可电离聚合物胶束靶向转铁蛋白受体1增强脑部系统mRNA递送

《Molecular Pharmaceutics》：Ionizable Polymeric Micelles Targeting Transferrin Receptor 1 Enhance Systemic mRNA Delivery to the Brain

基于mRNA的疗法拥有治疗多种疾病的巨大潜力。然而，由于存在生物屏障，如循环中的快速降解、受限的脑部进入途径以及细胞内的内体滞留，其在中枢神经系统（CNS）疾病中的应用仍然有限。为了应对这些挑战，研究人员开发了一种基于聚合物胶束的纳米载体，能够系统地将mRNA递送至大脑。该系统采用三苯基膦（TPP）作为阳离子部分，以稳定结合mRNA并延长其血液循环时间。TPP被引入到带有二乙烯三胺（DET）的PEG-聚天冬酰胺衍生物中，其pH响应的可电离胺基促进了内体逃逸。为了实现脑靶向，抗转铁蛋白受体1（TfR1）的抗体片段通过点击化学以受控密度偶联到PEG外壳上。这种合理的多功能设计使得在全身给药后能够在大脑中原位实现强劲的蛋白质生产，与初始配方相比增加了约10倍，同时对其他器官中的脱靶表达影响较小。该系统为系统性mRNA脑部递送提供了一个有前景的平台，为治疗CNS疾病开辟了新途径。

论文解读：可电离聚合物胶束靶向转铁蛋白受体1增强脑部系统mRNA递送

研究背景与现状

自COVID-19疫苗问世以来，基于mRNA的疗法已成为癌症、代谢及遗传性疾病等多种疾病的有力候选手段。其中，神经退行性疾病等中枢神经系统（CNS）疾病领域尤为迫切需要有效治疗手段。与蛋白质疗法相比，mRNA疗法能够瞬时高效地产出治疗性蛋白质，有望同时改善安全性与有效性。然而，尽管各种合成纳米载体已被设计用于体内mRNA递送，并能成功将mRNA递送至肌肉、肝脏或肺部等靶器官，专门针对CNS疾病的mRNA纳米载体仍极度匮乏。这主要是因为系统性给药面临多重生物屏障：mRNA在循环中易被快速降解；血脑屏障（BBB）严格限制大分子药物入脑；且进入细胞后的mRNA极易被困在内体中，无法释放至胞质进行翻译。因此，开发能够克服这些生理障碍的递送系统是实现脑部mRNA系统给药的关键。

研究内容与意义

针对上述挑战，来自日本东京大学医学研究生院先进纳米医学工程系的研究人员Jumpei Norimatsu、Hayato L. Mizuno、Yuki Mochida、Shigeto Fukushima、Satoshi Uchida、Horacio Cabral和Yasutaka Anraku团队，设计了一种基于聚合物胶束（PMs）的多功能纳米载体。该研究通过整合三苯基膦（TPP）介导的稳定复合物形成、pH响应型可电离侧链促进的内体逃逸以及转铁蛋白受体1（TfR1）介导的脑靶向策略，实现了高效的系统性脑部mRNA递送。这项研究表明，通过精确调控材料化学结构与表面配体密度，可以显著增强mRNA在脑内的蛋白质表达能力，同时降低外周器官的脱靶效应。该研究成果发表在《Molecular Pharmaceutics》期刊上，为治疗CNS疾病提供了一种极具潜力的非侵入性平台技术。

主要关键技术方法

研究人员采用了几项核心技术来构建和评估这一递送系统。首先，通过开环聚合和氨基化反应合成了PEG-聚天冬氨酸（DET）嵌段共聚物，并利用酰胺偶联反应引入了TPP基团。其次，利用酸-碱滴定法评估聚合物的可电离特性，并通过动态光散射（DLS）监测其在不同盐浓度和pH下的胶体行为。第三，通过薄膜水化法制备载mRNA的聚合物胶束（mRNA/PMs），并利用荧光共振能量转移（FRET）和qRT-PCR评估其在血清中的稳定性。第四，采用无铜点击化学（Cu-free click chemistry）将抗TfR1的Fab'片段以受控密度安装到胶束表面。最后，通过荧光相关光谱（FCS）定量每个胶束上的Fab'数量，并利用体外细胞实验（如荧光显微镜观察内体共定位）和体内小鼠模型（静脉注射后检测血液半衰期、生物分布及荧光素酶表达）来全面评估系统的性能。

研究结果

3.1. 含TPP的可电离嵌段聚阳离子的制备

研究人员首先成功合成了带有TPP基团的PEG-聚天冬氨酸（DET）（PEG-PAsp(DET(TPP))）及其对照物PEG-聚赖氨酸（TPP）（PEG-PLys(TPP)）。酸-碱滴定显示，PEG-PAsp(DET(TPP))的侧链中含有二级胺，其pKa约为5.9，表现出在酸性pH下的缓冲能力，这对于内体逃逸至关重要；而PEG-PLys(TPP)则缺乏此特性。此外，DLS分析表明，这两种聚合物均表现出NaCl响应的自组装行为，且在pH 5.5时需要更高的盐浓度才能组装，证实了其在生理条件下形成胶束的稳定性。

3.2. 载mRNA聚合物胶束（mRNA/PMs）的开发

所有聚合物均能形成粒径约50-60 nm的单分散纳米颗粒。与不含TPP的聚合物相比，TPP修饰的胶束显示出更高的FRET信号，表明其对mRNA的压缩更致密。在血清稳定性实验中，TPP的引入显著提高了mRNA对RNase的抗性，并维持了胶束结构的完整性。细胞实验进一步揭示，尽管PEG-PLys(TPP)和PEG-PAsp(DET(TPP))的mRNA细胞摄取水平相当，但后者由于其二乙烯三胺（DET）侧链的质子化，显著降低了mRNA与晚期内体/溶酶体的共定位，促进了内体逃逸，从而在细胞内产生了显著更高的蛋白质表达。

3.3. 配体在mRNA/PMs上的安装

利用叠氮化物-PEG-NH₂作为引发剂合成的聚合物，可通过无铜点击化学将DBCO修饰的Fab'片段精准地偶联到胶束表面。荧光相关光谱（FCS）分析证实，Fab'成功偶联且扩散时间与胶束相符。通过调整Fab'-PEG₄-DBCO的投料比（0.05, 0.1, 0.2当量），研究人员实现了对每个胶束上Fab'数量的剂量依赖性控制（从约7.5个到27.5个不等），且超过97%的Fab'能有效结合到胶束上，同时保持了胶束原有的粒径和弱正电性。

3.4. 配体修饰mRNA/PMs的体外性能

在TfR1阳性的B16F10细胞中，安装Fab'的胶束（Fab'-mRNA/PMs）显著增强了mRNA的细胞摄取，且该增强作用可被游离的8D3抗体阻断，证明了其TfR1依赖性的靶向机制。在蛋白质表达方面，虽然两种聚合物体系的细胞摄取量相近，但由PEG-PAsp(DET(TPP))构建的Fab'胶束诱导了显著更高的荧光素酶表达，这归因于其优异的内体逃逸能力。

3.5. 配体修饰mRNA/PMs的体内性能

静脉注射后，所有制剂均表现出相似的血液循环曲线，且Fab'的安装并未缩短循环时间，反而可能因中和表面电荷而略微延长半衰期。生物分布研究显示，mRNA主要积累在肺、肝和脾。值得注意的是，0.05当量的Fab'安装量在两种聚合物体系中均实现了最高的脑部mRNA积累，而过高的配体密度可能导致脱靶效应。在蛋白质表达层面，只有PEG-PAsp(DET(TPP))构建的胶束在脑部显示出显著的荧光素酶活性，且经0.05当量Fab'修饰后进一步增强，脑/肝表达比达到约0.26。这表明可电离侧链与适度密度的脑靶向配体相结合，是实现高效脑部mRNA递送的关键。

结论与讨论

该研究展示了一种能够经由全身注射将mRNA递送至大脑的多功能聚合物纳米载体。具体而言，在聚合物中引入TPP以实现高度稳定的mRNA络合，利用可电离侧链促进强效的内体逃逸，以及通过精确控制的Fab'安装实现TfR1引导的脑靶向，构成了一种独特的协同设计，从而选择性地增强了大脑中的蛋白质生产。据研究人员所知，这是首例利用基于聚合物的纳米载体实现系统性脑部mRNA递送的报告。尽管近期研究已利用脂质系统实现了脑靶向mRNA递送，但扩充递送平台的多样性对于推进针对广泛神经系统疾病的mRNA疗法至关重要。虽然仍有大量注射的mRNA积累在肺等非靶器官，但探究其机制将为进一步优化纳米载体设计以提高脑部递送效率提供见解。鉴于mRNA序列的可定制性，该系统作为一种低侵入性且稳健的平台，有望通过在脑内原位产生治疗性蛋白质，来治疗各种难治性CNS疾病。