来自妊娠糖尿病女性的胎盘CD4? T细胞在怀孕大鼠模型中再现了该疾病的特征，而使用二甲双胍或mitotempo可以改善这些特征

《Hypertension in Pregnancy》：Placental CD4? T cells from women with gestational diabetes recapitulate disease features in a pregnant rat model, improved by metformin or mitotempo

　　**摘要**
目的：妊娠糖尿病（GDM）是指妊娠期间出现的葡萄糖耐受不良、胰岛素敏感性和β细胞功能障碍。GDM的发病机制与高血压、胎盘和肾功能受损、氧化应激以及循环中CD4+ T细胞增加有关。目前可用于研究GDM病理和治疗的动物模型较为有限。本研究旨在探讨GDM胎盘中的CD4+ T细胞在妊娠无胸腺裸鼠中GDM表型表现中的作用。

**方法**
在分娩时分离妊娠糖尿病（GDM）胎盘中的CD4+ T细胞（GDM T细胞），并在妊娠第12天（GD12）将其注射到妊娠无胸腺裸鼠体内。在GD19时评估平均动脉压以及肾损伤标志物（蛋白尿、肾脏损伤分子-1和中性粒细胞明胶酶相关脂钙素）。同时进行葡萄糖耐量测试和胰岛素耐量测试。使用过碘酸雪夫染色和苏木精-伊红染色方法观察肾脏和胰腺组织。采用单因素方差分析（ONE-WAY ANOVA）进行统计分析。

**结果**
与对照组（105.4 ± 2.8 mmHg）和正常血压的T细胞受体（96.3 ± 3.9 mmHg）相比，GDM T细胞的移植物使血压升高（120.8 ± 2.2 mmHg，p < 0.05）。二甲双胍（Metformin）或MitoTEMPO可减轻这一反应。GDM T细胞受体表现出血糖升高（p < 0.05）以及葡萄糖耐量和胰岛素敏感性下降，而二甲双胍或MitoTEMPO治疗可改善这些情况。GDM T细胞受体的肾损伤更为严重，但使用这些药物后有所缓解。胰腺组织学检查显示GDM T细胞受体的β细胞数量减少。

**结论**
GDM胎盘中的CD4+ T细胞与高血压、葡萄糖耐受不良和肾功能障碍有关，而MitoTEMPO可改善这些症状。这些发现支持在妊娠期间优化线粒体功能的潜在治疗方法。

**关键词**：GDM；CD4+ T细胞；肾功能障碍；二甲双胍

**引言**
妊娠糖尿病（GDM）是一种在无糖尿病史的孕妇中出现的妊娠期新发高血糖症，全球约有25%的妊娠受到影响[Citation1]。GDM通常在妊娠24至28周之间被诊断出来，其患病率因母亲年龄增长、体重增加和缺乏运动等风险因素而持续上升[Citation2]。GDM的诊断需通过口服葡萄糖耐量测试（OGTT）进行，即给患者摄入50克葡萄糖，并在摄入后一小时测量血糖[Citation3]。GDM对母婴健康有不良影响，并发症包括高血压、先兆子痫、早产和胎儿巨大儿[Citation4]。此外，这些患者发生分娩并发症（如肩难产、剖宫产）的风险增加，未来母亲和子女患2型糖尿病和心血管疾病的风险也更高[Citation5]。尽管GDM的临床意义重大，但其发病机制尚不完全清楚，且有效的动物模型数量有限，难以用于研究疾病机制和潜在治疗方法。

GDM的主要治疗方法是改善饮食和锻炼，但约30%的患者需要额外用药[Citation4]。药物治疗通常包括胰岛素或口服药物（如二甲双胍）。胰岛素是一线治疗选择，因其不会通过胎盘屏障，各种形式的胰岛素在妊娠期间均可安全使用[Citation6]。然而，对于许多患者来说，胰岛素费用较高。相比之下，二甲双胍是一种常用的口服药物，因其给药方便且经济实惠[Citation6]，但由于其能穿过胎盘屏障，被视为二线治疗[Citation4]。此外，二甲双胍还能抑制线粒体呼吸链复合体I，其在线粒体中的积累浓度较低[Citation7]，这使其作用机制仍存在争议。

虽然GDM的病理生理机制尚未完全阐明，但研究表明免疫现象可能在其发病中起作用[Citation8]。传统上，GDM被认为是由于胰岛素抵抗导致的高血糖，近年来这一观点发展为包括免疫激活和炎症的作用，即激活的免疫系统导致胎盘功能障碍，进一步影响葡萄糖稳态[Citation9]。有研究认为GDM可能源于母体免疫系统对妊娠的异常适应和循环中炎症因子的上调[Citation10]。CD4+ T细胞在调节适应性免疫和先天免疫中起关键作用，其失调与妊娠期高血压和肾功能障碍有关[Citation10]。T淋巴细胞分为多种亚群，如促进炎症的Th1细胞和抗炎症的Th2细胞[Citation10]。CD4+ T细胞的扩增和激活被认为会导致GDM中的全身炎症[Citation11]，从而引发内皮功能障碍和胰岛素抵抗[Citation10,Citation12]。此外，GDM妊娠中的CD4+ T细胞还与胎盘功能障碍相关，可能通过免疫介导的方式影响胎儿生长和早产[Citation9]。T细胞还参与启动和维持针对胰腺β细胞的自身免疫反应，导致胰腺功能障碍和糖尿病的发展。抗体标志物（如胰岛细胞抗体、胰岛素自身抗体、谷氨酸脱羧酶抗体和胰岛素瘤相关抗原2抗体）是糖尿病患者的常见自身免疫标志物，用于预测和诊断[Citation13]。研究表明，GDM患者的调节性T细胞被激活，但正常的母体免疫抑制作用较弱[Citation9]。T淋巴细胞功能的这种失调可能与GDM的发展相关[Citation14]。糖尿病患者体内促炎细胞因子水平升高[Citation15]，反而促进了炎症而非免疫耐受[Citation16,Citation17]。高血糖还与胎盘炎症和炎症细胞因子增加有关[Citation18]。

本研究旨在探讨GDM患者胎盘中的CD4+ T细胞在GDM发病机制中的作用。迄今为止，尚无可用的动物模型用于研究GDM。先前已有研究通过人类T细胞移植成功诱导动物模型中的疾病[Citation19,Citation20]。无胸腺裸鼠因缺乏正常胸腺功能而被广泛用于研究免疫系统[Citation21]。因此，我们假设GDM胎盘中的CD4+ T细胞移植将诱发GDM的关键特征（如高血压和葡萄糖耐量受损），而线粒体靶向抗氧化剂MitoTEMPO的治疗可缓解这些影响。实验表明，MitoTEMPO可改善妊娠模型中的血管和代谢结果[Citation22–24]，我们希望评估其在GDM胎盘CD4+ T细胞移植中的潜在治疗效果。

**方法**
**人类参与者选择**
参与研究的对象为密西西比大学医学中心（UMMC）Wiser妇女和婴儿医院的正常妊娠（NP；正常葡萄糖耐量）及妊娠糖尿病（GDM）患者，他们提供了同意书并纳入研究。符合条件的患者为单胎、无异常妊娠的孕妇；排除有慢性高血压史、多胎妊娠、既往免疫障碍或当前使用酒精、烟草或非法药物的患者。妊娠糖尿病的筛查采用ACOG推荐的标准两步法：在妊娠24至28周时进行非空腹一小时静脉葡萄糖检测，如果结果≥140 mg/dL，则要求患者完成空腹三小时100克口服葡萄糖耐量测试（OGTT）。OGTT结果中两个异常值可确诊GDM。所有患者均按机构和标准护理方案治疗，必要时使用二甲双胍或胰岛素控制血糖。所有参与者的血压数据均来自电子健康记录。并非所有GDM患者都伴有高血压，从而可以独立评估葡萄糖调节情况。从电子健康记录中收集的额外数据包括年龄（岁）、种族、妊娠周数、体重指数（BMI）、分娩方式、胎儿体重（克）、胎儿性别及所用药物。所有患者在分娩前签署了UMMC机构审查委员会批准的同意书。

**样本采集**
分娩后立即采集血液和胎盘（图1）。从每个胎盘的母体侧采集约4–5克胎盘组织，用PBS+5%青霉素/链霉素冲洗以去除表面血液，然后放入含有4%胶原酶I、0.25 U/mL DNase I和5%青霉素/链霉素的RPMI-1640溶液中消化。接着在37°C下搅拌一小时，过滤后通过100 μm滤膜分离，再利用磁珠分离技术提取CD4+ T细胞。血液样本通过静脉穿刺收集至BD Vacutainer全血采集管中。按照制造商说明让样品凝固后，在4°C下3200 RPM离心10分钟。每位患者的血清和血浆分别储存在-80°C的微量离心管中以备后续检测。

**图1. 实验设计**
上图展示了正常妊娠和妊娠糖尿病捐赠者的胎盘CD4+ T细胞分离过程及移植到妊娠无胸腺裸鼠中的步骤。下图为动物实验时间线：第一阶段（GD12）为100万个CD4+ T细胞的移植；第二阶段（GD14）为大鼠给药（1）二甲双胍（300毫克/千克/天）或（2）MitoTEMPO（1毫克/千克/天）；第三阶段（GD18）为颈动脉导管植入；第四阶段（GD19）为动物采血及组织采集。

**CD4+ T细胞分离与移植**
根据Invitrogen（加利福尼亚州卡尔斯巴德）的协议，使用CD4+ Dynabeads从胎盘白细胞中分离CD4+ T细胞。分离后的CD4+ T细胞用PBS洗涤，并在含有25 mM HEPES、2 mM谷氨酰胺、100 U/ml青霉素-链霉素、1.022 mg/mL IL-2和4 ng/mL IL-12的RPMI培养基中培养24小时（37°C、5% CO2）。离心后用生理盐水洗涤细胞，每100 μL生理盐水中含有1×10^6个细胞，用于在GD12日移植到正常妊娠无胸腺裸鼠体内。移植实验中，从一个GDM捐赠者中分离CD4+ T细胞并移植给一只妊娠裸鼠（每个捐赠者对应一只受体鼠），因此每只鼠代表一个独立的生物学重复样本。

**实验动物**
实验使用的无胸腺裸鼠由我们实验室繁殖，生活在温度控制的环境中，光照时间为12:12小时，提供自由饮水并喂食标准饲料（Harlan Laboratories，威斯康星州麦迪逊）。所有动物实验程序和处理均遵循密西西比大学医学中心的指导方针，并基于美国国立卫生研究院《动物护理指南》以及机构动物护理和使用委员会（IACUC）和ARRIVE（动物研究：报告体内实验）的原则。在妊娠第14天（GD 14），通过渗透泵给予MitoTEMPO（1毫克/公斤/天），并通过口服灌胃给予二甲双胍（300毫克/公斤/天）至各自的大鼠组（图1）。在GD 18，所有组别的大鼠中有一组植入了颈动脉导管（图1）。在GD 19，测量了平均动脉压（MAP）。平均动脉压（MAP）是通过连接到压力传感器（Cobe III Transducer CDX Sema）的颈动脉导管在有意识的大鼠中测量的。使用PowerLab数据采集系统（ADInstruments，科罗拉多州科罗拉多斯普林斯）连续记录动脉压。大鼠被放置在限制笼中，允许一小时的平衡时间，然后进行30分钟的连续MAP记录（图1）。当MAP显著高于正常妊娠对照组大鼠时，认为大鼠患有高血压，这与之前描述的子宫灌注压降低（RUPP）大鼠模型和适应性T细胞转移模型一致[Citation20,Citation25]。在这些模型中，之前报告的MAP值分别为正常妊娠（NP）大鼠约95-100毫米汞柱，高血压大鼠约120-125毫米汞柱。在G19，收集动物，并测量母体、胎儿和胎盘的重量，并收集血液、胎盘、胰腺和肾脏用于后续检测（图1）。

葡萄糖和胰岛素水平测量
从尾静脉采集血液样本，使用葡萄糖分析仪（AimStrip? Plus Blood Glucose Meter，德克萨斯州圣安东尼奥）测量基线循环血糖。在GD 18使用血糖仪评估非空腹血糖，随后将大鼠置于代谢笼中，并禁食过夜。在给予葡萄糖（2克/公斤腹腔注射）后，于GD 19的15、30、60、90和120分钟时测量空腹血糖。在另一组动物中，进行胰岛素耐量测试，先腹腔注射胰岛素（0.5单位/公斤，Humulin R，Eli Lilly，印第安纳波利斯，IN），然后在15、30、60、90和120分钟时测量血糖。

肾脏损伤评估
在GD 18夜间从代谢笼收集尿液后，通过肾脏损伤分子-1（KIM-1，ab223858，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆；批间精密度（%CV）低于4.3%）和中性粒细胞明胶酶相关脂钙素（NGAL，ab239422，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆；批间精密度（%CV）低于6.8%）测量肾脏功能失调。先前研究表明，KIM-1和NGAL与肾脏损伤的进展有关[Citation26]。所有ELISA检测均按照制造商的说明进行。

肾小球损伤评估
收集肾脏后，将其固定在10%缓冲福尔马林溶液中。使用Periodic acid-Schiff（PAS）染色法评估每只大鼠约3微米厚石蜡切片上的肾小球损伤程度，每张切片大约30张图像。每个切片中的30个肾小球按照0-4分进行评分，0表示正常肾小球，1表示25%的损伤，2表示50%的损伤，3表示75%的损伤，4表示毛细血管损失超过75%，评分过程是盲法进行的。使用Nikon Eclipse 55i显微镜和20倍物镜及NIS-Elements D 3.0软件捕捉图像。

胰腺损伤评估
收集胰腺组织并进行石蜡包埋组织学处理。将石蜡包埋组织切成3微米厚的切片，使用苏木精和伊红（H&E）染色。H&E染色后，使用Nikon Eclipse 55i显微镜和NIS-Elements D 3.0软件测量胰岛面积（形态分析）。

数据分析
数据使用GraphPad Prism 10.1软件（GraphPad Software，加利福尼亚州圣地亚哥）进行分析。所有结果均以均值±标准误（SEM）表示。组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），随后进行Bonferroni复数比较检验作为事后分析。统计显著性定义为Bonferroni校正后的p<0.05。

患者群体的临床特征
共有28名患者参与了我们的研究，以探讨正常血压和妊娠糖尿病（GDM）患者群体的免疫特征。患者的人口统计和临床特征总结在表1中。在选定的患者中，17名患者中有7名接受二甲双胍作为主要治疗。

表1. 患者群体的临床特征。

由于胎盘GDM CD4+ T细胞的转移而导致的血压升高
在胎盘GDM CD4+ T细胞转移后，结果显示GDM-CD4+ T细胞受者的MAP升高（120.8±2.2毫米汞柱，n=8，p<0.05），与正常妊娠（NP）裸露对照组（105.4±2.8毫米汞柱，n=8）和正常血压（NP+NP）CD4+ T细胞受体（96.3±3.9毫米汞柱，n=7）相比（图2）。此外，治疗组[GDM CD4+ T细胞+二甲双胍受体大鼠（95.3±2.5毫米汞柱，n=6，p<0.05），GDM CD4+ T细胞+ MitoTEMPO受体大鼠（95.1±3.6毫米汞柱，n=7，p<0.05），NP+NP MitoTEMPO（102.2±7.7毫米汞柱，n=5），以及NP+NP CD4+ T细胞+二甲双胍受体大鼠（99.0±3.9毫米汞柱，n=8，p<0.05）的血压也相对正常（图2）。

图2. 动物血压。在胎盘GDM-CD4+ T细胞转移后，MAP显著升高（p<0.05），与对照组或治疗组相比。数据以均值±标准误表示。通过单因素方差分析比较各组之间的差异，随后进行Bonferroni多重事后分析。p<0.05被认为具有统计学意义。

阅读此图的详细描述
条形图显示垂直轴上的平均动脉压（单位为毫米汞柱），范围从50到150，水平轴上表示七个不同的组。从左到右，分别为：NP裸露（n=8），NP加NP CD4阳性T细胞（n=7），NP加NP CD4阳性T细胞加MitoTEMPO（n=5），NP加NP CD4阳性T细胞加二甲双胍（n=8），GDM CD4阳性T细胞（n=8），GDM CD4阳性T细胞加二甲双胍（n=6），以及GDM CD4阳性T细胞加MitoTEMPO（n=7）。NP裸露组的平均动脉压约为105毫米汞柱。NP加NP CD4阳性T细胞组的平均动脉压约为100毫米汞柱。NP加NP CD4阳性T细胞加MitoTEMPO组的平均动脉压约为102毫米汞柱。NP加NP CD4阳性T细胞加二甲双胍组的平均动脉压最高，约为120毫米汞柱。GDM CD4阳性T细胞加二甲双胍组的平均动脉压约为95毫米汞柱。GDM CD4阳性T细胞加MitoTEMPO组的平均动脉压约为98毫米汞柱。统计显著性用括号表示：NP加NP CD4阳性T细胞加二甲双胍和GDM CD4阳性T细胞之间的括号显示p=0.0017。NP裸露和GDM CD4阳性T细胞之间的括号显示p=0.0005。GDM CD4阳性T细胞和GDM CD4阳性T细胞加MitoTEMPO之间的括号显示p=0.0005。NP裸露和GDM CD4阳性T细胞加MitoTEMPO之间的括号显示p=0.0002。

由于胎盘GDM CD4+ T细胞的转移，母体、胎儿和胎盘的重量有所差异
所有GDM-CD4+ T细胞受体组的母体体重没有变化（263.1±6.2克，n=8），GDM CD4+ T细胞+二甲双胍受体组（280.3±3.5克，n=6），GDM CD4+ T细胞+ MitoTEMPO受体组（259.1±7.7克，n=7），NP+NP CD4+ T细胞+二甲双胍受体组（251.7±7.8克，n=6），正常妊娠（NP）裸露对照组（253.9±5.7克，n=8），NP+NP MitoTEMPO（254.5±6.5克，n=5），以及正常血压CD4+ T细胞受体组（259.7±7.2克，n=7）（图3A）。

图3. 母体、胎盘和胎儿-胎盘比重的差异。在（A）母体重量或（B）胎盘重量方面没有观察到显著差异。（C）糖尿病大鼠治疗组的胎儿/胎盘比率显著改善。通过单因素方差分析比较各组之间的差异，随后进行Bonferroni多重事后分析。p<0.05被认为具有统计学意义。

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三面板条形图：a）母体体重（克），b）胎盘重量（克），c）胎儿-胎盘比率（FPR）。所有面板包含七个组：NP裸露，NP+NPCD4TCells，NP+NPCD4TCells+Mitotempo，NP+NPCD4TCells+Metformin，GDMCD4TCells，GDMCD4TCells+Metformin，GDMCD4TCells+Mitotempo。a）各组的母体体重相似（250-280克）。b）各组的胎盘重量相似（0.4-0.6克）。c）FPR：NP裸露约2.5；NP+NPCD4TCells约4.0；NP+NPCD4TCells+Mitotempo约3.5；NP+NPCD4TCells+Metformin约3.8；GDMCD4TCells约2.8；GDMCD4TCells+Metformin约3.0；GDMCD4TCells+Mitotempo约3.8。统计学显著性：NP裸露与NP+NPCD4TCells（p<0.0001）；NP裸露与NP+NPCD4TCells+Metformin（p=0.0017）；GDMCD4TCells与GDMCD4TCells+Mitotempo（p=0.0290）；NP裸露与GDMCD4TCells+Mitotempo（p<0.0001）。

由于人类T细胞的转移，胎盘重量几乎没有变化。GDM-CD4+ T细胞受体组的胎盘重量（0.45±0.03克，n=8），NP裸露对照组（0.52±0.03克，n=8），正常血压CD4+ T细胞受体组（0.48±0.01克，n=7），GDM CD4+ T细胞+二甲双胍受体组（0.59±0.04克，n=6），GDM CD4+ T细胞+ MitoTEMPO受体大鼠（0.45±0.02克，n=7），NP+NP MitoTEMPO（0.45±0.05克，n=5），以及NP+NP CD4+ T细胞+二甲双胍受体大鼠（0.55±0.05克，n=6）（图3B）。

GDM-CD4+ T细胞受体的胎儿-胎盘比率（2.6±0.1克，n=8，p<0.05）低于正常血压CD4+ T细胞受体大鼠（4.1±0.2克，n=7），NP+NP MitoTEMPO（3.4±0.12克，n=5），NP+NP CD4+ T细胞+二甲双胍受体大鼠（4.0±0.3克，n=6，p<0.05），以及NP裸露对照组（2.7±0.2克，n=8）。然而，二甲双胍治疗（3.0±0.2克，n=6，p<0.05）和MitoTEMPO治疗组（4.0±0.3克，n=7，p<0.05）改善了FPR（图3C）。

由于人类GDM CD4+ T细胞的转移，葡萄糖耐量和胰岛素抵抗受损
与NP裸露对照组（82.1±9.5毫克/分升，n=8）和正常血压CD4+ T细胞受体（88.8±2.7毫克/分升，n=7）相比，GDM-CD4+ T细胞导致空腹循环血糖水平升高（227.3±38.6毫克/分升，n=8，p<0.05）（图4A）。二甲双胍或MitoTEMPO治疗缓解了这一反应。GDM CD4+ T细胞+二甲双胍受体（111.1±10.8毫克/分升，n=7），GDM CD4+ T细胞+ MitoTEMPO受体大鼠（96.9±1.7毫克/分升，n=7），NP+NP MitoTEMPO（104.5±2.2毫克/分升，n=5），以及NP+NP CD4+ T细胞+二甲双胍受体大鼠（95.7±2.4毫克/分升，n=6）的血糖水平正常化（图4A）。NP+NP CD4? T细胞+ MitoTEMPO对照组包含在所有相关终点中，如平均动脉压（MAP）、体重、胎盘重量、胎儿-胎盘比率和循环血糖。重要的是，该组的加入与NP裸露或NP+NP CD4? T细胞组相比没有显著差异，证实单独使用MitoTEMPO不会改变正常血压状态下的生理结果。这一发现与LaMarca及其同事的先前工作一致，他们表明来自正常妊娠女性的CD4? T细胞在转移后不会引起高血压[Citation27]，并且抗氧化疗法（如MitoTEMPO）对NP动物的免疫或血管状况没有显著影响[Citation22,Citation28]。鉴于这些发现与先前文献和当前数据的一致性，并且根据循环葡萄糖耐量测试的结果，该组被排除在未来的实验和图表中，以减少重复并简化研究，因为其与已建立的对照组（NP裸露和NP+NP CD4? T细胞）相似，且没有生物学差异。

图4. 动物血糖水平的改变。GDM T细胞受体具有（A）升高的血糖，（B）受损的葡萄糖耐量（*p<0.0001），以及（C）胰岛素敏感性受损。数据以均值±标准误表示。通过单因素方差分析比较各组之间的差异，随后进行Bonferroni多重事后分析。p<0.05被认为具有统计学意义。

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三面板图显示循环葡萄糖、葡萄糖耐量和胰岛素耐量水平。面板A是一个条形图，垂直轴从0到400毫克/分升，水平轴显示七个组。从左到右，分别为NP裸露，NP加NP CD4 T细胞，NP加NP CD4阳性T细胞加MitoTEMPO，NP加NP CD4阳性T细胞加二甲双胍，GDM CD4阳性T细胞，GDM CD4阳性T细胞加二甲双胍，以及GDM CD4阳性T细胞加MitoTEMPO。GDM CD4阳性T细胞组的血糖水平显著高于其他所有组，p值分别为<0.0001、0.0012、0.0002和0.0001。面板B是120分钟内TT血糖水平的线图。垂直轴表示血糖水平，范围从0到300毫克/分升。水平轴表示时间，从0分钟到120分钟。GDM CD4阳性T细胞线在30分钟时达到峰值，随后下降。面板C是120分钟内ITT血糖水平的线图。垂直轴表示血糖水平，范围从40毫克/分升到120毫克/分升。水平轴表示时间，从0分钟到120分钟。所有线条都显示出血糖水平随时间的总体下降趋势。

此外，葡萄糖耐量测试的结果表明，在GDM CD4+ T细胞中葡萄糖耐量受损（p < 0.05），但在糖尿病受体大鼠中，使用MitoTEMPO和二甲双胍治疗后这种损伤得到了缓解（图4B）。胰岛素耐量测试的结果显示，与正常血压和NP裸鼠对照组相比，转移GDM CD4+ T细胞后胰岛素敏感性降低（p < 0.05；图4C）。对肾损伤的分析显示，转移人类GDM CD4+ T细胞后肾功能障碍反应增加。肾组织学分析显示，与正常血压和NP裸鼠对照组以及糖尿病治疗组相比，GDM-CD4+ T细胞受体大鼠的肾小球损伤加剧（p < 0.05）（图5A）。这一结论通过代表性的过碘酸希夫（PAS）染色肾切片的形态测量分析得到了进一步支持（图5B–G）。GDM-CD4+ T细胞受体大鼠的蛋白质排泄量显著增加（5.4 ± 0.78毫克/天，n = 8，p < 0.05），而NP裸鼠对照组为2.2 ± 0.3毫克/天（n = 7），正常血压CD4+ T细胞受体大鼠为2.5 ± 0.7毫克/天（n = 6，图5H）。GDM CD4+ T细胞+二甲双胍治疗组（2.7 ± 0.2毫克/天，n = 4）、GDM CD4+ T细胞+ MitoTEMPO治疗组（2.9 ± 0.4毫克/天，n = 6）以及NP+NP CD4+ T细胞+二甲双胍治疗组（2.7 ± 0.2毫克/天，n = 5）的蛋白质水平比GDM大鼠受体组有所降低（图5H）。

图5. 肾小球组织学和肾损伤的定量评估。转移GDM CD4+ T细胞导致肾损伤增加，而二甲双胍或MitoTEMPO治疗可以缓解这种损伤。肾损伤通过肾小球组织学评分（A）和20倍放大倍数下代表性的过碘酸希夫（PAS）染色肾切片的形态测量分析来评估（B–G）。每个PAS染色图像对应于肾小球评分图（A）中显示的相应组。肾损伤的增加还通过蛋白尿水平的升高（H）以及接受GDM CD4+ T细胞的大鼠中损伤标志物Kim-1（I）和NGAL（J）的肾表达增加得到了进一步支持。数据以均值±SEM表示。使用单因素方差分析比较各组之间的差异，随后进行了Bonferroni多重事后分析。p < 0.05被认为具有统计学意义。

多面板图表：条形图（a）、六张肾组织学显微照片（b-g）和三个条形图（h-j）。面板a为肾小球损伤评分：NP裸鼠0.5，NP+NP CD4 T细胞0.5，NP+NP CD4+T细胞+二甲双胍0.5，GDM CD4+T细胞1.5，GDM CD4+T细胞+二甲双胍0.5，GDM CD4+T细胞+MitoTEMPO0.5。GDM CD4+T细胞显著高于其他所有组（p<0.0001）。面板b-g为肾组织学显微照片：b) NP裸鼠，c) NP+NP CD4 T细胞，d) NP+NP CD4+T细胞+二甲双胍，e) GDM CD4+T细胞，f) GDM CD4+T细胞+二甲双胍，g) GDM CD4+T细胞+MitoTEMPO。面板h为蛋白尿：GDM CD4+T细胞显著高于NP裸鼠（p=0.0019），NP+NP CD4 T细胞（p=0.0095）和GDM CD4+T细胞+二甲双胍（p=0.0251）。GDM CD4+T细胞+MitoTEMPO显著低于GDM CD4+T细胞（p=0.0311）。面板i为Kim-1：GDM CD4+T细胞显著高于NP裸鼠（p=0.0246），NP+NP CD4 T细胞（p=0.0002），GDM CD4+T细胞+二甲双胍（p=0.0004），以及GDM CD4+T细胞+MitoTEMPO（p=0.0004）。面板j为NGAL：GDM CD4+T细胞显著高于NP裸鼠（p=0.0072），NP+NP CD4 T细胞（p=0.0002），GDM CD4+T细胞+二甲双胍（p=0.0002），以及GDM CD4+T细胞+MitoTEMPO（p=0.0002）。

GDM-CD4+ T细胞受体大鼠的KIM-1和NGAL尿液排泄量显著增加（46.5 ± 10.0 pg/天，n = 8，p < 0.05；27.7 ± 4.5 ng/天，p < 0.05，n = 8），而NP裸鼠对照组（22.1 ± 3.4 pg/天，n = 8；11.9 ± 1.4 ng/天，n = 8）和正常血压CD4+ T细胞（5.9 ± 0.7 pg/天，n = 6，p < 0.05；7.2 ± 1.5 ng/天，n = 7）相比（图5I和J）。GDM CD4+ T细胞+二甲双胍治疗组（4.1 ± 0.4 pg/天，n = 4，p < 0.05；5.3 ± 2.0 ng/天，n = 7）、GDM CD4+ T细胞+ MitoTEMPO治疗组（3.8 ± 0.83 pg/天，n = 4，p < 0.05；5.1 ± 1.9 ng/天，n = 7）以及NP+NP CD4+ T细胞+二甲双胍治疗组（5.9 ± 0.7 pg/天，n = 4，p < 0.05；4.7 ± 1.5 ng/天，n = 6）的KIM-1和NGAL尿液排泄量比GDM大鼠受体组有所减少（图5I和J）。

转移人类GDM CD4+ T细胞后，胰腺组织结构发生变化。所有大鼠组都观察到了胰腺形态学变化，结果显示GDM-CD4+ T细胞受体大鼠的每个胰腺中的胰岛总数减少（p < 0.05）（图6A）。此外，如图6B–G所示，β胰岛的形态也发生了改变。

七面板图表中，面板a是一个条形图，面板b至g是六张组织学显微照片。面板a的条形图标题为“胰岛数量”，垂直轴标记为每个平方微米内的胰岛数量。水平轴显示六个组：NP裸鼠n = 5，NP+NP CD4阳性T细胞n = 4，NP+NP CD4阳性T细胞+二甲双胍n = 4，GDM CD4阳性T细胞n = 6，GDM CD4阳性T细胞+MitoTEMPOn = 3，GDM CD4阳性T细胞+二甲双胍n = 3。条形图显示GDM CD4阳性T细胞组的胰岛数量最低，NP+NP CD4阳性T细胞和GDM CD4阳性T细胞之间的p值为0.0277。面板b至g显示胰腺组织学显微照片，每张照片都显示一个胰岛。面板b对应NP裸鼠，面板c对应NP+NP CD4阳性T细胞，面板d对应NP+NP CD4阳性T细胞+二甲双胍，面板e对应GDM CD4阳性T细胞，面板f对应GDM CD4阳性T细胞+MitoTEMPO，面板g对应GDM CD4阳性T细胞+MitoTEMPO。胰岛在胰腺组织中呈现为细胞簇。

这些数据支持通过将GDM CD4+ T细胞转移至无胸腺的裸鼠中诱导出的GDM大鼠模型能够再现GDM表型的特征。GDM CD4+ T细胞组的大鼠表现出高血压、血糖升高、胰岛素敏感性下降以及胰腺功能障碍/形态改变等共同特征。这些特征还伴随着肾功能障碍，表现为蛋白尿增加和肾损伤标志物升高。GDM CD4+ T细胞大鼠没有出现巨大儿现象，反而怀孕期间胎儿体重减少。此外，使用二甲双胍或MitoTEMPO治疗可减轻怀孕期间的几种糖尿病表型特征，表明线粒体补充可能是一种潜在的治疗途径。

GDM被认为与由于胰腺β细胞功能障碍导致的葡萄糖耐量受损有关。研究表明，GDM的几个风险因素包括体重增加、种族、既往GDM妊娠史、糖尿病前期、吸烟或体力活动减少等；这些风险因素直接或间接与β胰岛细胞功能或胰岛素敏感性受损相关。因此，需要一个能够模拟人类GDM发病机制和临床特征的动物模型来进一步探讨其病因。GDM动物模型在理解该疾病并开发潜在治疗方法方面起着关键作用。啮齿类动物模型通常通过链脲佐菌素（STZ）或阿洛克anson等化学物质诱导，选择性损伤胰腺β细胞，根据剂量模拟I型或II型糖尿病；或者通过高脂肪和高糖饮食诱导来模拟人类GDM中的胰岛素抵抗。此外，大型动物模型如狗、羊和猪由于与人类的生理相似性，特别是在化学或饮食调整诱导的情况下，提供了更深入的见解。此外，基因操作技术（如db/db小鼠或催乳素受体修饰）有助于研究GDM的遗传方面。这些模型有助于开发更准确反映人类GDM状况的模型，标志着研究方法向更全面的方向发展。在这里，我们通过使用GDM女性患者的CD4+ T细胞来诱导GDM，以确定它们在GDM病理中的作用。我们将它们与接受正常血压CD4+ T细胞的动物以及接受常见和新治疗方法的动物进行了比较。最终，我们的结果表明，转移胎盘GDM CD4+ T细胞可以在我们提出的GDM大鼠模型中成功诱导出GDM特征，并且它们确实导致了胰腺β细胞功能障碍、血糖利用减少和怀孕期间的高血压。

CD4+ T细胞在多种妊娠障碍中已被研究，并与胎盘生长和功能不足、免疫系统改变以及细胞因子生成失衡有关。例如，在GDM并发症的妊娠中发现CD4+ T细胞增多，这种增多与母体系统的免疫反应改变有关。在GDM妊娠中，某些CD4+ T细胞亚群的扩增，特别是促炎性Th1细胞，会导致慢性炎症状态，这可能会加剧胰岛素抵抗和葡萄糖代谢紊乱。此外，调节性T细胞（Tregs），作为促进免疫耐受的CD4+ T细胞亚群，对健康妊娠至关重要，但其在GDM妊娠中的功能可能会受损，导致对胎儿的免疫耐受不足，从而进一步复杂化妊娠过程。从GDM患者中分离出的CD4+ T细胞的成功转移导致了GDM表型的显著表现，包括高血压和胰岛素敏感性下降。该模型说明了改变的免疫反应，特别是促炎性Th1细胞，如何促进慢性炎症状态，加剧胰岛素抵抗和葡萄糖代谢紊乱。总体而言，胎盘GDM CD4+ T细胞的增加存在和功能改变突显了妊娠期间免疫系统与代谢健康之间的复杂相互作用。

在三个治疗组中，接受MitoTEMPO（一种针对线粒体的抗氧化剂）治疗的大鼠显示出葡萄糖耐量和胰岛素抵抗改善、血压降低以及β胰岛数量增加，优于GDM组。尽管接受二甲双胍治疗的GDM大鼠也取得了类似的结果，但MitoTEMPO在治疗妊娠相关并发症（如子痫前期和妊娠糖尿病）方面显示出潜力。MitoTEMPO可能通过减少活性氧（ROS）和保护胎盘和胎儿组织来减轻与氧化应激相关的压力。MitoTEMPO模拟超氧化物歧化酶-1的作用，在线粒体内将超氧自由基催化为氧气和氢气，先前的研究表明它还能显著降低母体血压并增加RUPP大鼠模型中的胎盘和胎儿重量。此外，MitoTEMPO通过增强线粒体活性来改善胎盘功能，这对营养物质的输送和胎儿的氧气供应至关重要。其潜在的抗炎特性也可能有助于管理妊娠期间的炎症状况，降低早产等并发症的风险。尽管有这些有前景的治疗应用，但仍需要进一步的研究和临床研究来确定MitoTEMPO在妊娠期间的安全性和有效性。

我们的研究结果表明，从妊娠并发症中转移CD4? T细胞可以通过免疫介导的炎症途径导致心血管和代谢功能障碍。激活的CD4? T细胞释放促炎细胞因子并促进氧化应激，这会损害内皮功能并增加血管阻力，最终导致妊娠期间血压升高。此外，炎症信号传导和氧化应激会促进代谢活跃器官（如肾脏和胰腺）的组织损伤。在肾脏中，炎症介质和氧化应激可以破坏肾小球结构，并促进内皮细胞和足细胞的损伤 [引用39, 引用40]，这可能解释了本研究中观察到的肾功能损伤标志物和肾小球损伤的增加。同样，胰腺组织可能特别容易受到免疫介导的炎症和氧化应激的影响，这会改变胰岛形态并损害胰岛素分泌 [引用41, 引用42]，从而导致葡萄糖稳态失调。因此，这些发现表明，妊娠糖尿病（GDM）孕妇的胎盘CD4? T细胞可能在介导全身性血管和代谢功能障碍中起着重要作用。

本研究存在几个重要局限性。首先，我们没有对用于过继转移的蜕膜CD4? T细胞进行深入的免疫表型分析。尽管我们的发现支持这些细胞在促进GDM大鼠模型中代谢功能障碍方面的功能作用，但还需要进一步的表征来完全验证这一模型。未来的研究将探讨人类CD4+ T细胞的动态变化及其产生的细胞因子是否会影响胎盘功能和胎儿发育。未来研究还将研究这些蜕膜T细胞的活化状态、细胞因子谱型和免疫细胞类型，以更好地了解它们对母婴结局的影响。其次，我们在GDM CD4? T细胞群体中观察到了异质性，表现为过继转移后葡萄糖反应的双峰分布。这种变异可能反映了患者特定的因素，如胎儿性别、GDM的严重程度、血糖控制情况、治疗历史、样本采集时的妊娠年龄、母亲的BMI或遗传背景。最后，虽然我们使用了磁珠富集方法来分离CD4? T细胞，但并未通过流式细胞术确认CD3的表达，以明确区分T细胞与其他表达CD4的免疫细胞类型（如NK细胞或髓系细胞）。然而，我们团队和其他团队的先前研究已经验证了这种分离方法的有效性，表明通过磁珠分离富集的CD4?细胞表达CD3，并且主要是T淋巴细胞 [引用27, 引用43]。未来的研究将包括流式细胞术验证和细胞因子分析，以进一步研究GDM中的T细胞编程情况。

总之，将GDM胎盘CD4+ T细胞过继转移给无胸腺大鼠有效地模拟了GDM的表型，突出了高血压、葡萄糖调节异常和胰腺功能障碍等关键特征。尽管所提出的GDM大鼠模型无法再现巨大儿现象，但它揭示了胎儿体重减轻和肾功能障碍的重要机制，强调了GDM的多方面的性质。MitoTEMPO与二甲双胍联合使用在改善GDM症状方面的显著效果，突显了创新治疗策略在管理GDM方面的潜力。此外，对CD4+ T细胞的研究强调了免疫系统失调在GDM中的关键作用，表明进一步探索免疫靶向干预措施可能会为预防和治疗这种病症提供有价值的见解。总体而言，这项研究不仅增强了我们对GDM病理生理学的理解，也为未来旨在优化妊娠期间母婴健康的研究铺平了道路。

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