纳米结构脂质载体提升了小分子MAO B抑制剂在大脑中的递送效率及其抗氧化作用，有助于神经退行性疾病的治疗效果

《Molecular Phylogenetics and Evolution》：Nanostructured Lipid Carriers Enhance Brain Delivery and Antioxidant Efficacy of a Small-Molecule MAO B Inhibitor for Neurodegenerative Disease Therapy

【字体：大中小】 时间：2026年05月05日 来源：Molecular Phylogenetics and Evolution 3.6

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意大利巴里市E·奥拉博纳街4号（Via E. Orabona 4），70126邮编，化学系

神经退行性疾病，包括阿尔茨海默病（Alzheimer’s）和帕金森病（Parkinson’s），迫切需要新的治疗策略。单胺氧化酶B（MAO B）是一种参与氧化应激和神经递质代谢的线粒体酶，已成为神经保护的有希望的目标。最近发现了一种5-取代的1H-吲唑衍生物（这里称为化合物1），它是一种强效且安全的MAO B抑制剂，具有抗氧化和神经保护作用。不幸的是，化合物1的水溶性较差，在水解条件下化学稳定性也不佳，这限制了其治疗潜力。为了克服这些缺点，开发了纳米结构脂质载体（NLCs）作为化合物1的输送系统。将发光碳点（CDs）与化合物1共同封装在NLCs中，进一步研究了NLCs穿透人工血脑屏障（BBB）模型的能力，从而能够定量评估其穿越效率。通过NLCs输送化合物1后，穿越BBB的比例明显更高（约26%），而自由分子的穿透比例仅为约2.6%。封装还保留了在SH-SY5Y细胞中的抗氧化效果，同时纳米制剂表现出良好的细胞耐受性，在测试的浓度范围内细胞活力保持在60%以上。这些体外结果表明，所提出的纳米制剂是一种增强该小分子向中枢神经系统（CNS）递送的有希望的策略，突显了其在神经退行性疾病（NDs）中的潜在应用。

引言

寿命的延长增加了与年龄相关的疾病发病率，包括阿尔茨海默病（AD）和帕金森病（PD）。这些疾病是进行性的、致残的神经退行性疾病（NDs），其特征是认知能力下降、行为紊乱和记忆障碍，最终影响患者进行日常活动的能力。日益增加的社会经济负担是由于缺乏可靠的早期诊断工具以及缺乏有效的疾病修饰疗法。每种ND都有特定的病理学特征。例如，AD的特征包括细胞外神经炎性斑块的积累，主要由β-淀粉样蛋白（Aβ）纤维组成，以及神经元内由过度磷酸化的tau蛋白聚集形成的细胞内神经纤维缠结。除了这些特征外，越来越多的证据表明NDs涉及多种相互关联的病理机制，包括突触功能障碍、慢性神经炎症、线粒体紊乱、生物能量代谢下降、氧化应激和血管异常。基于这些因素，NDs被称为多因素疾病，由于多种异常的同时存在，很难确定下游触发事件并验证有效的药物靶点。鉴于NDs的多因素性质，药物开发面临的主要挑战之一是从单一靶点方法转变为能够解决疾病复杂性的策略。在这种情况下，多靶点导向配体（MTDL）方法应运而生，旨在设计能够同时调节与AD发生和发展相关的多个关键病理途径的混合小分子。这种策略通过利用多功能活性的协同效应提供治疗优势，减少药物间的相互作用，简化治疗方案，并最终提高安全性、有效性和患者依从性。另一方面，这些疾病的复杂性要求识别新的可成药靶点。在线粒体膜结合酶中，单胺氧化酶A和B（MAO A和B）值得关注。这些黄素酶通过氧化脱氨基反应负责内源性（如儿茶酚胺）和外源性单胺的系统降解。除了MAO抑制剂能够调节神经递质外，这些酶还是提供神经保护作用的有希望的靶点。MAO的催化作用会产生有害副产物过氧化氢，导致活性氧物种（ROS）的产生，从而引起线粒体和细胞的氧化损伤。特别是MAO B，在神经炎症中起积极作用，维持NLRP3（含pyrin结构域的NLR家族）炎性小体的激活，这也参与了神经退化。越来越多的证据表明，神经炎症，特别是涉及小胶质细胞和星形胶质细胞的炎症，在AD的早期阶段非常突出。反应性星形胶质细胞释放促炎细胞因子并过度表达MAO B。此外，在AD大脑中，MAO B与淀粉样斑块共定位，其神经染色与Aβ42的产生相关。研究表明，抑制MAO B可以减少Aβ42的积累，这表明阻断MAO B活性可能有助于缓解AD中的神经炎症。在这种背景下，一些作者通过分子杂交策略发现了一系列作为神经保护性MAO B抑制剂的5-取代的1H-吲唑。在评估了化合物1对人类神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y的固有细胞毒性后，测试了它们对抗过氧化氢引起的SH-SY5Y细胞损伤和ROS产生的能力。在所有提出的分子中，下文称为化合物1（原始论文中的吲唑20）在酶抑制、抗氧化活性和神经保护作用方面表现出了有希望的潜力。然而，其进一步发展受到了药物性质不佳的影响，主要是由于物理化学限制，尤其是水溶性差。这些不适当的特性通常是中枢神经系统（CNS）药物发现项目的瓶颈，因为不适当的药物性质是生物利用度低和脑部渗透差的主要原因。为了解决这些问题并增强这种小分子的治疗潜力，这里研究了纳米结构脂质载体（NLCs）作为化合物1的输送系统。这种基于脂质的纳米平台被选用来改善其穿越血脑屏障（BBB）的渗透性，提高生物利用度，并增强抗氧化效果。NLCs在神经药理学领域受到了广泛关注，作为一种高效的药物输送系统，具有控制释放、低全身毒性和高胶体稳定性等优点，有助于治疗剂穿越BBB。它们的固体脂质基质可以保护治疗载荷免受酶解和水解，延长循环时间，并降低清除率。此外，NLCs的脂质性质即使在未经表面功能化的情况下也能促进穿越BBB。尽管脂质纳米颗粒穿越BBB的确切机制尚不清楚，但尺寸在40–200纳米范围内的脂质纳米结构能够穿越紧密的BBB内皮细胞，避免被网状内皮系统（RES）快速吸收。支持这一策略的先前的研究，如Cunha等人的研究，成功使用NLCs增强了用于AD治疗的利伐斯明等小分子的BBB渗透性。

在本研究中，通过热均质化-蒸发微乳技术制备了负载化合物1的NLCs，并就颗粒大小、形态、胶体稳定性和包封效率进行了表征。所得制剂进行了体外评估，以评估其细胞毒性和抗氧化效果以及穿越人工BBB模型的能力。为了监测BBB穿越情况，合成了可分散在油中的碳点（CDs），并与化合物1共同封装，制备出可光学追踪的体外制剂。

材料与方法

材料

无水柠檬酸、1-十八烯（ODE，技术级90%）、1-十六胺（HDA，98%）、Kolliphor P188、胆固醇、胆甾醇油酸酯、甘油三油酸酯、3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯四唑溴化物（MTT）、荧光素异硫氰酸酯-葡聚糖（FITC-D，平均分子量：3000–5000）、30%稳定过氧化氢溶液、2-(N-吗啉氧基)乙酸（MES）、氯化钠（NaCl）、磷酸二钠（Na2HPO4）、氯化钾（KCl）、磷酸二氢钾（KH2PO4）、人重组单胺氧化酶B（MAO B）和safinamide均购自Sigma-Aldrich公司（圣路易斯，密苏里州）。此外，1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-聚（乙二醇）（DSPE-PEG）来自Avanti Polar Lipids公司。胎牛血清（FBS）、青霉素和链霉素（P/S）由GIBCO公司（佩斯利，苏格兰）提供，而Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）由SIAL公司（罗马，意大利）提供。2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸盐（DCFH-DA）购自Calbiochem公司（圣地亚哥，加州）。大鼠尾胶原I（高浓度）和Transwell细胞培养贴片来自Corning公司（纽约）。星形胶质细胞DI TNC1细胞系（ATCC CRL-2005）（https://www.atcc.org/products/crl-2005）、人类神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y，ATCC CRL-2266）（https://www.atcc.org/products/crl-2266）和脑永生化内皮细胞系（bEnd.3，ATCC CRL-2299）来自美国类型培养收集中心（ATCC）。根据供应商的质量控制报告，在购买时确认这些细胞系无支原体污染。所有使用的化学试剂和试剂均为分析级。超纯水（电阻率：18.2 MΩ·cm；总有机碳≥4 μg/L）使用Milli-Q Gradient A-10系统（Millipore）制备，用于配制所有水溶液。

化合物1的合成

根据已发表的程序，中规模合成了化合物1（从0.50克1H-吲唑-5-羧酸开始，根据需要重复实验，总产率约为23 ± 2%），感兴趣的读者可以找到材料、方法、分析和光谱特性的详细信息。简要来说，4-氰基酚与（3,4,5-三甲基苯基）甲醇的Mitsunobu型烷基化得到了所需的腈，然后通过与羟胺反应将其转化为相应的肟。随后，在回流条件下，吡啶促进1H-吲唑-5-羧酸的环化，并在原位转化为酰氯，与肟反应得到所需的1,2,4-氧二唑1（图1）。

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1. 白色固体；熔点189–192 °C。1H NMR和13C NMR光谱以及高分辨率质谱与已报道的结果完全一致。新制备批次的纯度总是通过元素分析和RP-HPLC（>97%）进行检测。C、H和N的百分值与理论值相差在±0.40%以内。用于所有生物实验的化合物1的纯度>97%（通过元素分析和RP-HPLC，见支持信息，图S1）。

NLC基制剂的制备

空NLCs是根据先前报道的程序28, 29通过热均质化-蒸发技术制备的，并进行了一些修改。胆固醇、胆甾醇油酸酯、甘油三油酸酯和DSPE-PEG（脂质比例1:1.64:0.24:0.32）溶解在氯仿（792.4 μL）中。将有机溶液倒入Kolliphor P188水溶液（10 mL，1.18 mg）中，并保持在50 °C，然后用ULTRA-TURRAX均质器以20,000 rpm均质化5分钟。所得油水乳液在35 °C下放置1小时，在25 °C下放置1小时，然后在室温下过夜让氯仿蒸发。样品在4 °C下储存。

负载化合物1的NLCs（1/NLCs）是使用不同浓度的化合物1（1、2和3 mg/mL）的795 μL氯仿溶液制备的，而不是纯氯仿。为了获得可光学追踪的纳米载体（1-CD/NLCs），根据Panniello等人30报道的实验程序合成了发光CDs，该程序基于柠檬酸在高沸点溶剂系统中的热分解。具体来说，反应介质是ODE，而HDA同时作为表面封盖剂和氮掺杂源。反应在氮气流动下使用Schlenk技术和无水或脱气试剂进行。首先在100 °C下真空条件下将HDA（6.2 mmol）溶解在ODE（26 mL）中30分钟。随后，将反应批次进一步加热，并在200 °C下快速向热反应混合物中注入5.2 mmol柠檬酸。在这些条件下保持3小时后，通过将系统冷却至25 °C来停止反应。粗产物经过多次沉淀-重新分散循环，使用丙酮作为非溶剂，最终得到纯化的C-点，然后将其重新分散在氯仿（620 mg/mL）中。

对于制备同时封装CDs和化合物1的可光学追踪NLCs（1-CD/NLCs），在纳米制剂制备过程中向有机相中加入了8 μL的CD分散液（620 mg/mL氯仿）。对于所有制备，合成后样品被浓缩至最终体积2 mL，然后通过4 °C下的离心（Centricon离心过滤器）循环洗涤，以去除多余的脂质、未嵌入的化合物1和/或CDs。

NLC基制剂在尺寸、形态、胶体稳定性和光学性质方面的表征

使用Zetasizer NanoZS（Malvern Instruments Ltd.，伍斯特郡，英国）（样品稀释1:100在超滤水中）评估了不同NLC样品的流体动力学直径、尺寸分布、多分散指数（PDI）和胶体稳定性。所有报告的数据均以平均值±标准偏差（SD）（三次重复）表示。 Transport电子显微镜（TEM）检测使用的是JEOL JEM-1011显微镜，在100 kV的加速电压下工作，TEM图像由Olympus Quemesa Camera（11 Mpx）采集。样品的制备方法是先将NLCs的水悬浮液滴在400目非晶碳涂层的Cu网格上，然后让溶剂蒸发。紫外-可见光吸收测量使用的是Varian Cary 5000 UV–vis–NIR双光束分光光度计进行。样品的衰减全反射傅里叶变换红外（ATR-FTIR）光谱记录使用的是PerkinElmer Spectrum One傅里叶变换红外光谱仪，该仪器配备了直径为4毫米的金刚石微棱镜作为内部反射元件。所有光谱的记录范围是400–4000 cm–1，分辨率为4 cm–1（16次扫描）。装载有CD的样品的稳态光致发光（PL）发射光谱记录使用的是Fluorolog 3荧光分光光度计（Horiba Jobin-Yvon），该仪器配备了450 W的Xe灯作为激发光源，并配备了双光栅激发和发射单色仪。绝对量子产率（QY）的测量是通过安装在Fluorolog 3荧光分光光度计（Horiba Jobin-Yvon）光路上的“Quanta-phi”积分球来获得的。时间分辨（TR）-PL测量使用的是时间相关单光子计数（TCSPC）技术，设备同样来自Fluorolog 3荧光分光光度计（Horiba Jobin-Yvon）。样品在375 nm处被皮秒激光二极管（NanoLED 375L）激发。PL信号由皮秒光子计数器（TBX ps Photon Detection Module，Horiba Jobin-Yvon）检测。实验装置的时间分辨率设置为约200 ps。衰减函数是通过使用DAS Analysis软件的多指数模型对输出直方图进行最佳拟合来确定的，这使我们能够得出平均寿命（τavg）。拟合优度通过X2参数来评估（通常认为只有X2 < 1.2的拟合曲线是可靠的），同时最小化残差图。

化合物1的包封效率（EE%）和药物装载量（DL%）的评估：在冷冻干燥和氯仿处理后，量化了化合物1的包封量，氯仿处理破坏了脂质基质并将分子释放到有机相中。通过记录标准氯仿溶液（浓度范围从5到0.001 μM）在350 nm（λexc 250 nm）处的PL强度来绘制化合物1的EE%和DL%的校准曲线，从而进行光谱估计。EE%的计算公式为EE% = (W_t/W_i) × 100，其中W_t是纳米制剂中化合物1的总量，W_i是用于制备的化合物1的起始总量。DL%的计算公式为DL% = (W_t/W_NLCs) × 100，其中W_NLCs代表NLCs的重量。

体外药物释放研究：使用Transwell渗透支持系统（48孔板格式）评估了化合物1从NLCs中的体外释放情况。将人工纤维素醋酸膜（MWC 0.1–0.5 kDa，Fisher Scientific Milano）插入Transwell插入物中，以分离供体和受体室，允许释放的化合物1扩散，同时保留纳米颗粒。简要来说，将200 μL含有化合物1的NLC分散液置于上层腔室中，同时向lower腔室中加入400 μL释放介质。释放研究在两种不同的pH值（pH 7.4，磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）；pH 5.0，MES）下的缓冲溶液中进行。系统在37 °C下以80 rpm的轨道振荡模式孵育。在预定的时间间隔，收集lower腔室中的释放介质进行光谱分析，然后将其返回同一孔中。每个实验重复三次。每个时间点的化合物1的累积释放量被确定为随时间的累积释放百分比。

体外MAO B抑制测定：通过基于荧光喹奴拉明的实验方案测量人类重组MAO B的抑制效果。实验在黑色的平底聚苯乙烯96孔微孔板（Greiner Bio-One，Kremsmünster，奥地利）中重复进行三次。简要来说，向喹奴拉明的水溶液库存液中加入dimethyl sulfoxide（DMSO）或待研究样品的水溶液（化合物1、空NLCs、1/NLCs）的等分液，并用磷酸钾缓冲液稀释。Safinamide作为参考抑制剂。平板在37 °C下孵育20分钟（或6小时）后加入MAO B溶液。在37 °C下孵育30分钟后，加入aq. NaOH（2N），使用Infinite M1000 Pro荧光多板读数器（Tecan，Cernusco sul Naviglio，意大利）在310/400 nm的激发/发射波长下定量4-羟基喹啉的形成。抑制活性（IC50s）通过GraphPad Prism 6.0软件进行非线性回归来确定。结果是至少两个独立实验的平均值。

MTT测定：脑永生化内皮细胞系bEnd-3、DI TNC1星形胶质细胞和SH-SY5Y人神经母细胞系在T-75烧瓶（75 cm2）中培养，培养基为添加了100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素和10% FBS的DMEM，温度为37 °C，CO2浓度为5%。为了评估纳米制剂的生物相容性，将bEnd-3、DI TNC1和SH-SY5Y细胞以2 × 10^4细胞/孔的密度接种在96孔板中，并用空NLCs以1.8至369 μg/mL的浓度处理，或用化合物1或1/NLCs以0.5、1、5、10、20 μM的浓度处理，有时加入CD。孵育24小时后，通过MTT测定细胞活力，如Latronico等人所述，并将细胞活力表示为相对于对照组（CTRL）的百分比。

活性氧种类的检测：通过将CFDH-DA（10 μM）加载到含有酚红的无酚红DMEM中的SH-SY5Y细胞中来检测活性氧种类（ROS）。在37 °C下孵育30分钟和5% CO2后，细胞分别用H2O2（100 μM）和（a）游离化合物1、（b）1/NLCs（浓度为5 μM）以及（c）NLCs（浓度为92 μg/mL，相当于5 μM 1/NLCs）处理30分钟。仅用DCFH-DA或H2O2处理的细胞分别代表阴性（CTRL）和阳性（H2O2）对照。PL强度（PLI）通过多板读数器（Cytation 3 Imaging Reader；BioTek，Winooski，VT，美国）使用光谱荧光分析法检测（λexc = 485 nm；λem = 525 nm）进行检测。PLI值根据细胞活力进行归一化，并使用以下公式表示ROS产生的相对百分比：% ROS production = (PLI sample/PLI H2O2) × 100。

化合物1和1-CD/NLCs穿越体外血脑屏障（BBB）模型的能力评估：如La Spada等人所述，通过共培养小鼠bEnd-3细胞和DITNC1来建立体外BBB模型。简要来说，将bEnd-3细胞以2 × 10^4细胞/cm2的密度接种在含有预先用鼠尾胶原蛋白I（500 μg/mL）处理的聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）膜（0.4 μm孔）的24孔Transwell插入物的顶端腔室中。DITNC1星形胶质细胞以2.5 × 10^4细胞/cm2的密度接种在涂有0.01%聚L-赖氨酸（PLL）的插入物膜的下层。通过上皮电位计测量跨内皮电阻（TEER）来评估人工BBB的形成。从共培养的第2天开始每天进行测量，以监测屏障的成熟情况。为了获得准确的电阻测量值，从不含细胞的对照组（CTRL）记录的平均TEER值中减去含有共培养系统的插入物的TEER值。TEER值根据膜表面积进行归一化，并表示为Ω/cm2。在第5天评估BBB的细胞间通透性，此时共培养模型达到了最大TEER值（168.48 ± 20.71 Ω/cm2）。荧光异硫氰酸酯葡聚糖（FITC–D）被用作荧光示踪剂。对于这项分析，将1 mL浓度为200 μg/mL的FITC-D加入插入物的上层腔室中。在37 °C和5% CO2下孵育3小时后，收集上层和下层腔室的上清液，并通过SS PL光谱法量化FITC-D的浓度来估计表观通透性（Pa）。通过获取FITC-D水溶液（浓度范围从0.0003到0.03 mg/mL）的PL光谱来确定FITC-D的渗透量。上清液被冻干，用1 mL水处理并离心1500g以去除DMEM成分。FITC-D穿过人工BBB模型的Pa值是通过评估不含细胞的空白插入物（CTRL）和含有细胞的插入物（共培养）的通透性来计算的。在确定BBB功能和完整性的第5天后，随后评估了化合物1或其包装在CD/NLCs（1-CD/NLCs）中的形式穿越屏障的能力。具体来说，将20 μM的化合物1（游离形式或封装在CD/NLCs中）加入插入物的上层腔室中。在37 °C和5% CO2下孵育2小时后，收集Transwell的上层和下层腔室的上清液并分析以评估自由化合物1或1-CD/NLCs的内皮通透性（Pe）。对照组（CTRL）代表在相同条件下未经处理的插入物。

为了评估化合物1或1-CD/NLCs穿越BBB的能力，首先按照La Spada等人的方法共培养小鼠bEnd-3细胞和DITNC1。将bEnd-3细胞以2 × 10^4细胞/cm2的密度接种在含有预处理过的鼠尾胶原蛋白I（500 μg/mL）的24孔Transwell插入物的顶端腔室中。DITNC1星形胶质细胞以2.5 × 10^4细胞/cm2的密度接种在涂有0.01%聚L-赖氨酸（PLL）的插入物膜的下层。使用上皮电位计测量人工BBB的形成。从共培养的第2天开始每天进行测量。为了获得准确的电阻值，从不含细胞的对照组（CTRL）记录的平均TEER值中减去含有共培养系统的插入物的TEER值。BBB的细胞间通透性在第五天进行评估，此时共培养模型达到了最大TEER值（168.48 ± 20.71 Ω/cm2）。荧光异硫氰酸酯葡聚糖（FITC–D）被用作荧光示踪剂。对于这项分析，将1 mL浓度为200 μg/mL的FITC-D加入插入物的上层腔室中。在37 °C和5% CO2下孵育3小时后，收集上层和下层腔室的上清液，并通过SS PL光谱法估计FITC-D的渗透量（Pa）。 FITC-D的渗透量是通过获取FITC-D水溶液的PL光谱（λexc 490 nm）的FITC-D校准曲线来确定的。上清液被冻干，用1 mL水处理并离心1500g以去除DMEM成分。随后，收集上清液并清除培养基中的无机盐。通过计算空白插入物（CTRL）和含有细胞的插入物（共培养）的渗透性来计算FITC-D穿过人工BBB模型的Pa值。在评估第5天BBB的功能和完整性后，随后评估了化合物1或其包装在CD/NLCs（1-CD/NLCs）中的形式穿越屏障的能力。具体来说，将20 μM的化合物1（游离形式或封装在CD/NLCs中）加入插入物的上层腔室中。在37 °C和5% CO2下孵育2小时后，收集Transwell的上层和下层腔室的上清液并分析自由化合物1或1-CD/NLCs的内皮通透性（Pe）。对照组（CTRL）代表在相同条件下未经处理的插入物。为了评估化合物1或1-CD/NLCs处理后BBB的完整性，收集上清液，清洗插入物，并如前所述检测FITC-D的Pa值。通过PL光谱确定有效地穿过BBB模型的化合物1的量。从Transwell的上层和下层腔室中回收的1-CD/NLCs样品被冻干，并用1 mL氯处理。通过离心（1500g）去除培养基中的无机盐。随后收集上清液，并使用校准曲线（λexc 250 nm）计算FITC-D的量。通过PL光谱测定从Transwell的上层和下层腔室中回收的化合物1的量。从Transwell的上层和下层腔室中回收的1-CD/NLCs样品被冻干，并用1 mL氯处理。然后，如前所述，收集上清液并进行PL测量（λexc 375 nm）。使用校准曲线计算1-CD/NLCs穿过人工BBB模型的Pa值。数据以平均值±标准差（SD）的形式呈现。

结果与讨论：为了提高化合物1在水中的分散性和潜在的脑部递送能力，同时保持其内在的药理活性，开发了聚乙二醇（PEG）功能化的纳米脂质载体（NLCs）。进行了一系列体外研究，以评估化合物1在NLC封装后的单胺氧化酶B（MAO B）抑制活性，以及NLCs对细胞活力、抗氧化活性和穿过人工血脑屏障（BBB）模型的转运效率的影响。为了实时监测纳米载体的渗透情况，合成了油可分散的荧光纳米粒子（CDs），并与化合物1共同封装。这些荧光纳米探针具有强烈的可见光发射和优异的生物相容性，作为稳定的光学示踪剂，能够体外追踪NLCs穿过BBB模型的过程，并提供了关于其脑部靶向潜力的见解（图1）。

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1. PEG功能化并装载了化合物1的NLCs示意图，可能对神经退行性疾病（NDs）有益。

化合物1的合成：含氮杂环通常被用作开发MAO抑制剂的分子支架。在这方面，一些合作者最近发表了一系列基于1H-吲唑核的神经保护剂。该杂环在C5位通过不同的连接基团连接了一个亲脂性末端部分（可以适应MAO B的芳香腔）。使用一个末端3,4,5-三甲氧基苯基（TMP）环并通过灵活的连接基团连接，实现了最高的抑制和神经保护效能。TMP部分的设计灵感来自天然存在的多甲基氧基抗氧化剂，例如文章中提到的柑橘黄酮和槲皮素醚。特别是，将C5位的酰胺基团替换为1,2,4-氧化二唑后，发现了化合物1，它是一种强效、可逆且结合紧密的MAO B抑制剂（IC50 = 52 nM）。其对MAO A的活性较低（10 μM浓度下抑制率为14%，IC50 > 10 μM），从而显示出出色的选择性（SIMAO B > 192，即MAO B的选择性指数 = MAO A的IC50 / MAO B的IC50）。除了其在体外的抑制特性外，化合物1的理化性质分析显示其在生理pH值下的水溶性较差（S7.4 = 17 μM）和亲脂性较高（cLog P = 5.01）。值得注意的是，只有在极端酸性条件下（pH 2），才会观察到水解不稳定性，这种条件用于模拟胃部环境，而在生理pH下该化合物保持稳定，这支持了其通过系统途径进行体内给药的适用性。与缺乏-OCH2-桥的双苯类似物相比，在pH 2下检测到的半衰期缩短，主要是由于存在三甲氧基苯基醚片段。虽然这种酸性不稳定性仅限于类似胃部的条件，并不构成系统使用的限制，但其在生理pH下的极低水溶性是进一步开发的主要障碍，严重限制了该分子的生物利用度和临床前研究进展。重要的是，原始研究中报道的结构-活性关系明确指出，三甲氧基苯基醚片段是MAO B抑制的关键药效团元素。带有反向连接基团（-CH2O- vs -OCH2-）或更刚性双苯基团的吲唑作为MAO B抑制剂的活性较低。基于此，设想了（纳米）配方方法来绕过化合物1的药物类似限制，提高生物利用度，并在保持有效MAO B抑制所需的结构特征的同时改善中枢神经系统（CNS）递送。

化合物1通过结合使用多种互补的光学技术进行了全面表征，包括紫外-可见光吸收光谱、荧光（PL）和ATR傅里叶变换红外（FT-IR）光谱（图2）。

2. （A）化合物1在氯仿溶液中的紫外-可见光吸收光谱（紫线）和荧光发射光谱（橙线，λexc = 250 nm）；（B）ATR FT-IR光谱。

化合物1在氯仿溶液中的紫外-可见光光谱（图2A）显示在250 nm附近有一个吸收峰，伴有肩峰。这些特征归因于与苯、1,2,4-氧化二唑和1H-吲唑单元相关的π → π*电子跃迁。在250 nm处激发时，分子展现出从300到450 nm的宽荧光发射带，最大值约为350 nm，这与化合物结构中的苯和1H-吲唑片段的发射一致。该分子的ATR FT-IR光谱显示了特征性振动带，包括N–H伸缩带（约3500 cm–1）和脂肪族Csp3–H伸缩带（约2970和2850 cm–1）。此外，在倍频区域还观察到信号，以及对应于N–O伸缩（约1600 cm–1）、CN伸缩（约1250 cm–1）和C–O–C不对称伸缩（约1100 cm–1）的峰值。

基于NLC的配方制备：准备了三种不同浓度的PEG稳定的NLCs，封装了化合物1（1/NLCs 1、1/NLCs 2和1/NLCs 3），初始化合物浓度分别为1、2和3 mg/mL，以研究最合适的实验条件，从而优化装载过程。冻干步骤后，通过PL光谱确定装载到NLCs中的化合物1的数量，并计算了DL%和EE%值（图3A,B）。随着化合物1浓度从1 mg/mL增加到3 mg/mL，DL%增加，相应的EE%降低。实际上，从1 mg/mL的初始溶液开始，可以在保持过程EE%的同时优化其装载量。通过校准曲线，确定纳米制剂1/NLCs 2中化合物1的实际浓度为（288 ± 2）μM。此后，为了简便起见，优化的配方1/NLCs 2简称为1/NLC，并用于后续研究。

3. （A）基于PL光谱定量分析的化合物1的封装效率（EE%）和药物装载量（DL%）与初始药物给药剂量的关系（mg/mL）。（B）不同1/NLC配方中化合物1的EE%和DL%值。所有报告的数据均以平均值±SD的形式呈现（三次重复实验）。

优化的1/NLCs在粒子大小、胶体稳定性和形态学方面进行了系统表征，使用了动态光散射（DLS）、ζ-电位测量和透射电子显微镜（TEM）分析，并与使用相同实验程序但不添加化合物1制备的空NLCs进行了比较（图4）。

4. （A）空NLCs和1/NLCs的直径分布（按强度测量）。代表性的TEM显微照片（比例尺100 nm）以及（B）空NLCs和（D）1/NLCs的示意图。绘图不是按比例的。（E）空NLCs和1/NLCs的大小（平均流体动力学直径）、PDI和ζ-电位值的总结。所有报告的数据均以平均值±SD的形式呈现（三次重复实验）。

DLS分析显示，1/NLCs的平均流体动力学直径为（151 ± 3）nm，而空NLCs的大小稍小，为（142 ± 2）nm，两者均呈现单峰分布（图4A,C,E）。PDI值（约0.20）表明其具有窄而均匀的尺寸分布，这是形态良好的脂质纳米载体的典型特征。这些参数在不同批次中可重复，并且DLS强度分布轮廓始终显示出一个明确的人口，没有次级峰或聚集现象。TEM显微照片证实了存在形状良好、圆形的纳米粒子，其大小与DLS结果一致（图4B,D）。ζ-电位测量表明空NLCs表面带负电荷，这可能归因于用于NLC制备的脂质基质中的阴离子成分。当封装化合物1后，观察到ζ-电位值略微向正方向移动，表明可能有少量化合物1与NLC表面结合（图4E）。

在4°C下储存三年后对1/NLCs进行的稳定性研究表明，通过DLS测定的粒子大小分布和PDI没有显著变化，表明在这些存储条件下具有良好的物理稳定性（见支持信息，图S2）。ζ-电位值也基本保持不变，分散液在储存期间清澈透明，没有颜色变化或聚集或相分离的迹象（见支持信息，图S1B）。这些结果与NLCs的结构特征一致，其中部分结晶和结构无序的脂质基质有助于胶体稳定性，防止颗粒聚集或药物在储存过程中的排出。在生理条件下（pH 7.4）进行的化合物1从1/NLCs中的释放研究显示，释放过程持续且不完全。在pH 5时，累积释放量约为40%，而在pH 7.4时为28%。两种介质都表现出有限的初始快速释放（<6%），随后是缓慢的、受扩散控制的释放，达到一个平台期，表明化合物1与脂质有很强的相互作用，表现出类似储库的行为。两种介质中释放不完全与化合物1的亲脂性和其对固体脂质基质的高亲和力一致。在pH 5下的较高释放可能反映了化合物1在轻度酸性条件下更好地分配到水相中。总体而言，这些结果表明该制剂在生理相似的缓冲条件下具有高稳定性，并确认1/NLCs在保持化合物1部分留在脂质核心的同时实现持续释放。根据文献报告，在人体血清存在下，预计会完全释放，这可能是由于蛋白质相互作用和脂质基质的酶促不稳定。

5. （A）在37°C和pH 7.4（深青色线）及pH 5（橙色线）下，化合物1从1/NLCs中的体外释放曲线。（B）不同预培养时间（20分钟和6小时）后，化合物1、空NLCs和1/NLCs对人重组MAO B的IC50值。化合物1的浓度为10 μM，使用safinamide作为参考抑制剂。实验进行了三次重复。数值以平均值±SD表示，三次重复实验。

为了评估NLC封装后化合物1的药理活性，使用之前用于化合物1筛选的基于kynuramine的测定方法评估了体外MAO B抑制作用。比较了游离化合物1、1/NLC（化合物1的等效浓度）和空NLCs，以safinamide作为参考（图5B）。空NLCs未显示抑制作用（0 ± 2%），证实载体不干扰测定。游离化合物1表现出强抑制作用（IC50 = 0.052 ± 0.012 μM；10 μM时为97 ± 1%），与之前的报道一致。相比之下，完整的1/NLC在10 μM下预培养20分钟后仅表现出有限的抑制作用（43 ± 1%），而在预培养6小时后仅略有增加（52 ± 1%），这与独立释放研究的结果一致，表明在无蛋白质条件下化合物1的释放量<5%。这种活性归因于表面相关化合物1的初始快速释放。这些结果表明，NLC封装不会化学失活化合物1；相反，配方的控释特性限制了化合物1在短期无蛋白质测定中的即时可用性。NLC系统旨在提高化合物1在生物学相关条件下的溶解度、稳定性和递送能力，而不是作为直接的MAO B抑制剂。短期酶测定无法捕捉到生物流体中的动态释放，因为在生物流体中蛋白质相互作用促进了化合物1的释放。因此，观察到的轻微抑制反映了NLC的缓慢、受控释放行为，与其作为递送平台的作用一致。

尽管1/NLC是未来治疗应用的预期配方，但通过将发光CDs与化合物1共载（1-CD/NLCs）开发了一种光学可追踪的纳米系统，以便追踪NLC在体外BBB模型中的运输。荧光CDs具有多色发射、可调的光学性质、优异的光稳定性以及显著的生物相容性等独特优势，使其成为生物成像和实时追踪药物的理想支架。为了获得发光NLCs，首先在HDA存在下通过高沸点有机溶剂中碳酸化柠檬酸合成了油可分散的CDs，并研究了它们的形态和光学性质（图6A,B）。图6A插图中报告的TEM图像显示存在直径为3.1纳米的球形纳米结构（σ = 25%），这是通过测量统计上相关的纳米物体数量得出的。根据A. Panniello等人的研究，含有胺类的钝化剂的加入可以改善CDs的PL发射性能，这是通过在与碳化过程同时形成分子荧光衍生物来实现的，从而实现了显著的PL量子产率（PL QY）。图6A报告了合成CDs的UV–vis吸收光谱，显示出在紫外范围（λ < 300 nm）内有强烈的吸收信号，而在可见光范围内检测到两个吸收峰，分别位于360 nm和450 nm。这些吸收信号可以归因于与碳质核心的sp2轨道相关的跃迁，以及与合成反应过程中形成的表面官能团和分子荧光团相关的跃迁。下载：下载高分辨率图像（561KB）下载：下载全尺寸图像

6. (A) 一氯仿中的CD分散体的UV–vis和(B) PL发射光谱。PL发射光谱是在图例中指示的各种激发波长下记录的。插图中显示了CDs的TEM显微图（刻度尺100 nm）。(C) 通过DLS测量得到的粒度分布，以及(D) 代表的TEM显微图（刻度尺100 nm），并附有1-CD/NLCs的示意图。(E) 水溶液中1-CD/NLC配方的PL光谱，在不同激发波长下的数据。(F) 在λexc = 375 nm处测量的TR-PL光谱，分别针对未包封的CDs和分散在氯仿及水中的1-CD/NLCs的发射峰。绘图未按比例。

图6A中的PL发射光谱（图6B）显示，根据激发波长的不同，可以观察到两个荧光峰的贡献：第一个峰在435 nm附近的蓝色区域更为强烈，第二个峰在575 nm附近的黄色区域。具体而言，随着λexc的增加，PL峰的最大值会出现红移，这证实了CDs已知的激发波长依赖性荧光特性。由于PL发射依赖于激发能量，CDs的绝对量子产率（QY）也会略有变化，在375 nm的激发波长下可达最大值38%。CDs的疏水特性是由于表面钝化的HDA分子的长链传递的，这使得这些纳米结构天生具有油溶性（见支持信息中的图S3），因此适合作为NLCs脂质核心中的光学示踪剂。

在制备1-CD/NLCs的过程中，使用了5毫克的CDs和初始浓度为2毫克/毫升的化合物1，具体方法见材料与方法部分。样品经过冻干处理以确定有效封装的化合物1的量，并通过PL光谱进行定量分析，得到的平均浓度为（70 ± 3）微摩尔。根据PL光谱（λexc = 250 nm）和先前的方程式，计算出的 efficiencies (%EE) 和 dilution ratios (%DL) 分别为（57 ± 2）% 和（20 ± 3）%，与初始配方（81 ± 3%；29 ± 1%）相比有所下降。这种减少可以归因于CDs部分占据了疏水核心，限制了化合物1的溶解体积，反映了体积容纳限制而非NLCs稳定性的变化或表面性质的变化。此外，还使用PL光谱获得校准曲线来全面表征配方中有效嵌入的CDs的数量（见支持信息中的图S4）。

DLS分析和ζ-电位测量显示了单峰粒度分布，平均水动力直径为（155 ± 2）纳米，表面电荷为（?28.7 ± 9）毫伏，与未加入CDs的配方所得结果完全一致（见图C、E和#C、G）。TEM显微图也证实了形成了尺寸一致的圆形纳米颗粒，其大小与DLS结果吻合良好，同时考虑了两种技术之间的固有差异（见图6D）。

在 increased excitation wavelengths（图6E）下记录的发射光谱显示配方中同时存在化合物1和CDs。具体来说，在较低的激发波长（300–320 nm）下，光谱轮廓和发射峰值与未包封的CDs（图6B）明显不同，更接近化合物1的发射特性（图2A）。相反，在较高波长下获取的光谱显示了与CDs相关的典型波长依赖性PL特征；然而，与原始纳米颗粒（图6B）相比，发射形状和强度都发生了变化，这是由于纳米载体系统中脂质环境的不同所致。

为了进一步阐明1-CD/NLCs的发光特性，对制备好的CDs和1-CD/NLC样品进行了TR-PL测量（图6F）。PL衰减曲线最适合用多指数拟合函数来描述，原始CDs的平均寿命（τavg）为（8.9 ± 0.3）纳秒，而1-CD/NLCs的平均寿命为（4.3 ± 0.3）纳秒。与分散在氯仿中的原始CDs相比，分散在水中的1-CD/NLCs的寿命缩短，这表明激发的电子存在非辐射复合路径。这些路径很可能归因于从有机溶剂转移到基于脂质的水环境时化学环境的变化以及分散介质的变化。此外，嵌入的CDs的衰减曲线不会趋近于零，这主要是由于NLC矩阵的残余散射效应。

在评估化合物1穿过血脑屏障（BBB）的能力之前，首先进行了初步研究，以评估所制备的基于NLC的配方对DI TNC1和bEnd-3细胞的生物相容性，这些细胞用于建立体外BBB模型。永生化非肿瘤性星形胶质细胞（DI TNC1）和非恶性脑内皮细胞（bEnd-3）分别与原始星形胶质细胞和脑内皮细胞有许多相似之处，因此特别适用于神经退行性疾病的研究和人工BBB的建立。如图所示，用游离化合物1处理24小时的两种细胞群体的存活率与对照组（100%）相当。用空NLCs、1-CD/NLCs或1/NLCs处理仅导致两种细胞系的存活率适度降低，但在所有测试浓度下仍保持在60%以上。这些发现进一步得到了细胞形态学显微镜评估的支持，未发现明显的细胞毒性损伤迹象。无论是星形胶质细胞（图7）还是内皮细胞（图8），在接受测试配方处理后均保持了典型的健康形态，膜完整性完好无损，没有细胞萎缩或脱落的迹象。总体而言，这些结果表明基于NLC的配方具有良好的生物相容性，并且在所探讨的实验条件下被两种细胞类型很好地耐受。

在评估化合物1封装在基于脂质的纳米载体中前后穿过血脑屏障（BBB）的能力之前，进行了初步研究，以评估所制备的基于NLC的配方的生物相容性。这些细胞被用来建立体外BBB模型。正如图和所示，用游离化合物1处理24小时的两种细胞群体的存活率与对照组相当（100%）。用空NLCs、1-CD/NLCs或1/NLCs处理仅导致这两种细胞系的存活率略有下降，但在所有测试浓度下仍保持在60%以上。这些发现进一步得到了细胞形态学显微镜评估的支持，未发现明显的细胞毒性损伤。这些结果表明，基于NLC的配方具有良好的生物相容性，并且在所探讨的实验条件下被两种细胞类型很好地耐受。

为了研究化合物1自由形式或封装在NLCs（1/NLCs）中对抗SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞中ROS生成的能力，在先前的研究中，Rullo等人测试了游离化合物1对抗SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞系中ROS生成的能力，这是研究神经退行性疾病最常用的细胞模型之一。尽管化合物1是一种MAO B抑制剂，而MAO B主要在星形胶质细胞中表达，但为了确保实验的连续性和与我们之前的工作直接可比，本研究仍然使用了相同的SH-SY5Y细胞系进行ROS测定，以评估将化合物1封装在NLCs中是否会影响其抗氧化性能。在测试其对ROS生成的影响之前，进行了初步实验以评估所制备的纳米配方对SH-SY5Y细胞存活率的影响。如图9A所示，用1/NLCs处理的SH-SY5Y细胞的存活率（相应的游离化合物1浓度范围从0.5到20微摩尔）与用游离化合物1处理的细胞相当。

在测试对ROS生成的影响之前，进行了初步实验以评估所制备的纳米配方对SH-SY5Y细胞存活率的影响。如图9A所示，用1/NLCs处理的SH-SY5Y细胞的存活率（相应的游离化合物1浓度范围从0.5到20微摩尔）与用游离化合物1处理的细胞相当。为了测试抗氧化活性，细胞用化合物1和封装在NLCs（1/NLCs）处理，处理浓度与Rullo等人之前使用的相同（5微摩尔）。如图9B所示，化合物1显著降低了ROS水平（p = 0.0014），证实了其内在的抗氧化活性。同样，封装在NLCs中的化合物1也保持了抑制ROS生成的能力（p = 0.0001）。此外，用空NLCs处理的细胞与用H2O2处理的细胞相比ROS水平没有显著降低（p = 0.1917），这表明在1/NLCs中观察到的抗氧化效果主要归因于化合物1本身，而不是NLCs的脂质纳米载体成分。结果还表明，将化合物1封装在NLCs中增强了其抑制ROS生成的能力（图9B）。抗氧化活性可能反映了TMP部分、吲唑支架的固有还原性能、在MAO-B抑制下减少的H2O2生成以及直接的自由基清除作用的综合贡献。1/NLCs相对于游离化合物1抑制ROS生成的能力提高了10%，这可能归因于NLCs通过增强细胞膜通透性或调节水溶性来改善化合物1的细胞内积累。在这方面，Mihailova及其同事46证明了由于脂质载体的疏水性，SH-SY5Y细胞对NLC的摄取可能遵循内吞作用的跨细胞转运途径，这使它们成为通过顶侧细胞膜进行有效运输的合适候选物。此外，Shubra等人47报告称，聚氧乙烯醚（如Kolliphor P188）可以整合到细胞膜中，改变其微粘度。而且，它们可以降低ATP水平，从而削弱外排转运蛋白的活性，这可能导致增强穿越血脑屏障（BBB）的能力。这些结果与上述研究一致，表明聚氧乙烯醚可能主要通过内吞作用而非被动扩散促进细胞摄取。48

最后，使用了一种体外BBB模型来评估基于脂质的纳米制剂增强神经保护剂1穿越BBB渗透性的能力。该模型是通过将小鼠bEnd-3细胞与DI TNC1共培养建立的，遵循Latronico等人31中之前描述的方案（图10A）。选择这种BBB模型是为了确保与我们之前建立并验证的用于研究其他作为MAO B抑制剂的人工合成的化合物的渗透性和转运的体外BBB方法的一致性。1 在纳米颗粒介导的递送系统中，实验的可重复性是一个关键参数。尽管本研究中使用的模型可能会低估BBB的生理紧密性（如TEER值较低且缺乏包括周细胞、基底膜组织以及与血流相关的剪切应力在内的完整结构和功能复杂性），但它提供了一个一致的平台，可以可靠地比较跨内皮运输和纳米载体介导的递送效果。

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10. (A) 用于研究游离化合物1和1-CD/NLCs穿越人工BBB的体外实验示意图。
(B) 直方图显示了穿越BBB模型的游离化合物1和1-CD/NLCs的数量，计算为下腔中化合物1含量相对于上腔初始含量的百分比。统计差异通过Student's t-test进行评估（*** = p < 0.001）。
(C) 直方图显示了(FITC-D)的Pa系数平均值，相对于不含细胞的对照组（CTRL）和含有bEnd3/星形胶质细胞共培养的对照组，在游离化合物1或1-CD/NLCs通过前后的测量值。Pa系数是通过下腔中通过的FITC-D量与上腔中剩余的FITC-D量之比计算得出的。统计差异通过单因素ANOVA后跟Tukey的事后检验进行评估。星号表示与CTRL相比具有统计学显著差异的值（** = p < 0.01）。数据代表n = 3次独立实验的平均值±标准差。

对于BBB渗透性实验，为了确保跨屏障后 quantification 的适当分析灵敏度，在transwell插片的顶侧腔中加入了20 μM的化合物1，无论是游离形式还是封装在CD/NLCs（369 μg/mL）中的1-CD/NLCs。值得注意的是，1/NLCs和1-CD/NLCs在流体力学直径（PDI）或ζ-电位方面没有显著差异（见图C,E和#C,G）。表面电荷不变表明CDs主要局限于脂质芯内，而不是暴露在NLC界面。由于纳米颗粒与BBB的相互作用和细胞摄取在很大程度上受颗粒大小、表面电荷和胶体稳定性的控制，预计这两种制剂在屏障相互作用方面会表现出相似的行为。经过2小时孵育后，通过PL光谱法量化了穿过细胞单层的化合物1和1-CD/NLCs的量。选择2小时的孵育时间是基于初步的时间进程研究，该时间点被认为是保持细胞活力和屏障完整性的同时允许可靠检测游离化合物1和1-CD/NLCs封装的化合物之间转运差异的最佳条件。如图10B所示，通过NLCs递送的化合物1的穿透率显著更高（26 ± 2%），而游离分子仅为2.6 ± 1.1%（p < 0.001），这突显了纳米制剂的增强渗透效率。通过PL信号测得的1-CD/NLC制剂的Pe系数为（6.7 ± 0.5）× 10–6 cm s–1，证实了纳米制剂的有效跨屏障转运。值得注意的是，在下腔中检测到的封装在NLCs中的化合物1的量（26 ± 2%）大约相当于ROS实验中使用的浓度（5 μM）。

为了确保纳米制剂的穿越不会损害基于细胞的层的完整性，在处理前和处理后都对FITC异硫氰酸酯–葡聚糖（FITC-D，4 kDa）这一跨细胞转运的标记物的Pa进行了评估。如图10C所示，无论是给予游离化合物1还是1-CD/NLC制剂后，共培养BBB模型的Pa系数分别保持在（3.0 ± 0.4）× 10–6 cm/s和（2.9 ± 0.2）× 10–6 cm/s，与处理前的Pa值（3.2 ± 0.3）× 10–6 cm/s相比有显著下降（p < 0.01）。这个值显著低于在无细胞的情况下涂有聚-L-赖氨酸（PLL）和I型胶原的对照组插片的值（（9.0 ± 0.2）× 10–6 cm/s）。这些结果共同证实，基于NLC的递送系统能够增强药物活性分子穿越BBB的转运，而不会损害体外BBB模型的结构或功能完整性。

在最近的一篇论文中，其他作者证明了将多奈哌齐（一种用于治疗AD的胆碱酯酶抑制剂）封装在固体脂质纳米颗粒中可以改善其渗透性、药效和稳定性，证实了这种方法在靶向中枢神经系统（CNS）层面的新合成药物方面的应用潜力，克服了穿越BBB的困难。49, 50, 51。与先前报道的研究相比，为多奈哌齐和利凡斯的明等药物开发的基于脂质的制剂通常能够实现约2-5倍的增强比率。52, 53。在此背景下，我们研究中观察到的约10倍的增加表明，当前系统在增强药物跨屏障转运方面的性能可能有所提升。这种效果可能与多种制剂参数有关，包括优化的颗粒大小（约150 nm）、NLCs的选定脂质组成、化合物1的亲脂性以及Kolliphor P188的存在，后者可能有助于纳米结构的稳定并可能调节外排过程。这些结果尤为重要，因为尽管通过平衡亲脂性和分子量来合理设计许多FDA批准的的小分子药物，但只有不到2%的小分子能够穿越完整的BBB。54实际上，Lipinski等人55确定分子量和亲脂性是控制小分子跨生物膜被动扩散的关键物理化学参数。对于CNS活性化合物来说，当分子量从200 Da增加到450 Da时，BBB的渗透性通常会降低约100倍，这是设计用于大脑递送的药物的一个关键限制。然而，为了达到最佳治疗效果，小分子不仅需要对分子靶点具有高效力和选择性，还必须在靶点处具有足够的生物利用度。54另一个挑战是小分子与血清蛋白（尤其是人血清白蛋白）的非特异性结合，这会增加有效分子大小并阻碍BBB的渗透。56这种可逆的结合会减少可用于穿越BBB的游离药物比例，因为只有未结合的分子才能穿过屏障。57, 58此外，许多静脉注射的小分子会受到血清酶的快速代谢降解，进一步减少了它们在大脑中的可用性。59此外，位于BBB内皮腔表面的P-糖蛋白（P-gp）的高表达构成了CNS药物递送的主要障碍。作为ATP依赖性外排泵，P-gp主动将多种外源物质从大脑重新输送到血液中，从而限制了CNS的积累并有助于神经保护。60我们的发现表明，将化合物1封装在Kolliphor P188稳定的NLCs中可以提高其BBB渗透性和药理可用性，从而克服了上述多个限制。尽管在本研究中没有具体研究这种增强的精确机制，但可以推测这些机制可能涉及调节外排转运蛋白和/或促进内源性转运途径。值得注意的是，表面活性剂Kolliphor P188已被证明在其他实验设置中可以抑制P-gp的功能并增强BBB的跨膜转运。61, 62, 63, 64, 65然而，化合物1是否是P-gp的底物仍有待阐明。

应当注意的是，这里报告的所有发现都仅来自体外实验模型。因此，未来的研究需要通过稳定性评估和在生理相关条件下的生物相容性评估来评估这种纳米制剂的系统递送潜力，包括在全血和血清中的研究。此外，还需要进行全面的体内药代动力学研究，如血浆暴露谱分析、大脑生物分布和BBB渗透效率评估。还需要在适当的神经炎症和神经退行性疾病动物模型中验证治疗效果和安全性。由于尚未进行体内研究，关于该系统治疗适用性的结论仍属初步。尽管如此，这些结果为这种纳米制剂作为潜在的CNS递送策略提供了概念验证框架，支持其进一步的临床前开发。

结论

在本研究中，我们证明了将小分子MAO B抑制剂化合物1封装在NLCs中可以提高其抑制ROS产生的能力，相比于游离分子。使用人工BBB模型的体外研究进一步表明，纳米制剂能够有效促进活性化合物1的跨屏障转运，同时保持其结构和功能的完整性。总体而言，这些结果突显了NLC平台在提高化合物1的生物活性和大脑递送方面的潜力。该纳米制剂表现出良好的细胞耐受性，并在神经细胞中保持抗氧化效果，支持其作为靶向神经疾病相关机制的递送策略的进一步开发。这里呈现的发现为后续的临床前开发奠定了坚实的实验基础。未来的研究将重点评估系统递送潜力，包括在生理相关条件下的稳定性和生物相容性，以及药代动力学分析和大脑生物分布。在已建立的神经炎症和神经退行性疾病模型中验证治疗效果将进一步明确这种方法的转化潜力。总体而言，我们的结果为使用基于NLC的纳米制剂增强小分子药物的CNS递送提供了强有力的概念验证，支持其在神经退行性疾病中的潜在应用。

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