：5-羟色胺
AE：Rosa roxburghii Tratt的乙醇提取物
BLM：博莱霉素
EAE：Rosa roxburghii Tratt的乙酸乙酯提取物
ECM：细胞外基质
EMT：上皮-间充质转化
LEfSe：线性判别分析效应量
ME：Rosa roxburghii Tratt的甲醇提取物
PF：肺纤维化
RRT：Rosa roxburghii Tratt
RRTEs：Rosa roxburghii Tratt的不同极性提取物
WE：Rosa roxburghii Tratt的水提取物
WPE：乙酸乙酯提取后剩余的水相提取物

**1 引言**

肺纤维化（PF）是一种慢性、进行性的肺病，其特征是肺部损伤和瘢痕组织的形成，伴随着全身性的代谢紊乱（Callaghan和Davenport Huyer 2025；Liu等人2022）。PF的风险因素包括吸烟、辐射暴露、遗传因素、烟雾环境以及感染（Suri等人2021）。此外，PF已成为SARS和COVID最严重的后遗症之一。PF患者的诊断后中位生存期为3-5年（Roque和Romero 2021），临床症状包括咳嗽、呼吸急促和呼吸困难。这些症状对患者的生活质量和寿命有显著的负面影响。目前，尼达尼布和吡非尼酮是主要用于治疗PF的临床药物；然而，这些药物只能减缓病情的发展，并伴有呕吐和胃肠道不适等不良副作用（Dempsey等人2019；Liu等人2022）。因此，迫切需要安全有效的新型抗纤维化疗法。最近，越来越多的研究关注天然产物在PF治疗中的应用。具有抗炎和抗氧化特性的天然产物被视为预防和治疗PF的潜在替代来源（Chen等人2018；Hasan等人2022）。Rosa roxburghii Tratt（RRT）因其高营养价值和健康益处而受到消费者的青睐，并在中国西南部广泛种植（He等人2016；Wang等人2023）。植物化学研究表明，RRT富含维生素、氨基酸、有机酸、多酚、黄酮类化合物、三萜类物质和其他营养成分，其营养价值远高于其他常见水果，如石榴和蓝莓（Yang等人2020）。作为一种高质量的食品和药材，RRT具有出色的生物活性，如抗炎、抗氧化、抗动脉粥样硬化、抗癌以及调节疾病中的代谢紊乱（Chen, Zhang等人2024；Chen, Zhao等人2024；Wang等人2021）。先前的研究表明，RRT中的多酚可以抑制炎症并缓解脂多糖诱导的急性肺损伤（Tang等人2023）。此外，Rosa roxburghii的发酵液可能通过改善肠道紊乱来缓解肺纤维化（Zhou等人2025）。然而，发酵产物含有复杂的植物化合物和微生物代谢物混合物，难以将疗效归因于特定的植物化学物质。此外，RRT对PF小鼠代谢紊乱的调节作用及其饮食治疗特性尚未阐明。因此，本研究旨在通过生物活性导向的分离方法确定具有最高抗氧化能力和生物活性成分的提取物，并研究其在改善疾病代谢中的作用机制。鉴于RRT应用方式的局限性以及不同溶剂和提取方法会对提取物中的活性成分及其含量产生影响，从而产生不同的生物学效应，我们使用了四种不同极性的溶剂提取RRT。然后，我们筛选了具有最佳理化性质的RRT提取物，并基于肠道微生物群和血清代谢组学研究了其抗PF效果和作用机制。本研究为RRT提取的优化及其在PF预防和治疗中的应用提供了理论指导。

**2 材料与方法**

**2.1 RRT提取物的制备**

RRT在中国贵州省安顺市种植。RRT经过清洗、切片、冻干后研磨成细粉。该粉末使用超声、甲醇和水（1:2, m/v）提取两次，每次1小时。收集滤液，通过旋转蒸发浓缩后冻干，得到甲醇提取物（ME）、乙醇提取物（AE）和水提取物（WE）。随后使用乙酸乙酯处理WE（2:1, v/v），进一步干燥，得到两种不同的提取物组分：乙酸乙酯提取物组分（EAE）和水相提取物组分（WPE）。这些提取物再次浓缩后冻干，得到相应的粉末。不同极性的RRT提取物（RRTEs）保存在-80°C备用。

**2.2 提取物组成分析**

**2.2.1 样品制备**：将RRTEs分别用甲醇提取至0.1 mg/mL的浓度，进行超声处理后过滤到HPLC使用的液体相小瓶中（仪器：Q-Exactive Orbitrap MS，Thermo Fisher，德国）。液体色谱条件：柱温40°C；流速0.3 mL/min；流动相A为0.1%甲酸水溶液；流动相B为乙腈。梯度设置如下：0分钟时95% A；0.5分钟时95% A；3分钟时80% A；6分钟时50% A；8分钟时30% A；8.5分钟时10% A；10分钟时10% A；10.1分钟时95% A。质谱分析采用电喷雾离子化（ESI）方式，检测模式为full-ddMS2。参数如下：正离子喷射电压3.5 kV；负离子喷射电压2.5 kV；鞘气50 Arb；辅助气15 Arb；扫描气2 Arb；离子传输管温度320°C；蒸发器温度350°C。

**2.2.2 总多酚、黄酮类和三萜类的测定**

总多酚、黄酮类和三萜类的测定采用先前描述的方法，并进行了轻微修改（He等人2016；Qneibi等人2021）。总多酚含量使用Forintol法测定，以没食子酸（上海Yuanye生物技术有限公司）作为标准物质，在765 nm处测量吸光度。总黄酮类含量使用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法测定，以芦丁（上海Yuanye生物技术有限公司）作为标准物质，在510 nm处测量吸光度。总三萜类含量使用乌索酸（上海Yuanye生物技术有限公司）作为标准物质，在548 nm处测量吸光度。

**2.2.3 抗氧化能力的测定**

RRTEs的抗氧化能力通过测定DPPH和ABTS自由基清除能力来评估，方法参考了先前的研究（Wang等人2022）。

**2.3 动物实验**

所有动物实验均符合美国国立卫生研究院（NIH）的指导方针，并获得了四川大学第四西部医院和西部公共卫生学院伦理委员会的批准[许可证编号：Gwll2022105]。实验所用C57BL/6雄性小鼠（7-8周龄）购自北京Vital River实验室动物技术有限公司（北京），并在SPF环境中饲养。适应一周后，将小鼠随机分为对照组、模型组、EAE组和阴性对照组（n=10）。对照组和阴性对照组的小鼠通过气管注射生理盐水，其余两组的小鼠通过气管注射2 mg/kg的博莱霉素（BLM）以诱导PF。注射后一天，EAE组和阴性对照组小鼠分别接受400 mg/kg的EAE，对照组和模型组则接受等量的生理盐水。在取出小鼠眼球后的21天，对小鼠进行安乐死以收集血液。每个肺叶的上端用组织固定剂固定，其余肺组织在液氮中速冻后保存在-80°C。

**2.4 组织病理学分析**

固定后的肺组织包埋在石蜡中并切片后，通过苏木精-伊红染色（H&E）和Masson染色（Biossci生物技术有限公司）评估肺组织的病理变化。免疫组化（Biossci生物技术有限公司）用于观察I型胶原、α-SMA和E-钙粘蛋白的表达。

**2.5 肠道微生物群分析**

收集小鼠粪便，并由苏州PANOMIX生物医学技术有限公司（成都）进行分析。选择适当的总DNA提取方法，并使用Nanodrop进行DNA定量。对目标片段进行扩增和纯化，然后对PCR扩增产物进行荧光定量。使用Illumina TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit准备测序文库。在文库质量检测后进行高通量测序。根据索引和条形码信息对文库和样本进行分组，并移除条形码序列。根据QIIME2 Dada2分析过程或VSearch软件分析过程进行序列去噪或OTU聚类。进一步根据ASV/OUT进行组间差异分析。

**2.6 血清代谢组学**

血清样本用甲醇-乙腈预处理后，使用UHPLC（1290 Infinity LC，Agilent Technologies）与四极杆飞行时间质谱仪（AB Sciex TripleTOF 6600）联用进行分析。样品使用2.1 mm × 100 mm ACQUIY UPLC BEH Amide 1.7 μm柱（Waters，爱尔兰）进行检测。在ESI正负模式下，流动相包含25 mM醋酸铵和25 mM氢氧化铵的水和乙腈混合物。梯度设置为：0分钟时95% B；0.5分钟时95% A；3分钟时80% A；6分钟时50% A；8分钟时30% A；8.5分钟时10% A；10分钟时10% A；10.1分钟时95% A。ESI源条件如下：离子源气体1为60；离子源气体2为60；帘气为30；源温度为600°C；IonSpray Voltage Floating为±5500 V。原始MS数据使用ProteoWizard MSConvert转换为MzXML文件，然后导入免费的XCMS软件中。

**2.7 定量实时PCR（qPCR）**

使用RNA提取试剂盒（成都Foregene有限公司）提取组织中的总RNA，并使用逆转录试剂盒（ABclonal Technology有限公司，武汉）生成cDNA。根据制造商的指示，使用Taq Pro Universal SYBR qPCR Mix Kit（Vazyme Biotech有限公司，南京）进行实时荧光定量PCR。使用2^-??CT公式分析基因表达相对于GAPDH的表达。引物由Sangon Biotech（上海）合成，具体信息见表S1。

**2.8 西盟斑点 blot（Western Blot）**

组织使用放射免疫沉淀法（RIPA，Beyotime，中国）裂解，并以牛血清白蛋白（BSA）作为标准进行定量。经过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离后，蛋白质转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。这些蛋白质膜在室温下用5%脱脂牛奶封闭1小时，然后在4°C下与不同稀释比例的一抗孵育过夜。经过三次含有 tween 的Tris 缓冲液（TBST）洗涤后，与二抗孵育1小时。最后，使用增强化学发光（ECL）试剂盒检测蛋白质，并使用ImageJ进行定量。

**2.9 统计分析**

结果以至少三次独立实验的“平均值 ± 标准差”表示。统计分析和绘图使用Excel、ImageJ和GraphPad Prism 9进行。单因素方差分析（ONE-WAY ANOVA）和t检验用于分析组间差异。不同的小写字母表示组间存在显著差异（p<0.05），其中*表示与对照组的比较，#表示与模型组的比较：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，#p<0.05，##p<0.01，###p<0.001。

3 结果

3.1 RRTE成分的抗氧化能力分析

3.1.1 RRTE的定性分析

使用HPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS检测RRTE的可能成分，离子流图显示在图1A和B中。在表S2中列出的实验条件下，共检测到41个成分。生物活性物质包括10种多酚、8种黄酮类、9种有机酸、6种苷类、4种氨基酸、2种三萜类、1种多糖和1种生物碱。通过比较各成分的峰值面积，发现EAE中的大多数生物活性物质（如原花青素、rosamultin和表没食子儿茶素）的含量高于其他四种提取物。这表明EAE可能保留了更多的RRT生物活性成分。

3.1.2 RRTE的生物活性物质和抗氧化能力

多酚、黄酮类和三萜类是RRT的重要组成部分。因此，通过比色法测定了RRT不同极性提取物中的总多酚、黄酮类和三萜类的含量。如图1C–E所示，ME、WE、EAE、WPE和AE中的总多酚含量分别为137.16±0.86、132.96±13.30、227.56±0.80、105.76±0.49和119.63±0.20 μg/mg；总黄酮类含量分别为363.91±1.82、344.82±0.91、759.97±2.92、143.61±6.19和303.33±2.62 μg/mg；总三萜类含量分别为123.73±6.51、106.44±3.60、102.39±6.95、211.29±4.92和69.78±2.24 μg/mg。EAE中的总多酚、黄酮类和三萜类含量显著高于WE、WE、WPE和AE（p<0.05）。因此，活性物质中的总多酚、黄酮类和三萜类含量最高的是EAE，这表明EAE能够富集更多的生物活性物质。植物优良的抗氧化能力在防御疾病中起着重要作用。因此，我们使用DPPH和ABTS自由基清除实验评估了五种RRTE的抗氧化能力。与其他提取物相比，EAE对DPPH和ABTS自由基的清除能力更强，EC50值最低（表1）。EAE对ABTS自由基的EC50值为55.98±0.60 μg/mL，显著低于其他提取物（p<0.05）。这些结果表明EAE可能具有健康保护作用。因此，我们研究了EAE在缓解小鼠BLM诱导的肺炎（PF）中的作用。

3.2 EAE缓解小鼠BLM诱导的肺炎

使用BLM诱导的小鼠肺炎模型来研究EAE的效果。如图2B所示，对照组小鼠的体重在实验期间持续增加，而模型组小鼠的体重持续下降，并与对照组存在显著差异。EAE干预能够减缓BLM诱导的小鼠体重下降。此外，H&E染色（图2C）显示模型组肺组织中有显著的炎症细胞浸润、肺泡壁增厚、肺泡腔缩小和纤维化团块的形成，表明肺炎模型建立成功。Masson三色染色（图2D）还显示EAE减少了肺组织中的胶原沉积。另外，NC组小鼠的体重和肺组织结构特征与对照组一致，间接表明EAE对小鼠没有不良影响。

3.3 EAE可能调节患有肺炎的小鼠的肠道微生物群紊乱

为了进一步探讨RRT是否参与调节患有肺炎的小鼠的肠道微生物群，我们进行了16S rRNA扩增子测序。使用Chao1、Simpson和Shannon指数评估肠道微生物群的α多样性。结果显示组间肠道微生物群多样性没有显著差异（图3A）。然后我们使用主坐标分析（PCoA）和非测量多维缩放（NMDS）计算样本间肠道微生物群的结构差异，并评估其β多样性。如图3B、C所示，模型组的样本明显与对照组分开，EAE组的样本点也与模型组分开，并更接近对照组。应力值越小越好。当NMDS的应力值小于0.2时，分析结果更可靠。本实验中NMDS的应力值为0.134，表明数据较为严谨。基于上述结果，EAE可能调节由BLM诱导的肺炎引起的肠道细菌紊乱。

3.4 EAE对血清代谢的影响

为了阐明EAE缓解肺炎的代谢途径，我们使用LC–MS对血清样本进行了代谢组学分析。通过正负离子模式和质量控制（QC）对每组的血清样本进行了主成分分析（PCA）。如图4A、B所示，PCA图中的QC样本点（用三角形符号表示）在正负离子模式下紧密聚集，表明质量控制良好且仪器稳定。然后我们使用正交偏最小二乘-判别分析（OPLS-DA）确定模型组和对照组之间的代谢物差异（图4C、D）。两组间有显著分离，组内聚集反映了组间差异。

3.5 EAE对血清代谢的影响

为了阐明EAE对血清代谢的影响，我们对血清样本进行了代谢组学分析。使用正负离子模式的主成分分析（PCA）和对质量控制（QC）进行分析。如图4A、B所示，QC样本点在正负离子模式下紧密聚集，表明质量控制良好且仪器稳定。然后我们使用正交偏最小二乘-判别分析（OPLS-DA）确定模型组和对照组之间的代谢物差异（图4C、D）。两组间有显著分离，组内聚集反映了组间差异。图5：在图示查看器或PowerPoint中打开

关键生物标志物与肠道微生物群之间的Spearman相关性分析。*p < 0.05；**p < 0.01；***p < 0.001。

3.6 EAE通过抑制炎症、JAK2/STAT3信号通路和EMT来缓解肺纤维化（PF）

3.6.1 EAE调节BLM诱导的促炎细胞因子

炎症是PF发展中的关键因素。细胞因子（如IL-6、IL-1β、IL-10和TNF-α）的表达增加与更严重的纤维化过程相关（Savin等人，2022年）。因此，我们使用qPCR检测了每组肺组织中IL-6、IL-1β、IL-10和TNF-α的mRNA转录水平（图6A）。与对照组相比，模型组中IL-6、IL-1β、IL-10和TNF-α的mRNA水平升高。我们发现EAE干预后这些水平下降，并且IL-6、IL-10和TNF-α的表达水平下降具有显著差异。这些数据表明EAE具有抑制促炎细胞因子产生的潜力。

图6：在图示查看器或PowerPoint中打开

EAE通过抑制炎症、JAK2/STAT3信号通路和EMT来缓解PF。 (A) IL-6、IL-1β、IL-10和TNF-α的相对mRNA表达；(B) 通过Western blot检测JAK2、STAT3和p-STAT3的蛋白水平；(C) 与GAPDH相比的相对蛋白表达水平；(D) 通过qPCR检测E-钙粘蛋白、Vimentin和Collagen I的mRNA表达；(E–G) 通过IHC观察肺组织中E-钙粘蛋白、α-SMA和Collagen I的表达，并对阳性率进行统计分析。数据以平均值±标准差表示。*p < 0.05；**p < 0.01；***p < 0.001（与对照组相比）；#p < 0.05；##p < 0.01；###p < 0.001（与模型组相比）。

3.6.2 EAE抑制JAK2/STAT3信号通路

由于JAK2/STAT3信号通路的异常激活与器官纤维化过程中的促炎细胞因子释放和胶原蛋白合成密切相关（Ruan等人，2021年），我们检测了纤维化肺组织中JAK2/STAT3信号通路蛋白的表达。如图6B、C所示，BLM处理的小鼠肺组织中JAK2和p-STAT3/STAT3蛋白的表达水平升高。相比之下，EAE降低了JAK2和p-STAT3/STAT3蛋白的表达。这些结果表明，EAE的抗炎作用可能归因于对JAK2/STAT3信号通路的调节。

3.6.3 EAE抑制BLM诱导的EMT

使用qPCR和免疫组化（IHC）评估了EAE对PF小鼠的影响。qPCR结果显示，EAE显著促进了vimentin和Collagen I在mRNA水平的下调，并上调了E-钙粘蛋白（图6D）。IHC实验（图6E–G）得到了类似的结果。EAE的给予降低了间充质蛋白标记物α-SMA和Collagen I的表达，并上调了上皮细胞蛋白标记物E-钙粘蛋白的表达，α-SMA和Collagen I水平的变化具有统计学意义。这些结果表明，EAE可能通过抑制EMT来缓解小鼠中的BLM诱导的PF。

4. 讨论

肺纤维化是一种无法治愈的疾病，其特征是自发的纤维化、间质外沉积以及肺功能逐渐下降（Liu等人，2022年）。鉴于PF的多样化和复杂的发病机制，天然产物因其多组分和多靶点特性而被广泛认为是预防PF的潜在药物（Hasan等人，2022年）。众所周知，RRT是一种富含营养素和抗氧化剂的水果，具有多种健康益处。与之前关于Rosa roxburghii发酵液抗肺纤维化作用的研究（Zhou等人，2025年）相比，本研究使用不同的溶剂提取RRT，旨在鉴定最活跃的化学成分，并整合肠道微生物群和代谢组学变化的分析，以探索其在缓解肺纤维化中的分子机制。由于RRT成分复杂多样，我们选择了四种极性不同的溶剂来提取其生物活性物质。由于乙酸乙酯的极性较低，不适合超声提取，因此采用了另一种提取方法。在本研究中，我们发现使用EAE提取的RRTEs中的总多酚、黄酮类和三萜类化合物含量高于其他四种提取方法，这表明使用低极性的乙酸乙酯可以获得更高的产率。此外，该方法可以去除更多没有直接作用的成分（例如纤维素）。为了准确鉴定和量化EAE富集的主要活性化合物，我们使用了标准化物质进行比较。生物活性化合物及其含量与其抗氧化特性密切相关。在我们的研究中，与其他四种提取方法相比，EAE具有最强的DPPH和ABTS自由基清除能力，这与其最高的生物活性化合物含量相对应。EAE的强抗氧化活性可能归因于其富含活性成分，这些成分可以为自由基提供氢原子，从而将其转化为稳定的酚类自由基，进而抑制过氧化链反应。这些结果表明EAE可能具有更好的健康益处，因此选择这种方法进行后续实验。越来越多的证据表明，肠道微生物群与肺部疾病密切相关，可能成为PF发病和进展的新生物标志物（Schuijt等人，2016年）。鉴于RRT是整个消化道中肠道微生物利用的食物资源，我们假设RRT可能通过调节肠道微生物组来影响宿主的代谢功能。因此，我们进一步阐明了EAE干预后PF小鼠模型中肠道微生物组的变化。我们发现BLM不仅对肺部有损害作用，还改变了肠道微生物群的组成。模型组中有害细菌（如Ruminococcus、Oscillospira和Bacterioides）的相对丰度增加。研究表明，这些细菌与炎症性疾病相关，在炎症性肠病中更为丰富（Henke等人，2021年；Liu等人，2020年）。EAE的干预抑制了BLM引起的各种病原菌的丰度增加，并减少了细菌对组织的炎症损伤。EAE还增加了有益细菌（包括Lactobacillus、Allobaculum、Prevotella和Akkermansia）的丰度，改善了肠道菌群的组成结构。其中，Lactobacillus已知能产生细菌素，对抗多种病原体（Prabhurajeshwar和Chandrakanth，2017年；Zuo等人，2022年），从而通过减轻氧化应激和肺部炎症反应来保护肺部（Zhang等人，2022年）。此外，Prevotella和Adlercreutzia被认为是产生短链脂肪酸（SCFA）的细菌，可通过缓解炎症过程发挥系统健康益处。值得注意的是，Verrucomicrobia及其属Akkermansia在EAE处理组中占主导地位。Akkermansia越来越多地被认为是下一代益生菌，因为它在增强宿主代谢功能和免疫稳态方面发挥作用。越来越多的证据表明，Akkermansia可以减弱促炎细胞因子（如TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-33），保护肠和肠系膜淋巴结，并通过消耗硫化物来减少硫化物相关病原菌的毒性（Zheng等人，2023年），同时增加其他有益细菌的丰度（Pei等人，2023年）。重要的是，Akkermansia已被证明可以改善由炎症激活引起的慢性肾间质纤维化以及肝纤维化（Pei等人，2023年；Raftar等人，2021年），表明其在多个器官中具有广泛的保护作用。在本研究中，EAE干预促进了PF小鼠肠道中Akkermansia的相对丰度增加。这表明EAE可能通过增加Akkermansia的相对丰度，在宿主体内发挥积极的保护作用。肠道微生物群是宿主代谢的主要调节者。饮食和宿主健康影响肠道微生物群，而肠道微生物群的组成又调节宿主健康。这是通过它们的营养代谢、抗感染和免疫信号传导能力实现的（Wu等人，2021年）。基于EAE可以改善PF小鼠的肠道微生物群的发现，我们使用代谢组学研究了血清代谢的变化。我们发现BLM处理后小鼠中有113种代谢物发生改变，严重影响了它们的正常代谢谱。为了更深入地探讨失衡的代谢途径，我们对选定的潜在生物标志物L-谷氨酸、N-甲基组氨酸、L-组氨酸、肌肽、L-谷氨酰胺、丙酮酸、肌醇、D-葡萄糖醛酸、L-色氨酸、5-HT、甲酰安息香酸、(S)-苹果酸（主要参与组氨酸代谢）、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢、磷酸盐和磷酸盐代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、抗坏血酸和醛酸代谢、色氨酸代谢、丙酮酸代谢进行了MetPA分析。这些代谢途径在PF发展过程中发生改变，结合ROC分析，可以指示它们在疾病进展中的关键作用，并可作为临床诊断和治疗的标志物。然而，我们注意到PF期间主要涉及的代谢途径是氨基酸代谢。许多研究表明，肺纤维化（PF）患者的氨基酸代谢严重失调，常见组氨酸、脯氨酸和谷氨酸水平升高（Bargagli等人，2020年；Qiu等人，2022年）。与这些观察结果一致，我们的代谢组学分析显示BLM诱导的PF小鼠中氨基酸代谢发生显著改变。具体来说，我们观察到L-组氨酸水平升高，而肌肽和谷氨酰胺水平降低，表明组氨酸和谷氨酸代谢网络受到影响。L-组氨酸参与多种生物过程，包括质子缓冲、活性氧清除和红细胞生成（Holecek，2020年）。代谢上，组氨酸是尿苷酸的前体，随后转化为谷氨酰胺，后者可以进一步转化为抗氧化剂谷胱甘肽。谷氨酰胺还通过谷氨酰胺酶转化为谷氨酸，这是肺成纤维细胞胶原蛋白合成的关键步骤（Hamanaka等人，2019年）。在本研究中，EAE干预与PF小鼠中L-组氨酸和谷氨酰胺水平的正常化趋势相关，部分逆转了BLM引起的代谢紊乱。尽管这些变化未达到统计学显著性，但观察到的向对照水平的转变表明EAE可能部分恢复了组氨酸-谷氨酰胺代谢轴的稳态，从而可能对其抗纤维化作用有贡献。更重要的是，我们的结果显示EAE调节了代谢物5-HT和L-色氨酸，这些代谢物参与色氨酸代谢途径，5-HT的表达有显著差异。我们的发现与之前的研究一致，即在PF小鼠中，随着肺纤维化的程度加重，色氨酸的积累增加（Seo等人，2019年）。具体来说，5-HT可能促进PF中的促炎细胞因子（如TNF-α和IL-6等）的产生，并通过炎症过程影响纤维化结果（Redensek Trampuz等人，2024年）。相反，5-甲氧基色氨酸（5-MTP）是5-HT的甲基化产物（Anderson和Eighmie，2018年；Wu等人，2020年），是一种内在的抗炎分子（Wu等人，2020年），通过控制多步纤维母细胞改变、转录重编程和信号通路来发挥抗PF作用（Wu，2021年）。因此，PF小鼠中L-色氨酸和5-HT水平的升高可能与色氨酸代谢受损有关。我们的EAE干预逆转了BLM引起的5-HT和L-色氨酸水平，表明EAE干预可能调节色氨酸代谢途径和5-HT。最近的研究揭示了人类肠道微生物群与宿主和疾病进展的多个生理方面之间的密切联系。在现代医学中，肺部和肠道通过淋巴或血液循环相互联系（Dang和Marsland，2019年；Ma等人，2021年）。肺部和肠道之间的相互作用可以通过循环炎症细胞、介质和代谢物（如氨基酸；Ma等人，2021年）发生。研究表明，肠道微生物群可以合成必需氨基酸，促进氨基酸代谢并维持氨基酸稳态（Lin等人，2017年）。例如，Clostridium属细菌（可以利用赖氨酸或脯氨酸）是氨基酸发酵的关键驱动因素，而Streptococcus属细菌则是谷氨酸或色氨酸利用的关键驱动因素。然而，其他一些细菌群也在氨基酸代谢中发挥重要作用，如Fusobacterium、Bacterioides和Veillonella属细菌，以及Megasphaera elsdenii和Selenomonas ruminantium（Dai等人，2011年）。对肺部损伤动物中差异肠道微生物群的预测功能分析表明，肠道微生物群的失衡可能导致介导肠-肺轴的氨基酸代谢（Lu等人，2024年）。在本研究中，我们发现5-HT（一种色氨酸代谢物）与Oscillospira和Bacterioides及其他细菌的相对丰度呈正相关。5-HT的合成和代谢受肠道微生物群的调节（Potter等人，2024年）。确实，研究发现Oscillospira和Bacterioides的相对丰度高与5-HT水平高相关（Mujagic等人，2022年）。在本研究中，我们的EAE干预降低了BLM诱导的小鼠中Oscillospira和Bacterioides的相对丰度以及5-HT水平，与对照组相比有所改善。先前的研究已经证明了肠道-肺部轴在通过调节肠道微生物群和代谢物分解来保护肺部健康方面的潜在作用（Tang等人，2024年，2023年）。因此，我们假设EAE干预可以通过调节肠道微生物群并在肠道-肺部轴中介导5-HT来发挥对抗肺纤维化（PF）的保护作用。

5-HT是一种高度保守且普遍存在的内源性单胺信号分子，对炎症和免疫有显著影响（Pergolizzi等人，2022年；Wu等人，2019年）。在组织损伤期间，循环中的血小板被招募到损伤部位并被激活以释放5-HT。随后局部5-HT浓度的增加促进了促炎分子和纤维化效应，导致组织通透性增强和细胞因子释放（Lofdahl等人，2020年）。在PF患者中经常观察到高水平的5-HT和细胞因子，如IL-6、IL-1β、IL-10和TNF-α（Balzanelli等人，2022年；Lofdahl等人，2023年；Weng等人，2019年）。IL-6是一种由多种细胞类型（包括成纤维细胞）产生的促炎细胞因子，与活跃的纤维化过程密切相关（Zhao等人，2019年）。IL-1β和IL-10的过表达已被证明会诱导肺部胶原沉积和纤维化（Huaux，2021年；Zhang等人，2023年）。TNF-α通常在炎症早期阶段大量产生，它通过产生TNF-α和IL-6等细胞因子来放大炎症（Heukels等人，2019年；Yang等人，2018年）。因此，抗炎仍然是减缓PF进展和降低疾病风险的主要策略。在本研究中，EAE干预显著降低了肺组织中IL-6、IL-1β和IL-10的mRNA水平。尽管这些测量是在晚期纤维化阶段（BLM后第21天）进行的，但长期升高的细胞因子（如IL-6）已被记录为维持促纤维化微环境并持续激活下游信号通路（Zhao等人，2019年）。因此，EAE在这一晚期阶段下调IL-6 mRNA可能代表了EAE破坏IL-6/JAK2/STAT3正反馈回路的关键机制，从而发挥持续的抗纤维化作用。JAK2/STAT3通路是由炎症因子激活的关键信号通路（Huang等人，2022年）。生长因子（如TGF-β1）和细胞因子（包括IL-6）诱导JAK2激活和磷酸化，进而磷酸化STAT3并驱动纤维化反应（Milara等人，2018年；Zhang等人，2015年）。值得注意的是，IL-6是JAK2/STAT3通路的上游经典激活剂；因此，降低IL-6水平可以直接抑制肺组织中的STAT3磷酸化。此外，有报道称5-HT的积累可以激活JAK2/STAT3通路（Banes等人，2005年）。越来越多的证据表明，抑制JAK2激活可以减弱BLM诱导的炎症反应，下调TGF-β1、TNF-α、IL-1β和IL-6等细胞因子的分泌，抑制EMT，并缓解小鼠的PF（Chen等人，2024年；Ruan等人，2021年）。我们的发现与这些报告一致。EAE抑制了BLM诱导的JAK2/STAT3通路激活，这表现为p-STAT3水平的降低，同时增加了E-钙黏蛋白的表达，并减少了vimentin、α-SMA和Collagen I的表达，从而减弱了EMT过程。基于EAE对肠道微生物群调节和色氨酸代谢（5-HT）纠正的观察到的协同效应，我们提出了一个工作假设：EAE可能调节肠道微生物群组成，从而改善色氨酸代谢并降低外周5-HT水平。5-HT水平的降低反过来可能抑制促炎细胞因子（如IL-6）的产生。随后IL-6水平的下降会抑制肺组织中JAK2/STAT3通路的激活，最终减轻EMT和胶原沉积。这一假设框架将“肠道-肺部轴”的宏观变化与肺部局部分子事件联系起来，为未来的机制验证提供了依据。然而，本研究存在某些限制。目前的数据主要揭示了EAE与观察到的多层次变化之间的关联，而不是建立明确的因果关系。需要进一步的研究来通过粪便微生物群移植实验验证肠道微生物群重塑的必要性，通过靶向代谢物补充研究阐明5-HT在JAK2/STAT3通路激活中的作用，并使用JAK2抑制剂进行体外反向验证，以直接评估EAE对这一信号级联的调节效应。

5 结论

在这项研究中，我们发现EAE由于其丰富的生物活性成分和强大的抗氧化能力而具有抗纤维化作用。从机制上看，EAE干预与肠道微生物群组成的有利调节相关，特别是增加了有益菌类（如Akkermansia）的同时减少了潜在的致病细菌（包括Bacterioides），并纠正了全身代谢紊乱，特别是色氨酸代谢。此外，EAE通过抑制JAK2/STAT3信号通路来抑制肺部炎症和EMT。总之，这些发现表明EAE通过多方面的调节在肠道-肺部轴上发挥抗纤维化作用，涉及微生物生态、氨基酸代谢和炎症信号传导的综合变化。这使EAE成为进一步开发为肺纤维化预防或治疗策略的有希望的候选方法。

作者贡献

Ting Zhou：方法学、研究、撰写——原始草案。
Heting Zhou：方法学、研究。
Xinyue Zheng：方法学。
Xiaomeng Wang：方法学。
Tao Chen：方法学。
Xingjie Li：方法学。
Liqun Wang：可视化。
Shouqian Li：方法学。
Yongmei Xie：方法学。
Lijun Peng：监督、概念化。
Wenya Yin：监督、概念化。

致谢

感谢四川大学公共卫生学院公共卫生与预防医学实验平台以及成都产品质量检验有限公司的支持。

资助

本工作得到了四川省科学技术部门（编号2022NSFSC0587）和四川省卫生委员会医学科技计划（编号23LCYJ009）的支持。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

数据可用性声明

支持本研究发现的数据可向相应作者请求获取。