Stochastic growth and ligand–receptor interaction-mediated stabilization generate stereotyped dendritic arbors 随机生长与配体-受体相互作用介导的稳定化塑造模式化树突树

《Nature Neuroscience》：Stochastic growth and ligand–receptor interaction-mediated stabilization generate stereotyped dendritic arbors

　　

摘要 模式化的树突树是在神经元发育过程中通过动态且随机的生长形成的。目前尚不清楚导向受体（guidance receptors）和配体如何协调分支的动态生长、退缩和稳定化以特化树突树。研究人员此前表明，细胞外粘附配体SAX-7/L1CAM通过结合导向受体DMA-1（一种单跨膜粘附分子）决定了秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）PVD感觉树突精细且模式化的形状。在此，研究人员对DMA-1进行了结构-功能分析，意外发现稳健、随机的树突生长并不依赖于配体结合。相反，配体接触可防止树突退缩，抑制异位生长并特化树突形状。此外，研究人员证明树突生长需要一个无配体的DMA-1池，该池通过受体内吞作用（endocytosis）和通过循环内体（recycling endosomes）重新插入质膜来维持。内吞缺陷的突变体显示出严重截短的树突。研究人员提出了一个模型，其中无配体的导向受体介导内在的、随机的树突生长，而细胞外配体则通过抑制生长来指导树突形状。

论文解读：随机生长与配体介导的稳定化共同塑造模式化树突树

研究背景与立项依据

树突树的尺寸和形状由细胞内在机制（包括转录因子和细胞骨架调节因子）、细胞间或细胞-基质相互作用（导向线索与受体）以及活动依赖性机制共同决定。成像研究显示，树突发育是一个动态且随机的过程，单个发育中的树突在多种物种中经历着树突起始、生长和退缩的循环。然而，目前尚不清楚导向受体及其细胞外配体如何介导这些复杂的动态生长过程以构建具有模式化树突树的成熟神经元。本研究聚焦于秀丽隐杆线虫的感觉神经元PVD，该神经元具有巨大且分支丰富的树突树。PVD树突的形状由靶组织表达的三个细胞外线索（SAX-7、MNR-1、LECT-2）以及树突上的受体复合物（DMA-1和HPO-30）决定。尽管已知DMA-1需要所有三个配体来特化PVD树突在皮肤和肌肉之间细胞外空间的生长和分支，但KPC-1/furin如何通过其转化酶（convertase）活性调节树突生长，以及为何kpc-1(null)中DMA-1水平升高会导致PVD树突严重缺失，此前仍不清楚。

关键技术方法

本研究主要采用秀丽隐杆线虫PVD神经元作为模型，结合CRISPR-Cas9基因组编辑技术构建特定突变体（如dma-1(ΔLRR)、hpo-30(R186A)等）。利用活体荧光显微镜（包括转盘共聚焦显微镜和双光子显微镜）进行时间序列成像（Time-lapse imaging）以量化树突的动态生长与退缩。采用荧光漂白恢复（FRAP）技术分析DMA-1的流动性。通过荧光共振能量转移（FRET）结合荧光寿命成像显微术（FLIM）检测下游CED-10/Rac1信号活性。此外，还利用了免疫共沉淀（Co-IP）和蛋白质免疫印迹（Western blot）等生化手段验证蛋白间的相互作用及剪切情况。

研究结果

Ligand-free DMA-1 receptor supports dendritic growth（无配体DMA-1受体支持树突生长）

通过对DMA-1进行结构-功能分析，研究人员构建了删除整个亮氨酸富集重复序列（LRR）结构域的内源性突变体dma-1(ΔLRR)。结果显示，该突变体表现出旺盛但紊乱的树突分支，与sax-7(null)突变体表型相似，但与dma-1(null)的严重树突缺失截然不同。这表明DMA-1的跨膜和胞内结构域足以促进树突的生长和分支，而不依赖于其配体结合域。

Ligand-bound DMA-1 receptor stabilizes dendritic branches（配体结合的DMA-1受体稳定树突分支）

通过时间序列成像观察不同发育阶段野生型与突变体的树突行为，发现野生型PVD在L3阶段表现出活跃的分支添加与退缩，而在L4阶段完全发育后转为稳定状态。相比之下，配体突变体（如sax-7(null)、dma-1(ΔLRR)）在L4阶段仍持续表现动态性。通过将SAX-7和MNR-1特异性表达在机械感觉神经元PLM中，研究人员观察到接触这些配体的树突表现出更低的退缩率和更短的总退缩长度，证实了配体结合通过抑制持续的动态性来稳定发育中的树突。

The LRR of DMA-1 is dispensable for dendrite outgrowth（DMA-1的LRR结构域对树突长出非必需）

研究人员构建了分别缺失胞内域（ΔICD）的DMA-1和HPO-30突变体。结果显示，当HPO-30和DMA-1的胞质尾部均被删除时，四级分支几乎完全消失。令人惊讶的是，在hpo-30(ΔICD); dma-1(ΔICD)/dma-1(ΔLRR)转基因动物中，DMA-1被拆分为两个独立的半分子（一个含胞外域，一个含胞内域），仍能支持有序的树突 menorah 结构形成。这支持了DMA-1的胞外和胞内功能可以由独立蛋白实现的观点。

Diffusible ligand-free DMA-1 is responsible for promoting dendritic growth（可扩散的无配体DMA-1负责促进树突生长）

利用内源性标记的DMA-1::GFP，研究人员鉴定出两个DMA-1池：一个是沿树突分布的弥散可移动池，另一个是RAB-10阳性的细胞内囊泡池。在sax-7(null)突变体中，与RAB-10共定位的DMA-1斑点显著减少，而膜上弥散信号增加。FRAP实验显示，在没有配体的情况下，DMA-1的回收速度更快。这表明SAX-7结合诱导了DMA-1内化进入RAB-10阳性循环内体，从而产生无配体的DMA-1池。

KPC-1 cleaves HPO-30（KPC-1剪切HPO-30）

Western blot分析显示，HPO-30::GFP在野生型中存在全长形式和C端剪切片段，而在kpc-1(null)突变体中仅存全长形式，表明HPO-30的剪切依赖于KPC-1。果蝇S2细胞实验进一步证实，furin抑制剂能阻断HPO-30的剪切。扫描HPO-30序列发现furin识别基序‘RXXR’，将R186或R189突变为丙氨酸（R186A）消除了剪切产物。

HPO-30 cleavage is required for dendritic growth and DMA-1 internalization（HPO-30剪切是树突生长和DMA-1内化所必需的）

在体内构建的hpo-30(R186A)突变体表现出与hpo-30(null)相似的树突严重缺失表型。重要的是，该突变体中DMA-1::GFP的细胞内斑点显著减少，且与RAB-10的共定位降低，而质膜信号增强。这表明HPO-30被KPC-1剪切后，促进了DMA-1-HPO-30复合物的内吞作用。

Endosomal DMA-1 is important for PVD dendrite development（内体DMA-1对PVD树突发育至关重要）

遗传筛选鉴定出dma-1(C470Y)突变体，该突变位于胞外近膜区，导致DMA-1无法有效内化，表型与kpc-1(null)和hpo-30(R186A)类似。FRAP分析显示，在这些内吞缺陷突变体中，移除配体SAX-7可使DMA-1::GFP的恢复速度显著加快，表明配体结合将DMA-1固定在质膜上。双突变体（如kpc-1(null); sax-7(null)）比单突变体表现出更长的树突分支，进一步证实了无配体DMA-1的可移动池对生长至关重要。

DMA-1 recycling promotes DMA-1 diffusion into nascent dendrites（DMA-1循环促进DMA-1扩散至新生树突）

时间序列成像显示，在内吞循环缺陷突变体中，树突丝状伪足（filopodia）虽然能够起始，但无法延伸超过1.5 μm便会退缩。定量分析表明，DMA-1::GFP进入新生树突的速度和富集程度在这些突变体中显著降低。FLIM实验测量CED-10::GFP的寿命发现，dma-1(ΔLRR)突变体与野生型相似（高Rac1活性），而hpo-30(R186A)与dma-1(null)相似（低Rac1活性）。这支持了配体结合抑制生长，而HPO-30介导的DMA-1循环是其信号激活所必需的这一结论。

结论与讨论

本研究揭示了配体-受体系统介导随机树突生长以构建模式化树突树的新模型。首先，SAX-7与质膜上的DMA-1相互作用，稳定树突分支并基于SAX-7的定位构建树突树。其次，SAX-7诱导DMA-1内吞并将其驱入RAB-10内体，在此过程中DMA-1与其跨膜配体解离成为无配体状态。第三，一旦受体通过循环内体在质膜上重新插入，无配体的DMA-1便扩散至新生丝状伪足并促进动态、随机的生长。该循环在随机生长与模式化树突树之间提供了分子机制联系，即无配体受体促进随机、动态的生长，而配体结合的受体则稳定树突并抑制动态生长以实现树突形态。这项工作发表于《Nature Neuroscience》。