时间延迟图像分析显示，在NLRP3炎性体中，ASC颗粒的寿命存在与触发因素相关的差异

《Scientific Reports》：Time-lapse image analysis reveals trigger-dependent differences in ASC speck lifetime in the NLRP3 inflammasome

摘要：NLRP3炎性小体的形成是对多种触发因素的反应，会导致焦亡（pyroptosis）以及IL-1β和IL-18的释放。长期以来，人们认为这种反应是一种“全有或全无”的现象，即一旦炎性小体形成，每次都会导致相似的细胞结果。然而，这一观点近年来受到了挑战。这种假设主要基于群体水平的终点测量，所产生的指标无法充分捕捉到动态反应。在本文中，我们结合活细胞成像和算法方法，跟踪了在ATP、单钠尿酸盐（monosodium urate）和尼日尔菌素（nigericin）触发下形成的单个ASC-GFP颗粒的变化。通过这种方法，我们报告了颗粒寿命随触发因素的不同而发生的差异。所提出的算法所需的数据集相对较小，但仍能够提供关于单个细胞水平上炎性小体激活后动态变化的见解。

引言：炎症反应是先天免疫的核心特征，而炎性小体在这一过程中起着重要作用。炎性小体是一种多聚蛋白复合物，它们在外源性或内源性物质的刺激下形成，促进促炎细胞因子IL-1β和IL-18的激活和释放。炎性小体首次在2002年被描述，已被证明在免疫稳态中起着关键作用。含有3个吡啉结构域（pyrin domain）的接头样受体家族（NLRP3）炎性小体是研究最广泛的炎性小体之一，它能对多种不同的病原体相关分子模式（Pathogen-Associated Molecular Pattern, PAMP）和损伤相关分子模式（Damage-Associated Molecular Pattern, DAMP）触发因素作出反应，包括三磷酸腺苷（ATP）、某些晶体（如单钠尿酸盐）、细菌外毒素、多种金属以及病毒双链RNA（dsRNA）。

NLRP3炎性小体的触发因素通过诱导离子流、介导溶酶体损伤、抑制电子传递链和/或氧化磷酸化来发挥作用。ATP和尼日尔菌素都会导致离子流的变化，尽管机制不同。ATP与P2X7受体结合，这种离子门控通道会导致钾离子（K+）外流和钠离子及钙离子内流；尼日尔菌素是一种离子载体，在与氢离子（H+）或钾离子（K+）结合之前是膜不可穿透的，它可以结合细胞外的H+并将其转运到细胞质中，随后结合细胞质中的K+并将其转运出细胞，从而导致K+外流、H+内流以及细胞质酸化。当细胞摄取单钠尿酸盐时，会导致溶酶体损伤、溶酶体成分释放，进而引发NLRP3炎性小体的激活。

在多种类型的炎性小体激活过程中观察到的一个显著特征是形成一个或多个大型蛋白复合物，即颗粒，这些颗粒由传感器（如NLRP3）和含有CARD结构域的凋亡相关蛋白（ASC）组成。ASC颗粒作为支架，招募其他成分进入多蛋白炎性小体复合物，最终导致细胞因子（如IL-1β和IL-18）的激活和释放，以及促炎死亡的细胞死亡形式——焦亡。最常用的NLRP3炎性小体检测指标包括ASC颗粒的形成、细胞外IL-1β/IL-18浓度和乳酸脱氢酶（LDH）的释放，在不同触发因素诱导炎性小体形成时，这些指标在时间上的关联性存在群体水平上的不一致性。实验性终点分析（如细胞因子/LDH浓度或ASC颗粒数量）通常比较的是整个细胞群体，这使得评估各个指标之间的关联性变得困难，因为无法确定单个细胞对每个指标的贡献。然而，研究正逐渐转向利用成像和流式细胞术技术进行单细胞分析，以评估炎性小体激活等过程中的细胞事件之间的联系。单细胞技术的应用允许跟踪单个细胞的指标，从而在细胞水平上建立更清晰的关联，例如在研究人类单核细胞中IL-1β分泌动态的实验中。

在ASC与绿色荧光蛋白（GFP）融合后，形成的ASC-GFP颗粒可以通过荧光显微镜轻松观察到，它们是大而相对圆形的、高亮度的颗粒（约1微米），使得可以跟踪每个颗粒。这为从时间序列图像中研究单细胞水平的颗粒动态提供了可能性，其中可以识别和跟踪各个颗粒。含有ASC-GFP融合的细胞系在市场上可以买到，人类单核细胞系THP1常用于炎性小体研究，在接收到激活信号后容易形成ASC-GFP颗粒。THP1-ASC-GFP细胞包含一个受NF-κB启动子控制的ASC-GFP质粒。当细胞受到LPS等激活信号的刺激时，NF-κB会被激活，从而表达ASC-GFP以及内源性表达的ASC。随后，在炎性小体复合物形成过程中，ASC-GFP会被整合到ASC颗粒中，便于检测和量化。

颗粒检测和跟踪通常采用一种或两种方法结合的方式进行：传统的算法或深度学习（DL）技术，每种方法有其优缺点。关键是，基于算法的技术需要仔细优化检测参数以确保正确检测，而DL方法则需要大量的标记训练数据集，但在实验生物学环境中往往难以获得。此外，基于DL的对象跟踪方法依赖于学习到的模式或嵌入，这使得在没有明显视觉差异的情况下使用DL方法跟踪颗粒变得复杂甚至不可能。

本文的目的是研究THP-1-ASC-GFP细胞中ASC-GFP颗粒寿命的触发因素依赖性，并评估颗粒本身的持续时间是否因不同触发因素而有所不同。这是通过使用先前获得的荧光图像，采用单细胞分析方法对炎性小体检测结果进行单独的ASC-GFP颗粒跟踪来实现的。采用基于算法的方法来研究不同触发因素激活ASC-GFP颗粒形成时其寿命的差异。

方法：细胞培养、处理和成像过程与前文所述相同。简要来说，每个96孔成像板（Agilent Technologies, Santa Clara, CA）中的每个孔含有3×10^4个THP-1-ASC-GFP细胞，用0.1 μg/mL的佛波烯十三酸酯（PMA）处理24小时，随后是24小时的静息期。THP1-ASC-GFP单核细胞系购自Invivogen（Invivogen, San Diego, CA）。每种处理方法重复五次，每个处理在两个孔中进行。细胞用500 ng/mL的超纯LPS（Invivogen, San Diego, CA）处理4小时，然后通过添加5 mM的ATP（Merck, Darmstadt, Germany）、100 μg/mL的单钠尿酸盐（MSU, Invivogen, San Diego, CA）或10 μM的尼日尔菌素（Invivogen, San Diego, CA）来触发炎性小体复合物的形成。选择这些触发因素是因为它们都常用于NLRP3炎性小体的激活。活细胞成像使用EVOS? M7000成像系统（Invitrogen, Carlsbad, CA）和On Stage培养箱进行，配备EVOS 10倍荧光物镜和GFP LED立方体，传输通道中进行了自动对焦步骤。每隔30分钟拍摄每个孔中心12个相邻但不重叠的视野，持续24小时。这产生了16位灰度TIFF图像的时间序列（最大像素强度为4,095），包含49个时间点（包括起始点），每个孔共588张图像，总计17,640帧。

图1展示了所提出的颗粒检测和跟踪算法的流程图。第一步是对收集到的图像应用全局检测算法。图像首先使用第一个强度阈值（intthr1 - 见参数估计部分）进行二值化，然后通过膨胀处理再结合侵蚀滤波器（核大小=5）进行增强。在膨胀步骤中，只有当核内的所有像素都属于背景时，该像素才被视为背景的一部分。这样不仅可以消除颗粒区域内的噪声，还可以连接分离的颗粒区域。然而，膨胀步骤也会增加颗粒面积，随后通过应用侵蚀滤波器来补偿这一点。在侵蚀步骤中，如果核内的至少一个像素属于背景，则该像素被视为背景的一部分。处理后的图像被用来寻找高圆度（≥80%）的小连续像素簇（1 < 簇面积 < 120；相当于半径约为9.9微米的圆），这些被认定为ASC-GFP颗粒。为了持续检测和跟踪ASC-GFP颗粒，实现了以下程序：在算法的每次迭代中，当前帧中的颗粒会被检测到，并与上一帧中已识别的颗粒进行比较。如果两个帧之间的最近邻居ASC-GFP颗粒的距离小于预定义的距离阈值（dmax - 见参数估计部分），则认为它们是同一个颗粒。这个阈值标志着ASC-GFP颗粒在连续两帧之间可以移动的最大距离，即在30分钟内。如果在当前帧中没有检测到距离上一帧中的颗粒小于dmax的颗粒，则执行局部搜索算法。局部搜索算法使用第二个较低的强度阈值（intthr2 - 见参数估计部分）来检查这些坐标附近的颗粒。这是为了考虑颗粒形成后GFP信号的减弱以及自动对焦的问题（见限制）。在以颗粒中心为中心的正方形区域（patch）内，边长为最大移动距离dmax的一半，使用第二个较低的阈值intthr2进行二值化。如果在patch内未检测到颗粒，则第二个阈值减少25；如果检测到多个颗粒，则第二个阈值增加25。这些迭代重复进行，直到在patch中恰好检测到一个颗粒，或者达到最大迭代次数（十次）。如果在局部搜索后没有检测到颗粒或检测到多个颗粒，则原颗粒被分类为消失。新形成的ASC-GFP颗粒仅使用第一个强度阈值intthr1进行识别，因为这些新颗粒具有较高的强度。在某帧中检测到但无法归因于上一帧中任何颗粒的颗粒被标记为新形成的颗粒。颗粒检测和跟踪使用了自开发的Python脚本。代码最初受到Kukil34和Canu, S35的启发。

参数估计：三个主要算法参数——第一个强度阈值（intthr1）、第二个强度阈值（intthr2）以及ASC-GFP颗粒在30分钟间隔内可以在帧之间移动的最大距离（dmax）——是使用手动收集的数据进行估计的。参数dmax是通过手动测量415个颗粒在连续帧之间的移动来估计的。手动测量是在FIJI中进行的，通过在连续帧中手动标注颗粒来完成。随后使用ImageJ内置的宏语言编写的脚本（补充材料1）来测量单个颗粒的移动距离。根据收集的数据，最大移动距离被计算并四舍五入到40像素（补充材料2）。值得注意的是，97.83%的测量值低于dmax/2。因此，局部搜索算法将其搜索限制在颗粒中心周围的区域内，边长等于dmax/2。第一个强度阈值intthr1是用于全局颗粒检测算法的强度阈值。如果对象的强度超过intthr1并且满足预定义的大小和圆度条件，则将其检测为ASC-GFP颗粒。第二个强度阈值intthr2是用于局部颗粒检测算法的强度阈值。通过定义intthr2 < intthr1，我们可以跟踪那些随着时间推移GFP信号逐渐减弱的ASC-GFP颗粒。为了估计intthr1和intthr2，使用FIJI在随机选择的包含49个连续帧的数据集中计数了PMA处理并经过LPS激活的THP-1细胞中的ASC-GFP颗粒。选择的阈值intthr1 = 2100和intthr2 = 1300是为了最小化FIJI和所提算法之间的计数差异（图2.A）。为了进一步验证这些参数，使用所提出的算法计算了来自ATP或尼日尔菌素处理的两个随机选择的时间序列中的ASC-GFP颗粒数量。每个时间序列包含49个连续帧。然后将结果与使用FIJI进行的计数进行比较（图2.B-C）。归一化均方根误差（NRMSE）分别为4.3%、5.3%和4.9%，分别对应MSU、尼日卡因和ATP。尽管这些条件没有用于进一步分析斑点寿命，但对照组（图2.D-E）也被包括在内以供比较。图1中该图片的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。

ASC-GFP斑点检测和跟踪算法。流程图展示了从一帧到另一帧检测和更新斑点的步骤。

参数估计。(A) 在PMA分化的、LPS启动的THP-1细胞中，使用FIJI（蓝色三角形）和所提出的算法（红色圆圈）对随机选择的视野中的ASC-GFP斑点进行计数，这些细胞是通过MSU触发的。算法参数的选择是为了最小化两种方法得到的计数之间的差异。(B-E) 通过比较FIJI和所提出算法在一个随机选择的由ATP或尼日卡因触发的孔以及未经处理的对照组和LPS启动的对照组中得到的计数来评估估计值。

数据分析
对于每个炎性小体触发因素——ATP、MSU和尼日卡因——使用所提出的算法计算了ASC-GFP斑点的寿命，每个实验板包含两个孔，每个孔有12个视野，每个视野包含49帧。将12个视野中的ASC-GFP斑点寿命汇总，每个触发因素得到十个数据集（五个实验板，每个板两个孔）。随后，将每个实验板上的两个数据集合并，得到每个触发因素的五个最终数据集。然后使用这些数据集来统计分析每个触发因素的寿命分布和斑点数量。

寿命分布的差异使用了两种方法进行比较。首先，基于实验期间观察到的寿命分布的90%分位数来比较三种触发因素的斑点寿命，因为这种方法比报告（单一）最大寿命能够更稳定地评估长寿命。使用Wilcoxon秩和检验（双侧，5%显著性水平）来测试差异的显著性。其次，实施了Kaplan-Meier生存分析，并基于对数秩统计比较了三种触发因素的生存曲线之间的差异；实施了整体假设相同的生存曲线和成对比较。使用单因素方差分析（ANOVA）和Tukey多重比较检验来分析触发因素之间总斑点数量的差异。p值低于0.05被认为具有统计学意义。数据和自开发的Python分析脚本将在发表时提供。

结果与讨论
所提出的算法成功独立于触发因素检测和跟踪ASC-GFP斑点。
对各种NLRP3炎性小体读数的分析是炎性小体相关研究的基础。一个常用的读数是ASC斑点的形成，这是一种由于NLRP3炎性小体启动和激活而形成的大型细胞质结构（图3）。尽管ASC斑点的形成是NLRP3炎性小体激活过程中的典型现象，但它并不自动意味着炎性小体的激活。尽管如此，斑点的形成仍然是炎性小体研究中的一个重要指标。通过成像技术量化ASC斑点可以提供关于斑点形成的群体水平指标，并可用于评估化合物促进或抑制炎性小体重建的能力。在这里，使用“方法”部分中提出的检测和跟踪算法来分析人类单核细胞THP1系对不同触发因素的炎性小体斑点形成的响应。
该算法能够检测到绝大多数斑点，只有在强度、大小或圆形度超出预定义范围的情况下才会失败（图4）。然而，它并没有始终比基于单图像的方法检测到更少的斑点（图2），也没有发现错误标注的斑点，这表明尽管我们的算法方法可能无法识别不符合选定参数标准的斑点，但它能够检测到单图像方法遗漏的斑点。总体而言，两种方法检测到的斑点数量显示出高度相似性（图2）。

图3
该图片的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。
THP-1细胞中的斑点形成。在PMA分化的、LPS启动的THP-1-ASC-GFP细胞中，分别用(A) ATP、(B) MSU或(C) 尼日卡因触发后形成的斑点。斑点（白色箭头）显示为明亮的绿色斑点。图表显示了添加触发剂后1小时的代表性图像；插图选择显示了ASC-GFP斑点的形成。透射和GFP通道已经合并，GFP通道被伪彩色化为绿色。

图4
该图片的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。
在添加(A) ATP、(B) MSU和(C) 尼日卡因后2小时，对PMA分化的LPS启动的THP-1-ASC-GFP细胞中的斑点进行检测。ASC-GFP斑点被自动识别并添加边界框。白色箭头指向被成功检测到的可见斑点。粉色箭头指向未能被算法识别的可见斑点，因为它们不符合预定义的强度、大小和/或圆形度标准。图表显示了代表性图像。刻度尺为50 μm。

接下来，我们应用该算法跟踪单个ASC-GFP斑点随时间的变化，并评估实验过程中形成的斑点数量以及不同炎性小体触发因素下形成的单个斑点的寿命。寿命小于一帧（<60分钟）的识别ASC-GFP斑点被视为伪影，并从后续分析中去除，因为大多数仅具有一帧寿命的斑点在手动检查中被发现是假阳性。视觉检查揭示了误识别的几个原因：不同帧之间的失焦斑点大小或形状变化、连续帧中斑点被晶体遮挡、最终帧中出现的新斑点，以及检测后不久弱斑点的强度降至检测阈值以下，这些都会导致算法将斑点记录为非常短暂的寿命。

接下来，我们量化了24小时内形成的单个ASC-GFP斑点的数量，而不考虑时间点。虽然我们之前已经在群体水平上量化了各个时间点的平均ASC-GFP斑点数量，但单个斑点跟踪允许我们量化整个实验过程中形成的斑点数量，而不会重复计算相同的斑点。这种方法显示，用尼日卡因触发形成的斑点数量显著多于用ATP触发形成的斑点（p.adj = 0.036），而MSU刺激在触发后的最初24小时内形成的斑点数量介于两者之间（图5）。单个斑点的数量与我们之前的基于群体的结果一致。

图5
该图片的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。
在PMA分化的、LPS启动的THP-1-ASC-GFP细胞中，无论用ATP、MSU还是尼日卡因触发后24小时内形成的单个ASC-GFP斑点的平均数量。平均值是通过对每个生物重复实验中所有视野的单个斑点数量求和计算得出的（见“数据分析”部分）。ASC-GFP斑点被跟踪了24小时并进行了量化。数据通过单因素方差分析（ANOVA）和Tukey多重比较检验进行分析，并以均值±SEM表示，n = 5。*p-adj < 0.05，n.s.：不显著。

ASC-GFP斑点寿命的直方图显示了不同触发因素下斑点寿命的不同分布（图6）。用ATP或MSU触发后斑点寿命的分布向左偏斜，而用尼日卡因触发后斑点寿命呈钟形分布。此外，去除了一帧寿命的斑点后，比较了90%分位数（Wilcoxon秩和检验，n = 5），发现MSU和ATP之间的差异显著（p值 = 0.012），以及尼日卡因和ATP之间的差异也显著（p值 = 0.009），表明MSU和尼日卡因倾向于导致比ATP更长的最大斑点寿命。MSU和尼日卡因之间的斑点寿命没有显著差异（p值 = 0.754）。

图6
该图片的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。
在PMA分化的、LPS启动的THP-1细胞中，分别用(A) ATP、(B) MSU或(C) 尼日卡因触发后，自动识别和跟踪的ASC-GFP斑点。(D) 不同触发因素下实验过程中出现的斑点的生存曲线。对于每个触发因素，汇总并分析了所有重复实验中所有视野的数据（n = 5）。然后修剪数据以消除周期为1帧的斑点作为伪影。(D)中的虚线显示了中位生存斑点的寿命，分别为ATP、MSU和尼日卡因的2.0小时、4.5小时和4.0小时。

接下来，我们研究了斑点的形成时间和寿命，以观察两者之间是否存在任何联系（图7）。用ATP触发的细胞（图7A）似乎主要在激活后的前5小时内形成ASC-GFP斑点，而用MSU触发的细胞（图7B）中的斑点形成在时间上稍微分散。用尼日卡因触发的细胞几乎只在前三小时内形成ASC-GFP斑点（图7C）。结果并不表明斑点的寿命与其形成时间有任何关联。然而，Kaplan-Meier生存对数秩检验的显著结果（ATP-MSU，p值 = 2 × 10^-16；ATP-尼日卡因，p值 < 2 × 10^-16；MSU-尼日卡因，p值 < 2 × 10^-16）支持所有触发因素的ASC-GFP斑点寿命（无论形成时间如何）是不同的（图6D）。

图7
该图片的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。
ASC-GFP斑点的形成时间和寿命。每个时间点形成的单个斑点的相对数量，以及它们持续时间，相对于每个触发因素的总斑点数量进行归一化（n = 5）。THP-1-ASC-GFP细胞经过PMA分化，用LPS启动，并分别用(A) ATP、(B) MSU或(C) 尼日卡因触发。ATP和MSU触发细胞的对角线对应于实验结束时剩余的所有斑点的总和。

尼日卡因是一种K+离子载体，能诱导强烈的和持续的钾外流和细胞质酸化，这可能导致稳定的、寿命较长的ASC斑点的快速形成，尽管尼日卡因引起的快速和强烈的细胞死亡可能导致GFP的过早淬灭，从而人为缩短斑点的寿命。虽然所有使用的触发因素都有可能使GFP过早淬灭，但在诱导快速细胞死亡的触发因素下，这种效应可能更为明显，从而扭曲了观察到的斑点寿命之间的差异。ATP激活P2X7受体，导致短暂的K+外流，持续几分钟，随后受体脱敏或ATP在细胞外空间降解，可能导致斑点寿命较短。MSU晶体通过吞噬作用和溶酶体损伤可能引发较慢但持久的激活，从而产生持续形成的寿命较长的斑点。最近的研究表明，NLRP3会经历相分离，形成类似液体或凝胶的凝聚物，其动态取决于刺激因素。ASC/NLRP3斑点的时依赖性固化可能在尼日卡因或MSU刺激后增加其寿命，而ATP诱导的斑点则更为动态且迅速消失。ASC的翻译后修饰、细胞质pH变化以及与其他效应蛋白的相互作用也可能影响斑点的寿命。NLRP3炎性小体形成的触发因素，如ATP、尼日卡因、明矾和二氧化硅，还会引起NLRP3的翻译后修饰，包括棕榈酰化、磷酸化和泛素化，这些修饰既可促进炎性小体的形成，也可通过自噬介导的降解或伴侣蛋白介导的自噬促进NLRP3的降解。此外，NLRP3炎性小体形成的触发因素在细胞绘图实验中也显示会引发额外的、特定于触发因素的效果，但目前尚不清楚这些效果是什么，或者它们是否以任何方式影响炎性小体的形成或功能。此外，需要注意的是，ASC斑点的形成并不立即等同于炎性小体的形成，而且在多种炎性小体类型中，斑点的形成和炎性小体的效应功能可能是解耦的。因此，ASC斑点寿命的变化对炎性小体功能的重要性仍有待确定。

通过量和跟踪单个ASC-GFP斑点，我们可以证实之前的报告，即斑点形成在添加触发剂后不久就开始（图7A-C和8B）。

图8
该图片的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。
在PMA分化的、LPS启动的THP-1-ASC-GFP细胞中，自动检测和跟踪存在的总斑点数量以及每个时间点形成的斑点数量。在每个时间点上存在的ASC-GFP颗粒总数（A）以及通过ATP、MSU或nigericin触发颗粒形成后每个时间点上形成的ASC-GFP颗粒数量（B）。数据是所有实验重复中所有视野区域的总和（n = 5）。本研究中使用的基于算法的检测方法与我们之前使用的方法不同（使用Hessian矩阵、高斯差分Sobel滤波器和膜投影作为训练特征的FastRandomForest分类器，随后进行强度阈值处理和按大小过滤）。尽管如此，颗粒数量的曲线非常相似19，这表明一个相对简单的算法就能充分检测到ASC-GFP颗粒。能够追踪颗粒还表明，虽然在所有三种触发剂激活后的前5小时内颗粒形成的数量最多，但使用ATP或MSU触发颗粒形成会导致颗粒持续生成，而使用nigericin触发则不会（图8A）。此外，由ATP触发的颗粒形成产生的颗粒寿命较短，而使用MSU或nigericin触发的颗粒则寿命较长。这说明了ASC-GFP颗粒的不同动力学特性：即使用nigericin时快速形成但寿命较长的颗粒，使用MSU时持续形成但寿命较长的颗粒，而使用ATP时持续形成但寿命较短的颗粒（图7）。使用ATP或nigericin触发后颗粒数量最多出现在3-4小时，而使用MSU触发后则在6-8小时（图8B）。这些差异可能是由于每种触发剂的诱导途径不同造成的，因为已知不同触发剂在群体水平上引发的炎性小体反应的幅度各不相同38，这取决于主要介导机制是离子流、酸化作用、电子传递链的参与还是溶酶体成分的参与。这种对炎性小体功能寿命和时间相关方面的描述可能为了解炎性小体激活在健康和疾病状态中的不同作用提供了初步见解。

实验限制
在一系列图像中追踪对象的能力取决于能否清晰地区分感兴趣的对象。对三维生物系统的成像存在许多挑战，包括保持对象聚焦以及处理系统中其他结构的遮挡。荧光点的失焦成像（例如ASC-GFP颗粒）通常会导致焦散现象（补充图1），使颗粒看起来更大、轮廓更模糊，并降低信号强度。虽然后者最初不是问题，但信号强度的降低可能导致颗粒过早消失，从而缩短可检测的时间。此外，颗粒大小、形状和强度的变化可能影响参数估计。颗粒被遮挡可能导致无法追踪，或者产生伪影（补充图2），从而影响颗粒的检测和追踪。实验的终止也可能缩短颗粒的寿命，尤其是使用那些导致颗粒形成较晚和/或颗粒寿命较长的触发剂时。

算法和数据分析限制
在颗粒追踪过程中，ASC-GFP颗粒的运动与新颗粒的出现（在帧之间发生）可能会带来问题。虽然通过假设之前图像中与当前位置最接近的颗粒是同一颗粒来解决这个问题，但也有可能在原始位置附近形成新的颗粒。这可能导致两个颗粒被错误标记。使用更高时间分辨率的图像可以通过最小化颗粒运动距离来缓解这一问题，但可能会增加光漂白和光毒性的风险。为了更稳健地追踪颗粒，需要关于单个颗粒的形状、大小和像素强度的额外信息。这有助于构建嵌入特征，以便在不同时期的图像序列中匹配颗粒。在这种情况下，深度学习方法可以解决由于颗粒遮挡或颗粒在另一个颗粒移动范围内出现而引起的问题。此外，将细胞映射到颗粒上可以提高基于深度学习的颗粒追踪的稳健性。与颗粒相比，细胞包含更多可区分的信息和模式，因此更容易追踪。然而，在本研究中使用深度学习受到数据限制的阻碍。在未来的研究中，我们计划通过创建更大的数据集来解决这个问题，并用明场图像进行补充。

结论
通过测量单个颗粒的形成和寿命，我们发现了依赖于触发剂的ASC-GFP颗粒寿命差异，这些差异无法通过终点分析来测量。观察到的差异可能反映了触发剂特定的颗粒形成机制，这些机制会影响炎性小体的形成和/或降解过程，并促进针对不同刺激的炎症反应。我们展示了使用相对简单的算法方法就可以追踪ASC-GFP颗粒，且所需的数据远少于深度学习方法。此外，这种方法适用于小规模实验，并允许在单细胞水平上生成时间序列数据。这是朝着在单细胞水平上评估炎性小体反应方向迈出的又一步，这对于未来更精确地阐明炎性小体激活下游的各种关联至关重要。