《Journal of Biochemical and Molecular Toxicology》：Zebularine Boosts Imatinib Efficacy in Cells of Colorectal Cancer via Wnt-Survivin-P-Glycoprotein Pathway
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结直肠癌（CRC）仍是癌症死亡的主要原因之一，生存率低于15%。伊马替尼（IM）和泽布拉林（ZEB）单独使用在CRC治疗中显示出潜在效果，但其联合应用尚未得到充分研究。本研究调查了IM和ZEB在结肠癌细胞中的潜在作用，旨在为CRC管理提供一种新型治疗制剂。研究
结直肠癌（CRC）仍是癌症死亡的主要原因之一，生存率低于15%。伊马替尼（IM）和泽布拉林（ZEB）单独使用在CRC治疗中显示出潜在效果，但其联合应用尚未得到充分研究。本研究调查了IM和ZEB在结肠癌细胞中的潜在作用，旨在为CRC管理提供一种新型治疗制剂。研究人员评估了经IM、ZEB及其组合处理的HCT-116细胞的细胞生长抑制、氧化应激标志物和细胞周期进程。通过液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）分析ZEB摄取水平，流式细胞术定量细胞凋亡，qPCR分析基因表达变化。研究人员评估了转移标志物、凋亡调节因子和表皮生长因子受体（EGFR）的表达。IM和ZEB均以浓度依赖性方式抑制细胞生长，且两者联用显示协同效应。联合治疗显著增强了氧化应激，增加了细胞凋亡和坏死，并诱导了显著的S期阻滞。联合处理降低了转移标志物（MMP9、MMP2）的表达，上调了凋亡标志物Caspase-9，并显著下调了关键凋亡调节因子Bcl-2蛋白的表达。值得注意的是，联合治疗还显示出对EGFR水平的显著抑制作用。IM和ZEB联用通过诱导氧化应激、促进细胞凋亡及调节参与转移和凋亡的关键基因，在CRC管理中显示出广阔前景。未来需在临床前和临床环境中进一步验证其应用。
研究背景与意义
结直肠癌（CRC）在全球范围内发病率居第三位，死亡率居第二位，约四分之一的晚期CRC病例确诊时已发生转移。尽管化疗和靶向药物的应用改善了治疗现状，但耐药性导致预后仍然较差。酪氨酸激酶抑制剂（TKI）伊马替尼（IM）虽在其他肿瘤中应用广泛，但在CRC治疗中面临耐药性问题。泽布拉林（ZEB）作为一种稳定的DNA甲基化抑制剂，能够重新激活沉默的抑癌基因。本研究由Fatma M. Abdelwahed、Mervat M. Omran、Abeer Elkhoely、Yasmin M. Attia和Samia A. Shouman共同完成，旨在探索IM与ZEB联用在HCT-116结直肠癌细胞系中的协同治疗潜力，该研究成果发表于《Journal of Biochemical and Molecular Toxicology》。
关键技术方法
研究人员采用磺酰罗丹明B（SRB）法测定细胞活力并计算联合指数（CI）。通过液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）检测细胞内药物摄取量。利用流式细胞术结合碘化丙啶（PI）染色分析细胞周期分布，并通过Annexin V/PI双染法定量细胞凋亡。此外，研究还通过实时荧光定量PCR（qPCR）检测凋亡与转移相关基因mRNA水平，利用蛋白质印迹法（Western blotting）检测Survivin、P-糖蛋白（P-gp）、Wnt及SIRT1等关键蛋白表达，并采用划痕愈合实验评估细胞迁移能力。
研究结果
1. 细胞活力与协同效应
IM和ZEB单独处理均呈浓度依赖性抑制HCT-116细胞生长，IC50分别为17 μM和40 μM。当IM与ZEB联用时，ZEB的IC50降至20 μM。等温线图分析显示，两药联用的CI值小于1，证实其为协同效应，其中4 μM IM与20 μM ZEB的组合效果最佳（Fa=0.5, CI=0.61364）。
2. 细胞周期阻滞
单药处理中，IM引起32.31%的细胞发生S期阻滞，ZEB引起25.93%，而未处理组为19.20%。联合处理后，S期阻滞比例显著增加至69.8%，表明联合疗法能更有效地阻断细胞增殖。
3. 细胞凋亡
联合治疗组的早期凋亡率为2%，虽略高于单药组，但坏死率高达70.54%，远高于单药组（IM: 73.8%, ZEB: 72.2%）和对照组（3.3%）。这表明联合治疗通过诱导凋亡和坏死双重机制发挥强效杀伤作用。
4. 药物摄取机制
LC-MS/MS分析显示，与ZEB单药组相比，联合组中ZEB的细胞内摄取量显著增加（p=0.01），而IM的摄取量未受显著影响。这提示IM可能通过抑制转运体介导的外排或促进内流，增加了ZEB的胞内积累。
5. 氧化应激水平
联合治疗组表现出显著的氧化损伤特征。丙二醛（MDA）和硝酸盐/亚硝酸盐（NOx）水平较IM单药组分别增加了20%和105.8%，同时还原型谷胱甘肽（GSH）含量较IM组下降了34.9%。
6. 分子标志物调控
qPCR结果显示，联合治疗显著下调转移相关基因MMP9和MMP2，上调促凋亡基因Caspase-9，并显著下调抗凋亡基因Bcl-2。此外，联合治疗使EGFR水平降低了55%，优于单药效果（IM: 25%, ZEB: 18%）。
7. 信号通路蛋白表达
Western blotting结果显示，联合治疗组Survivin、P-糖蛋白（P-gp）、Wnt及SIRT1的蛋白表达水平均呈显著下调，且下调幅度大于单药组。
8. 细胞迁移能力
划痕愈合实验显示，联合治疗组的伤口愈合率最低（约60%），显著低于对照组（~90%）及单药组（ZEB: ~65-70%, IM: ~65-70%），证实联合用药能有效抑制肿瘤细胞迁移。
讨论与结论
研究人员指出，尽管CRC治疗取得了进展，但耐药性问题导致患者五年生存率仍不足15%。本研究证实，IM与ZEB联用通过多重机制发挥协同抗肿瘤作用。首先，IM改变了细胞膜转运体（如hOCTs）的功能状态，显著增加了ZEB的细胞内摄取。其次，联合治疗打破了氧化应激平衡，通过升高MDA和NOx水平并耗竭GSH，诱导了强烈的细胞毒性。在分子层面，联合治疗通过下调Wnt/SIRT1信号通路，抑制了Survivin和P-gp的表达，从而阻断了肿瘤干细胞的存活机制并逆转了多药耐药表型。此外，对MMP9/2的抑制和对Caspase-9/Bcl-2轴的调节，有效遏制了肿瘤的侵袭转移并促进了细胞凋亡。综上所述，该研究揭示了IM联合ZEB作为一种针对CRC的新型治疗策略潜力，特别是在克服传统化疗耐药方面具有重要意义，建议后续在临床前模型中进一步验证其疗效与安全性。
