基于Olink蛋白质组学发现的PEA驱动的临床验证：INPP1和ARHGAP25血清生物标志物改善早期乳腺癌诊断

《Translational Oncology》：Clinical validation of PEA-driven Olink proteomic discovery: INPP1 and ARHGAP25 serum biomarkers improve early breast cancer diagnosis

　　

背景：乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤，占所有女性癌症相关死亡的15%。由于目前的血清生物标志物（如CA15-3、CEA）灵敏度有限以及影像学/活检方法的侵入性，乳腺癌的早期检测仍具挑战性。本研究旨在利用Olink蛋白质组学鉴定新的乳腺癌诊断标志物，并将其整合至多蛋白诊断模型中以提高早期检测的准确度。方法：在发现队列（15例乳腺癌患者 vs 16例健康对照）中通过Olink的邻近延伸分析（PEA）进行血清蛋白质组学分析。差异表达蛋白经分析用于构建诊断模型，并在独立队列（111例乳腺癌患者[56例早期，55例晚期] vs 95例健康对照）中进行验证。结果：INPP1（首次报道在乳腺癌血清中下调）和ARHGAP25的组合显示出高诊断准确度，AUC分别为0.8458（发现队列）和0.8506（验证队列）。值得注意的是，该模型在早期检测中保持了效力（AUC = 0.7598）。结论：本研究鉴定了一种新型血清蛋白组合（INPP1/ARHGAP25）作为乳腺癌诊断的微创工具，对早期筛查具有特别价值。研究结果强调了蛋白质组学驱动的生物标志物发现解决临床未满足需求的潜力。

论文深度解读：基于Olink蛋白质组学的乳腺癌新型血清标志物发现与验证

研究背景与立题依据

乳腺癌已超越肺癌成为女性发病率最高的恶性肿瘤，全球每年新发病例约230万。尽管筛查手段普及改善了预后，但其早期诊断率仍不足30%，这构成了全球公共卫生的重大挑战。现有临床常用的血清标志物CA15-3和CEA虽然在晚期乳腺癌中灵敏度可达75%-90%，但在早期诊断中的效能不明确，未被推荐为早期标志物。因此，开发具有高灵敏度的非侵入性新型诊断标志物迫在眉睫。近年来，液体活检技术发展迅速，其中蛋白质作为大多数细胞功能的直接执行者和药物治疗的直接靶点，在揭示组织特异性信息和确定肿瘤来源方面具有独特优势。Olink平台基于邻近延伸分析（PEA）技术，能够以超高灵敏度（fg/mL级别）和特异性检测低丰度蛋白，仅需微量血清即可同时分析超过1500种蛋白，为解决传统蛋白质组学检测瓶颈提供了理想工具。本研究正是基于此背景，旨在通过Olink蛋白质组学筛选并验证乳腺癌的新型血清诊断标志物。

关键技术方法概述

本研究采用前瞻性标本收集和回顾性巢式病例对照设计。研究人员依托哈尔滨医科大学附属第四医院，构建了发现队列（15例患者 vs 16例对照）和验证队列（111例患者 vs 95例对照）。核心技术手段包括：利用Olink Explore Oncology III Panel进行血清蛋白质组学检测，该技术基于PEA原理实现高通量分析；通过生物信息学分析差异表达蛋白（DEPs）并进行基因本体（GO）与京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析；采用酶联免疫吸附试验（ELISA）在独立大队列中对筛选出的候选标志物进行跨平台验证；运用受试者工作特征（ROC）曲线评估诊断效能，并通过Spearman相关性分析探讨标志物与临床病理特征的关系。

研究结果详解

1. 研究对象基线特征

研究人员详细记录了发现队列和验证队列的临床病理特征。发现队列包含15例乳腺癌患者（9例早期，6例晚期）和16例健康对照；验证队列包含111例患者（56例早期，55例晚期）和95例对照。两组人群在年龄、身高、体重等方面无统计学差异，确保了后续比较的可靠性。

2. Olink分析乳腺癌肿瘤差异蛋白

通过Olink蛋白质组学对比乳腺癌组与健康对照组的92种肿瘤相关蛋白表达水平，研究人员鉴定出27个差异表达蛋白（DEPs），且全部呈下调趋势。火山图和热图直观展示了这些蛋白的表达谱变化及样本聚类情况，提示乳腺癌患者血清中存在特定的蛋白质组学特征。

3. 乳腺癌与健康对照差异表达蛋白分析

对27个DEPs进行的GO功能富集分析显示，前20个显著富集条目主要涉及信号转导、细胞质定位和细胞内过程。KEGG通路分析则识别出C型凝集素受体（CLR）信号通路、类风湿关节炎相关通路及造血细胞调控等通路。这表明差异蛋白广泛参与免疫调节和细胞内信号网络重构。

4. 乳腺癌候选标志物的筛选

针对Olink鉴定出的前五个显著差异蛋白进行ROC分析。研究人员构建了多蛋白诊断组合，其中五种蛋白组合的AUC达到0.9125。为了筛选出具有乳腺癌特异性的标志物，研究人员将乳腺癌与其他疾病（肝癌、肺癌、结直肠癌及类风湿关节炎，共16例）进行对比。结果显示，INPP1和ARHGAP25的组合在区分乳腺癌与其他疾病时AUC达到0.7936，优于INPP1/UBAC1组合。鉴于其在排除混杂疾病方面表现出的优越敏感性，研究人员最终选定INPP1/ARHGAP25作为最终的候选生物标志物对。

5. ELISA验证INPP1和ARHGAP25

研究人员利用ELISA技术在验证队列中对选定的标志物进行了定量验证。结果显示，INPP1和ARHGAP25在乳腺癌患者血清中均呈下调，且在晚期乳腺癌中下调更为显著，这与Olink检测结果一致。在总体乳腺癌诊断中，INPP1的AUC为0.8044，ARHGAP25的AUC为0.7273。重要的是，在早期乳腺癌中，两者的AUC分别为0.7130和0.6348，证明了其在早期病变中的检测潜力。

6. INPP1和ARHGAP25蛋白模型在乳腺癌中的诊断性能

联合模型在Olink发现队列中的AUC为0.846。经ELISA验证，INPP1与ARHGAP25的组合在所有乳腺癌患者中的AUC达到0.8506，灵敏度73.9%，特异性84.2%。尤为关键的是，该组合在早期乳腺癌（I-II期）中的AUC达到0.7598，而在晚期（III-IV期）更是高达0.9483，特异性达98.1%。

7. INPP1和ARHGAP25与分子分型及增殖活性的相关性

研究人员进一步分析了标志物与分子分型的关系。结果显示，INPP1和ARHGAP25在HER-2阳性乳腺癌中的表达显著低于Luminal型，而在三阴性乳腺癌（TNBC）中表达最高（P < 0.0001）。此外，INPP1和ARHGAP25的表达均与Ki-67呈中度负相关（r值分别为-0.3431和-0.5541），提示这两个蛋白可能通过抑制细胞周期进程发挥抗癌作用。

讨论与结论总结

讨论部分总结

研究人员在讨论中指出，乳腺癌发病率持续上升，寻找新的诊断标志物至关重要。与传统蛋白质组学相比，Olink技术克服了低丰度蛋白检测的局限。本研究鉴定的27个下调蛋白富集于CLR通路，提示肿瘤微环境中可能存在广泛的免疫调节或抑制状态。关于机制，ARHGAP25此前已被报道通过ARHGAP25/Wnt/ASCL2反馈环抑制癌细胞增殖，而INPP1则涉及糖酵解重编程。本研究首次报道了INPP1与乳腺癌的关联及其血清水平的下调，这种循环蛋白特征提示其分泌模式可能与组织表达不同。虽然传统标志物CA15-3和CEA在早期诊断中AUC<0.65，但本研究的INPP1/ARHGAP25联合模型在早期乳腺癌中AUC达0.7598，提升了超过15%。此外，该组合在晚期乳腺癌中表现出极高的特异性（98.1%），且晚期患者血清水平显著低于早期，表明其可作为疾病严重程度的潜在指标。研究人员也坦承了样本量较小及尚未深入机制研究的局限性，建议未来结合多组学研究和构建基因敲除小鼠模型进一步探索。

结论翻译

本研究结合Olink蛋白质组学和多种蛋白组合策略，通过随后的ELISA验证确定了INPP1和ARHGAP25在乳腺癌中的诊断功效。研究人员首次发现了INPP1与乳腺癌的关联，并首次检测到ARHGAP25在乳腺癌血清中的蛋白表达水平。这两种蛋白的联合应用显著提高了早期乳腺癌的诊断效率。