纤毛基因CEP41的孤独症谱系障碍突变影响人类皮质类器官模型中投射神经元和中间神经元的发育

《Molecular Psychiatry》：ASD mutations in the ciliary gene CEP41 impact development of projection neurons and interneurons in a human cortical organoid model

摘要：初级纤毛控制细胞间信号传导，其功能障碍与孤独症谱系障碍（ASD）有关，但其在ASD发病机制中的作用仍未得到充分探索。在此，研究人员利用人类皮质类器官分析了ASD突变对CEP41的影响。CEP41编码一种位于基体和纤毛轴丝的中心体蛋白，在ASD个体和Joubert综合征（一种具有高发病率ASD的纤毛病）患者中发生突变。为了深入了解CEP41在ASD发病机制中的作用，研究人员表征了携带ASD个体中发现CEP41 R242H点突变的人类皮质类器官。该突变不干扰CEP41的纤毛定位，但纤毛变短且微管蛋白多聚谷氨酰化水平降低，这表明纤毛稳定性和信号传导发生改变。此外，单细胞RNA测序（scRNAseq）分析显示，突变中间神经元及其祖细胞中几个在中间神经元发育中起关键作用的转录因子表达发生改变。CEP41突变还导致上层皮质神经元形成增加。综上所述，这些发现表明CEP41控制兴奋性和抑制性神经元的分化，其改变可能导致兴奋/抑制（E/I）失衡，这被广泛认为是神经发育障碍的汇聚机制。

论文解读：CEP41的ASD突变通过纤毛功能障碍扰乱人脑类器官神经发育

研究背景与立项依据

孤独症谱系障碍（ASD）是一种复杂的神经发育疾病，其核心症状被认为与大脑中兴奋性（谷氨酸能）与抑制性（GABA能）信号的失衡（E/I imbalance）密切相关。近年来的研究表明，初级纤毛作为细胞的“天线”，在神经发育的信号转导中起着核心作用，其功能障碍与多种神经发育障碍及ASD相关。CEP41是一个与Joubert综合征和ASD相关的纤毛基因，编码一种定位于基体和纤毛轴丝的蛋白，负责调控微管蛋白的多聚谷氨酰化。尽管CEP41的突变已在ASD患者中被发现，但该突变如何影响哺乳动物大脑发育，特别是在人类背景下如何导致皮质环路异常的机制尚不明确。为此，研究人员利用人类诱导多能干细胞（iPSC）衍生的皮质类器官模型，深入探究了CEP41 R242H突变对背侧（皮质）和腹侧（中间神经元前体）端脑组织区域发育的具体影响。该研究成果最终发表在《Molecular Psychiatry》杂志上。

关键技术方法概述

本研究采用了多项前沿技术。首先，研究人员利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了携带CEP41 R242H杂合及纯合突变的iPSC细胞系。随后，分别采用改良的Lancaster方案和Pasca实验室的方案，将iPSC分化为皮质类器官和腹侧端脑类器官。在表型分析方面，结合了免疫荧光染色观察纤毛结构及相关蛋白定位，并通过蛋白质印迹（Western blot）验证蛋白表达。最为关键的是，研究使用了10x Genomics平台进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq），并对数据进行了严格的生物信息学分析，包括SoupX去污染、Seurat聚类、伪批量差异表达分析及CellChat细胞通讯推断。此外，还通过qRT-PCR验证了特定信号通路的变化。

研究结果

CEP41突变体的生成与初步表征

研究人员通过CRISPR/Cas9技术成功构建了携带CEP41 R242H突变的iPSC系。Western blot和免疫荧光分析显示，该突变并未影响CEP41蛋白的稳定性及其在基体或纤毛轴丝的定位，排除了蛋白截短或错位的可能性，确立了该突变为功能丧失型突变的研究基础。

CEP41突变改变皮质祖细胞发育与谷氨酸能投射神经元生成

通过对第38天（D38）皮质类器官的单细胞测序分析，研究人员未发现背侧端脑谱系中祖细胞与兴奋性神经元比例发生显著变化。然而，在对第94天（D94）的晚期类器官分析中，情况发生了变化。数据显示，突变体中外层放射状胶质细胞（oRG）的比例显著增加，这是一种与人类大脑皮层扩张密切相关的祖细胞类型。免疫荧光染色进一步证实了这一点，并显示上层皮质神经元（以SATB2为标记）的数量显著增加，而深层神经元（以TBR1为标记）相对减少。这一结果表明，CEP41突变促进了神经发生的时序改变，导致晚期出生神经元亚群的过度生成。

CEP41突变体类器官中中间神经元发育异常

在腹侧端脑谱系的分析中，虽然祖细胞与中间神经元的总体比例未发生显著改变，但基因表达谱发生了剧烈变化。在D38类器官中，研究人员发现多个中间神经元亚群及其祖细胞中，关键发育调控因子的表达显著下调。特别是核受体NR2F1和NR2F2，它们在所有突变的祖细胞和中间神经元群体中均表现出强烈的下调趋势。基因本体（GO）分析显示，受影响的生物学过程包括“轴突发生”、“GABA能中间神经元分化”和“神经元迁移”。此外，通路分析显示突变组基因与SFARI数据库中的ASD候选基因存在显著重叠，提示这些转录组改变具有直接的疾病相关性。

CEP41突变影响微管蛋白多聚谷氨酰化与IFT运输

从机制上讲，研究人员发现CEP41 R242H突变虽然不影响蛋白定位，但导致了纤毛内微管蛋白多聚谷氨酰化水平的显著降低，同时伴随着纤毛长度的缩短。进一步分析显示，负责顺行运输的IFT88在纤毛轴丝及顶端的表达量下降，而负责逆行运输的IFT144则未受影响。这表明CEP41通过调控微管稳定性来维持正常的纤毛内运输（IFT），其功能缺失导致纤毛信号传导能力下降。

讨论与结论

本研究表明，CEP41 R242H突变通过破坏纤毛的结构完整性（表现为多聚谷氨酰化降低和IFT88减少）损害了初级纤毛的功能。这种纤毛功能的损伤进而干扰了Shh信号通路（表现为SMO膜定位和GLI1表达降低）以及下游关键转录因子（如NR2F1/2、DLX家族）的正常表达程序。最终导致的结果是：一方面，背侧皮质的oRG细胞扩增和上层神经元过度生成；另一方面，腹侧来源的中间神经元发育受阻。这种对兴奋性投射神经元和抑制性中间神经元发育的双向干扰，很可能导致了皮质回路中关键的E/I平衡失调，从而为ASD的神经生物学机制提供了一个基于人类模型的解释。该研究强调了初级纤毛在维持人类大脑皮层正常发育中的核心地位，并为理解ASD的病理生理学提供了新的分子视角。