《HUMAN MUTATION》：Whole-Exome Sequencing to Screen Personal Neoantigens With High Immunogenicity in Patients With Microsatellite Stability (MSS)–Advanced Colorectal Cancer
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为开发针对微卫星稳定（MSS）晚期结直肠癌（CRC）的个体化新抗原治疗策略，研究人员筛选了来自所收集人类CRC样本的新抗原，并探讨了这些新抗原治疗CRC的可行性和有效性。研究人员进行了全外显子组测序和转录组测序，以鉴定体细胞突变、RNA表达和人白细胞抗原（HL
为开发针对微卫星稳定（MSS）晚期结直肠癌（CRC）的个体化新抗原治疗策略，研究人员筛选了来自所收集人类CRC样本的新抗原，并探讨了这些新抗原治疗CRC的可行性和有效性。研究人员进行了全外显子组测序和转录组测序，以鉴定体细胞突变、RNA表达和人白细胞抗原（HLA）等位基因。基于这些数据，预测了新抗原候选物，并评估了其免疫原性。从患者中筛选出的新抗原在CRC外周血淋巴细胞中引发了增强的T细胞反应。在患者1（P1）中，突变肽SOX9-V144M、ZNF169-A275S、CDH4-V456M、NIM1K-T66M和MAP3K9-R1008Q比其对应的非突变（野生型）肽更有效。在自体人源化CRC小鼠模型中，用突变肽ZNF169-A275S和CDH4-V456M接种疫苗抑制了肿瘤生长。高免疫原性的新抗原是个体化癌症治疗的有力候选者，有望转化为对晚期疾病CRC患者的有效治疗方法。
论文解读：个体化新抗原筛选在MSS晚期结直肠癌免疫治疗中的应用研究
一、 研究背景与目的
结直肠癌（CRC）是全球范围内第三大常见诊断癌症，也是癌症相关死亡的主要原因之一。免疫检查点抑制剂（ICIs）虽然革新了癌症治疗，但其疗效在CRC中主要局限于少数（<5%）具有高度微卫星不稳定性（MSI-H）肿瘤的患者。绝大多数具有微卫星稳定（MSS）状态的晚期CRC患者无法从ICIs中获益。传统的过继细胞疗法和肿瘤疫苗常使用非特异性的肿瘤相关抗原，这些抗原也在正常组织中表达，导致疗效欠佳且存在因中枢耐受而产生显著副作用的风险。随着下一代测序技术的发展，患者特异性的新抗原已成为个体化免疫治疗的理想靶点。新抗原是仅由癌细胞呈递的、真正的肿瘤特异性抗原，使免疫系统能够区分恶性组织和健康组织，从而最大限度地减少不良事件。新抗原形成的可能性与突变频率相关。CRC的平均突变密度约为每兆碱基10个突变，在具有高肿瘤突变负荷（TMB）的MSI-H CRC中已观察到有效的新抗原特异性抗肿瘤免疫反应。然而，大多数MSS CRC患者并未从ICIs中受益。因此，迫切需要开发识别MSS CRC中新抗原的方法，并为该亚型患者提供个体化治疗方案。本研究的核心是针对MSS晚期CRC，开发基于全外显子组测序的个体化新抗原筛选与验证流程，旨在评估新抗原免疫治疗的潜力，探索其作为新型治疗策略的可行性和有效性。
二、 主要技术方法
本研究采用了一系列前沿的生物信息学和免疫学技术。研究队列为来自昆明医科大学附属云南省肿瘤医院的四名符合标准的MSS晚期CRC患者（编码为P1-P4），采集了肿瘤组织和外周血单核细胞（PBMCs）。关键技术流程包括：
- 1.
基因组与转录组测序：对患者肿瘤和匹配血液样本进行全外显子组DNA测序和RNA测序（RNA-seq），使用Fastp进行质控，BWA和STAR进行比对，GATK进行变异检测。
- 2.
新抗原预测与HLA分型：使用VarDict鉴定体细胞突变（SNV和Indel），通过Ensembl VEP注释。利用Polysolver和BWA-HLA进行HLA分型。随后，采用TruNeo分析管道，基于NetMHCpan和NetMHCIIpan算法预测肽段与HLA的结合亲和力，并结合突变基因表达水平、与自身肽段的相似性及突变等位基因频率，优先筛选出新抗原候选物。
- 3.
体外免疫原性验证：化学合成预测得到的高亲和力长肽（29个氨基酸），利用患者自体PBMCs来源的树突状细胞（DCs）在体外刺激产生新抗原反应性T细胞（NRTs），通过干扰素-γ（IFN-γ）酶联免疫斑点（ELISpot）实验和CCK-8细胞毒性实验评估T细胞反应。
- 4.
体内疗效评估模型：构建了患者来源异种移植（PDX）小鼠模型，并在此基础上建立自体人源化CRC小鼠模型（将患者肿瘤细胞与自体PBMCs共同植入免疫缺陷小鼠）。在此模型中，评估了筛选出的高免疫原性新抗原肽疫苗（与佐剂poly I:C混合）的体内抗肿瘤效果，监测肿瘤生长和小鼠生存期。
三、 研究结果
3.1. 体细胞突变筛选与新抗原预测
对四名患者进行全外显子组和RNA-seq分析，平均每位患者鉴定出142个非同义体细胞突变。基于此，预测了MHC I类限制性和II类限制性新抗原候选物。例如，患者P1预测出93个I类限制性和37个II类限制性新抗原。根据预测的结合亲和力（%rank值），新抗原被分为强结合剂和弱结合剂。从每位患者中，各选择了10个具有强HLA结合亲和力的突变相关长肽进行化学合成，用于后续验证。
3.2. 新抗原在体外可引发CRC患者增强的NRT反应
利用患者自体PBMCs评估合成肽的免疫原性。ELISpot结果显示，多位患者的部分新抗原候选肽能够诱导肽特异性T细胞反应。在P1中，SOX9-V144M、ZNF169-A275S、CDH4-V456M、NIM1K-T66M和MAP3K9-R1008Q等肽段诱导了明显的IFN-γ分泌。
3.3. 突变肽比其野生型（WT）对应物引发更强的NRT反应
针对P1，进一步比较了NRTs对突变肽和WT肽的反应性。ELISpot分析显示，突变肽刺激后NRTs释放的IFN-γ量显著高于对应WT肽的刺激。细胞毒性实验进一步证实，针对ZNF169-A275S和CDH4-V456M等突变肽的NRTs能有效杀伤表达相应突变抗原的靶细胞（如肽段负载的T2细胞或转染了突变微小基因的SW480细胞），而对对照靶细胞无显著杀伤作用。T细胞受体（TCR）测序分析也显示，突变肽刺激后TCR克隆多样性降低，克隆平均频率增加，TCR趋同性增强。
3.4. 新抗原可在PDX小鼠体内诱导NRTs
在PDX小鼠模型中，用ZNF169-A275S和CDH4-V456M肽加佐剂免疫小鼠。ELISpot结果显示，免疫小鼠脾脏来源的NRTs在受到相应突变肽刺激时，能产生比WT肽刺激更强的IFN-γ反应。细胞毒性实验同样证明，这些NRTs能特异性杀伤负载相应突变肽的靶细胞。
3.5. 新抗原疫苗可在自体人源化小鼠模型中诱导有效的抗肿瘤反应
在自体人源化CRC小鼠模型中，评估ZNF169-A275S和CDH4-V456M肽疫苗的体内疗效。结果显示，与仅接受佐剂或不治疗的对照组相比，接种任一种新抗原疫苗的小鼠肿瘤生长均显著延迟。生存分析表明，接种ZNF169-A275S和CDH4-V456M疫苗的小鼠分别有8/10和7/10在肿瘤接种后存活超过80天，而对照组小鼠均在20-40天内死亡。这表明新抗原疫苗接种在体内触发了有效的抗肿瘤反应。
四、 讨论与结论总结
研究人员在讨论中指出，新抗原因其高免疫原性且不受胸腺中枢耐受影响，是癌症疫苗开发的热点。尽管ICIs改善了MSI-H晚期CRC患者的预后，但突变负荷低、微卫星稳定的MSS CRC患者通常对这类疗法无反应。针对新抗原的免疫治疗策略旨在通过增强宿主T细胞反应来消除肿瘤细胞，为MSS CRC提供了潜在的治疗途径。
本研究提出了一个用于预测和评估MSS CRC患者新抗原的工作流程。尽管MSS CRC常因低肿瘤突变负荷而被认为不适合免疫治疗，但研究证实其中仍可存在免疫原性新抗原。通过整合了结合亲和力以外多个生物学过程的计算工具TruNeo进行预测，并利用自体人源化PDX小鼠模型进行体内验证，结果表明个体化新抗原疫苗策略是可行的。新抗原疫苗接种在模型中引发了持续的特异性免疫反应，并显著抑制了肿瘤生长。
研究结论：高度免疫原性的新抗原是个体化癌症治疗的有力候选者，基于全外显子组测序筛选个体化新抗原的策略，在临床前模型中显示出对MSS晚期结直肠癌的治疗潜力，有望转化为对该患者群体的有效治疗方法。
论文发表信息：本研究已发表在《HUMAN MUTATION》期刊上。
