建立四重逆转录-定量PCR（Quadruplex RT-qPCR）方法以检测所有种类的PPRV病毒 焦旭（Jiao Xu） 李建英（Jiani Li） 王清华（Qinghua Wang） 周建民（Jiamin Zhou） 刘双（Shuang Liu） 王英丽（Yingli Wang） 于嘉荣（Jiarong Yu） 包景月（Jingyue Bao） 杨琳（Lin Yang）

《Animals》：Establishment of a Quadruplex RT-qPCR Method for the Detection of All Lineages of PPRV Jiao Xu, Jiani Li, Qinghua Wang, Jiamin Zhou, Shuang Liu, Yingli Wang, Jiarong Yu, Jingyue Bao and Lin Yang

**简单总结：**
我们开发了一种四重RT-qPCR方法，能够检测所有小型反刍动物瘟病毒（peste des petits ruminants virus, PPRV）的菌株，并验证了其性能特点。该方法能够在单个反应中区分所有病毒菌株，从而提高了检测效率。该方法与其他常见的动物病原体没有交叉反应，并保持了出色的重复性。与现有方法相比，它能够为临床样本提供一致且高度准确的结果。因此，该方法可以作为小型反刍动物瘟病的可靠鉴别诊断工具。

**摘要：**
小型反刍动物瘟病（PPR）是一种发病率和死亡率极高的传染病，全球不同地区已发现四种不同的病毒菌株。在本研究中，我们建立了一种能够区分四种PPRV菌株的四重RT-qPCR方法。通过筛选所有病毒基因组中的保守区域，我们设计了引物和四种TaqMan探针来实现这一目标。所建立的方法通过了相关特性的验证。通过测试浓度从10^8到100拷贝/μL的质粒稀释液，证实该方法可以检测到每微升中低至10个PPRV拷贝。四种探针之间以及其他常见的山羊和绵羊病原体之间均未观察到交叉反应。每种探针的批内和批间重复性变异系数（CV）均低于2%（批内：0.11%至0.98%；批间：0.18%至1.95%），表现出优异的重复性。对62个临床样本的测试也证实了该方法能够有效检测和区分不同PPR菌株的临床样本。这种方法首次实现了在单个反应中区分所有PPRV菌株，提高了PPR病毒的检测效率，为全球PPR根除计划提供了强有力的技术支持。

**1. 引言：**
小型反刍动物瘟病（PPR）是一种由小型反刍动物瘟病毒（PPRV）引起的严重传染病，主要感染小型反刍动物，其发病率和死亡率可高达100%[1]。作为一种跨境传染病，PPR在非洲和亚洲已流行数十年，给当地畜牧业造成了巨大损失。作为世界动物卫生组织（WOAH）列出的需报告疾病，FAO和WOAH的目标是在2030年前实现全球控制和根除PPR。
PPRV只有一个血清型，但可分为四种菌株[2]。其中，I型菌株主要在东非传播，尽管近年来该菌株的报道有所减少。II型菌株同样在东非流行，并且是几个西非国家的主要毒株。III型菌株主要分布在东非和阿拉伯半岛。IV型菌株的分布最广。近年来，除了在非洲传播外，它也成为大多数报告PPR疫情的亚洲国家的流行毒株[3]。值得注意的是，2024年多个欧洲国家首次报告了小型反刍动物瘟病的疫情，且疫情仍在继续蔓延。系统发育分析显示，一些欧洲国家流行的PPRV也属于IV型菌株[4]。中国于2007年首次报告了该病爆发；由于有效的预防和控制措施，疫情被限制在较小范围内[5]。2013年，该疾病再次传入中国，相关研究证实两次引入中国的PPRV菌株均属于IV型菌株，尽管它们属于不同的亚支[6]。

早期检测和准确鉴定对于预防和控制小型反刍动物瘟病至关重要。由于许多国家和地区已实施疫苗接种以建立免疫屏障，ELISA检测病毒抗体仅可用于评估疫苗效果，而不能用于确认PPR感染[7]。目前广泛使用病因诊断方法来诊断PPR，同时也有多种新的可视化诊断技术正在出现，包括RPA[8]、MIRA[9]和CRISPR[10]等。与传统技术相比，这些方法通常具有更短的检测时间、简单的操作流程和较高的可视化清晰度。然而，大多数这些方法的成本较高，难以在财政资源有限的环境中大规模应用。总体而言，RT-qPCR目前仍是PPR诊断的最合适技术。

除了及时检测病毒外，识别和分型循环毒株也是预防和控制PPR的重要组成部分。当非地方性病原体首次引入时，由于缺乏群体免疫力，可能在疫情初期导致高发病率和死亡率[11]。早期检测和迅速干预对于减少损失至关重要。传统方法涉及扩增和测序检测到的PPRV特定片段或完整基因组，随后进行系统发育分析以确定菌株类型[12]。这一过程通常需要大量时间。然而，开发鉴别诊断方法可以显著缩短这一流程，针对PPR也出现了这样的方法。

相关研究表明，虽然接种PPR疫苗会导致短暂的病毒排出，但排出的病毒不具备传染性[13]，但仍可能干扰PPR病例的确认。鉴于目前全球使用的大多数减毒疫苗都来源于II型菌株，Tang等人开发了一种能够区分II型和IV型菌株的检测方法，适用于IV型菌株流行的国家和地区[14]。针对亚洲地区IV型菌株的流行，我们还建立了一种针对该菌株的RT-qPCR检测方法，该方法具有较高的敏感性，能够检测到每微升中高达6个病毒拷贝[15]。尽管IV型菌株在全球范围内是主要流行菌株，但其他菌株仍在某些地区持续存在，并有可能扩散到其他地区[16,17,18]。因此，开发一种能够同时区分所有菌株的RT-qPCR检测方法将大大增强这种鉴别诊断方法的实用性。此外，在单个反应中实现菌株分型而无需后续测序将显著缩短整个诊断流程并提高检测效率。现有的大多数PPR检测方法均为通用检测方法，通常无法区分不同菌株。一些检测方法可以区分疫苗株和野生型株，但尚未有任何方法能够在单一反应系统中区分所有四种病毒菌株。该方法的开发填补了这一空白，对疫情监测具有重要意义；我们假设通过针对每种菌株特有的保守区域进行多重反应，可以开发出一步法四重RT-qPCR检测方法，不仅能够检测还能高灵敏度和特异性地区分所有四种PPRV菌株。进一步假设，在多种菌株共存的地区，这种新方法在通量和效率方面将显著优于现有的顺序或基于测序的方法。本方法的新颖性体现在两个方面：首先，它是首个能够在单个反应中同时检测和区分所有四种PPRV菌株（I、II、III和IV型）的RT-qPCR方法；其次，它无需扩增后的测序或顺序多重反应即可实现这一点，从而显著提高了通量并减少了周转时间。这与以往的方法形成鲜明对比，后者需要对每个目标进行单独反应或额外测序步骤才能确定菌株类型。为了验证这些假设，我们通过筛选每种菌株特有的保守区域设计了四种探针。通过优化反应条件，我们建立了一个包含一对引物和四组探针的反应系统，并验证了该方法的相关特性。这是首个能够在单个反应中区分所有四种菌株的RT-qPCR方法。

**2. 材料与方法：**
2.1. 病毒和质粒
本研究中使用的四种PPRV菌株的质粒由Sangon Biotech（上海）有限公司（中国上海）构建和验证；每个质粒包含一段449 bp的插入序列，从正向引物（核苷酸位置1735）开始，到反向引物（核苷酸位置2183）结束，每个质粒的浓度使用NanoDrop分光光度计（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）测定。PPRV I至IV型菌株、山羊痘病毒（GPV）、Orf病毒（ORFV）、口蹄疫病毒（FMDV）以及PPRV I至IV型菌株的毒株均储存在我们的实验室中，温度为-80 °C。

2.2. 引物和探针
从GenBank收集了代表所有四种PPRV菌株的93个基因组序列并进行了比对，序列信息见表S1。选择引物设计保守区域时遵循以下标准：
(i) 该区域必须在所有93个序列的引物结合位点中100%保守；
(ii) 扩增子长度应在300至500 bp之间，以容纳四种菌株特异性探针；
(iii) 该区域应围绕包含菌株特异性单核苷酸多态性（SNPs）的可变区域，以便通过探针进行区分。
对于菌株特异性探针的设计，采用了以下策略：首先确定每种菌株内的保守区域作为候选探针结合位点。为确保特异性，每种菌株的探针结合区域至少需要与非目标菌株的对应区域相差2-3个核苷酸，尤其是在探针的5′和3′端。探针序列本身不引入有意的不匹配；而是利用菌株间的天然多态性来实现特异性。通过BLASTn将每种探针与所有93个序列比对，确认没有与非目标菌株的意外匹配。根据上述原则，为每种菌株的磷蛋白（P）基因内的保守区域设计了一对引物和四种菌株特异性探针。表1总结了本实验中使用的引物和探针及其位置；扩增子大小为449 bp。

2.3. 反应体系的建立
病毒RNA使用病毒DNA/RNA提取试剂盒（Hzymes Biotech，中国上海）提取。扩增和检测使用Applied Biosystems QuantStudio 1 Plus实时PCR系统（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）和一步法RT-qPCR试剂盒（QV114-01，Vazyme，南京）进行。每个25 μL反应体系包含：12.5 μL动物检测U+探针qPCR Super PreMix、1 μL正向和反向引物（10 μM）、每种探针0.5 μL（10 μM）以及3 μL病毒RNA和5.5 μL ddH2O。反应程序设置为：逆转录步骤在50 °C下进行10分钟，然后灭活逆转录酶并在95 °C下激活DNA聚合酶5分钟。随后进行40个扩增循环，每个循环包括在95 °C下变性15秒和在60 °C下退火30秒。荧光信号从四个通道收集，分别对应相应的探针。每个样本的所有反应重复三次（n = 3），整个实验在不同日子重复三次（三次运行），以评估重复性。

2.4. 数据分析与解释标准
如果扩增曲线呈现典型的S形且Ct值≤39.15（临界值），则样本被判为阳性；如果没有检测到扩增曲线或Ct值>39.15，则样本被判为阴性。对于菌株鉴定，将在同一孔中分析四种菌株特异性探针（分别标记为FAM、VIC、CY5和ROX）。当检测到特定谱系的荧光信号，并且Ct值和扩增曲线满足解释标准时，该样本被视为该谱系的阳性。关于扩增曲线的处理，基线由实时PCR软件自动设置，必要时手动调整以排除早期循环中的背景荧光。阈值线位于扩增曲线的指数阶段中间，通常由软件自动确定的ΔRn值决定。所有原始数据都经过手动审查，以确认每个阳性曲线显示清晰的指数增长和平台期；具有非特异性背景、坡度平缓或无平台期的曲线应被丢弃，并重新测试样本。

2.5 特异性测试
我们使用已建立的方法来检测PPRV谱系I至IV，以及常见的绵羊或山羊病毒，如ORFV、GPV和FMDV，以评估该方法的特异性。

2.6 灵敏度和重复性测试
为了评估该分析方法的灵敏度，我们使用了含有PPRV序列的预先构建的质粒。这些质粒从10^8拷贝/μL^-1起连续稀释十倍。在不同浓度下，使用不同探针扩增的Ct值以及阴性对照的值被收集起来，以评估方法灵敏度并生成标准曲线。为了进行重复性测试，我们选择了高（10^7拷贝/μL^-1）、中（10^5拷贝/μL^-1）和低（10^3拷贝/μL^-1）浓度的PPRV谱系质粒来评估重复性。

2.7 野外样本检测
我们使用之前收集的62个临床样本验证了已建立的检测方法；谱系I和谱系III的核酸来自小反刍动物瘟疫参考实验室（WOAH Reference Laboratory for Peste des Petits Ruminants）提供的临床样本中的病毒分离物。这些样本已通过RT-qPCR确认为PPRV核酸阳性或阴性[19]，并通过测序确定阳性样本的谱系。然后根据其检测结果评估了我们新建立方法的可靠性。

3. 结果
3.1 引物和探针的多序列比对
为不同谱系设计的引物和探针结合区域在相应的谱系菌株中高度保守，这表明本研究中开发的引物和探针具有作为差异诊断方法所需的特性（图1）。
图1. 针对多种PPRV菌株的基因的引物和探针比对。正向引物、探针和反向引物的序列分别显示在框内。设计的引物与大多数流行性PPRV菌株的良好匹配；不同谱系的探针结合区域在相应的谱系菌株中高度保守。

3.2 开发方法的特异性
每个探针仅检测其对应的谱系，没有交叉反应。未观察到ORFV、GPV、FMDV或阴性对照的扩增（图2和表2）。
图2. RT-qPCR测定的特异性测试。所有探针只能检测其对应的小反刍动物瘟疫病毒谱系，彼此之间或其他病毒之间没有任何交叉反应；不同谱系的检测Ct值已标记在图中。
表2. 开发方法的特异性。

3.3 开发方法的灵敏度
所有探针都能检测到低至10^1拷贝/μL^-1的病毒。在100拷贝/μL^-1或ddH2O时未获得Ct值。构建了四重RT-qPCR测定的标准曲线；谱系I至IV的相关系数均高于0.99（I：0.999，II：0.998，III：0.998，IV：0.998）（图3）。谱系I至IV的效率分别为95.8%、95.2%、96.5%和93.6%（表3）。
图3. 四重RT-qPCR的灵敏度测试和标准曲线。所有探针都能检测到低至10^1拷贝/μL^-1的病毒。构建了四重RT-qPCR测定的标准曲线；谱系I至IV的相关系数均高于0.99。表3. 已建立方法的效率。

3.4 开发方法的重复性
如表4所示，在不同浓度下进行了重复性测试，检测到了不同的PPRV谱系。所有测试的谱系的变异系数（CV）均低于2%（实验间）和1%（实验内）。
表4. 重复性测试结果（n = 3）。

3.5 野外样本检测
近年来共收集了62个临床样本，包括24个PPRV阴性和38个阳性样本，涵盖了所有谱系。检测结果显示在图4和表5中；所有38个阳性样本均被成功检测到，并且不同谱系的PPRV也得到了完全区分（表6）。谱系I的Ct值范围为21.29至32.33，谱系II为16.32至25.00，谱系III为22.70至31.30，谱系IV为9.72至31.19，这与已知的背景信息完全一致。
图4. 野外样本的检测。所有阳性样本均被成功检测到，并且不同谱系的PPRV也得到了完全区分。表5. 临床样本信息和RT-qPCR的检测结果。表6. 新开发的检测方法与Sanger测序在谱系区分上的一致性。

3.6 该检测方法结果与参考方法之间的一致性比较
共有62个临床样本同时接受了新开发的检测方法和参考RT-qPCR方法的测试。参考方法检测为阳性的所有样本均被新建立的方法检测到，该方法显示出100%的相对检测率；两种方法获得的Ct值之间存在强烈的正相关（R2 = 0.979）。这些结果表明，新开发的检测方法在Ct值量化方面与参考方法相当。
图5. 该检测方法结果与参考方法之间的一致性比较。新检测方法获得的Ct值与参考RT-qPCR的结果非常一致，R2 > 0.9。

3.7 诊断准确性的评估
为了评估新开发的四重RT-qPCR检测方法的临床诊断准确性，将结果与Sanger测序作为金标准进行了比较。如表7所示，该检测方法的诊断灵敏度为100%（95%置信区间：90.7–100%），诊断特异性为100%（95%置信区间：94.2–100%）。总体一致率为100%（62/62）。Cohen’s kappa系数为1.00（95%置信区间：0.93–1.00），表明新方法与金标准之间完全一致。
表7. 诊断准确性的评估。

4. 讨论
作为最具破坏性的跨界动物疾病之一，PPR对发展中国家尤其造成了严重的社会经济负担[20]。作为回应，FAO和WOAH于2015年启动了全球根除计划（GEP），基于早期的PPR全球控制和根除战略，目标是在2030年前在全球范围内根除该疾病[21]。GEP的成功取决于准确、及时且可获得的诊断工具。实验室检测在早期检测、疫情响应和监测中起着基础性作用，这些都是协调控制和根除工作的关键组成部分。在PPR监测和评估工具（PMAT）中，诊断方法是评估国家能力和监测根除进展的关键指标[22]。可靠的诊断系统对于确认临床病例、验证无病状态以及验证监测数据至关重要，从而为从控制阶段过渡到根除阶段提供必要的证据。
PPR的实验室检测通常包括病毒分离、病因检测和血清学检测。其中，病毒分离被认为是PPR诊断的金标准，因为可以通过观察接种病理样本后在Vero或Vero-SLAM细胞（表达SLAM/CD150受体）上的细胞病变效应（CPE）来确定感染[23]。然而，这种诊断方法需要较高的技术水平且耗时较长，不适合大规模检测。抗体的检测对于确定之前的PPRV暴露、追踪疫苗诱导的免疫以及评估群体水平的保护作用至关重要。这些方法提供了关于历史感染、疫苗接种状态和总体群体免疫的宝贵信息，因此在血清监测和根除PPR的努力中发挥着重要作用[21]。ELISA是最常用的血清学检测技术，主要包括阻断ELISA（bELISA）和竞争性ELISA（cELISA）。这些检测主要针对病毒核蛋白（N）或血凝素（H）的抗体。由于它们具有高灵敏度和特异性，因此被广泛用于血清学诊断、监测和监测。但由于它们无法区分接种动物和自然感染的动物，这些方法通常不适用于检测动物的PPR感染；但对于从未接种过疫苗的动物，病毒抗体的存在可以解释为当前感染或过去的PPRV暴露。
基于核酸的检测方法具有高灵敏度和特异性，能够检测病毒RNA。通过靶向PPRV基因（N、F、H或P）的保守区域，它们能够早期诊断即使是轻微或亚临床感染，同时区分PPRV与其他相关麻疹病毒。与RT-PCR相比，RT-qPCR是确认PPR疫情的关键工具，可以更快、更灵敏、更特异地检测病毒RNA。它可以在几小时内完成整个检测过程，检测限低至几个拷贝。更重要的是，其低成本使其非常适合大规模实验室检测。这种能力有助于及时干预，并有助于遏制PPRV的传播，这已在不同国家的许多疫情中得到验证。目前，已经开发了针对病毒基因N、F和P的一系列RT-qPCR方法，检测限（LODs）为10–32个基因组拷贝[25,26,27,28]。这也促进了能够同时检测多种病原体的多重RT-qPCR检测方法的发展。Settypalli等人建立了一种多重RT-qPCR检测方法，可以同时检测多种病原体，如PPRV、山羊痘病毒、多杀巴斯德菌和capricolum ssp. capripneumoniae，提供了一种经济高效且节省时间的差异诊断工具[29]。然而，尚未开发出区分不同PPRV谱系的多重RT-qPCR方法。
本研究建立了一种四重RT-qPCR检测方法，能够同时区分四种PPRV谱系。与常见的双重和三重检测方法相比，这种方法提供了更高的通量；此外，当样本体积有限（如临床拭子、组织匀浆或环境样本）时，这种四重PCR只需要一个样本即可进行多次检测，从而避免了样本体积不足或采样错误相关的问题。我们的方法仅使用一对引物，显著降低了传统多重PCR中常见的二聚体形成和发夹结构的可能性，从而提高了方法的稳定性[30]。
我们的验证结果表明，该方法的检测灵敏度可以达到每微升10个拷贝，这略低于只能检测单个位数的单重RT-qPCR。这是因为容纳四个TaqMan探针需要适当增加扩增子大小，这略微降低了灵敏度[31,32]。尽管如此，这对于常规检测应用来说仍然足够。特异性结果也表明，四个探针只能识别其对应的小反刍动物瘟疫病毒谱系，彼此之间或其他病毒之间没有交叉反应。这对于确保检测结果的准确性至关重要。临床样本的检测结果还表明，该方法可以识别并检测所有PPRV谱系。据我们所知，这是第一个开发出能够同时检测并明确区分所有四种小反刍动物瘟疫病毒（PPRV）的单反应四重RT-qPCR检测方法。我们将我们的方法与先前报道的PPRV检测方法进行了比较，总结在表8中。
表8. 新开发的四重RT-qPCR检测方法与先前报道的PPRV检测方法的比较。这种方法对于不同疫情情况下的PPR监测具有重要意义。在多种谱系共存的地区（特别是在非洲国家），它能够快速识别阳性样本中的病毒谱系，而无需后续测序。在那些流行病毒谱系相对单一的地区，这种方法可以作为常规的PPR（小反刍动物瘟热）监测工具，能够立即检测到任何其他谱系的引入，并有助于迅速采取有效的防控措施。总之，作为一种设计难度较高的检测方法，这种四重RT-qPCR检测方法的建立对于全球根除PPR具有重大意义。尽管新开发的检测方法表现出色，但仍需认识到一些局限性。首先，该方法的灵敏度是通过质粒标准品而不是体外转录的RNA或活病毒来确定的。质粒DNA通常比RNA更稳定且扩增效率更高，这可能导致在应用于临床RNA样本时高估了其分析灵敏度。其次，特异性检测组包含的病原体种类相对较少（GPV、FMDV、ORFV）。虽然没有观察到交叉反应，但该方法尚未针对野外样本中可能存在的其他副粘病毒或反刍动物病原体进行测试。第三，由于谱系I和谱系III的地理分布有限且流行率较低，因此检测到的阳性临床样本数量也较少。有必要使用更大、更多样化的野外样本进行进一步验证，尤其是针对这些罕见谱系。此外，该检测方法的另一个潜在局限性是流行病毒株中可能存在探针结合区域的突变。作为RNA病毒，PPRV容易发生基因进化，目标区域可能会出现核苷酸替换、插入或删除。这些突变可能会降低或丧失探针的结合能力，导致假阴性结果或错误的谱系鉴定。尽管引物和探针结合区域是根据93个公开可用的、代表所有四种谱系的基因组中的保守序列选择的，并且我们的野外样本中没有发现错配，但仍然需要持续监测新出现的PPRV株。为了保持该检测方法的长期准确性和可靠性，可能需要定期监测目标区域并更新探针序列，尤其是在根除工作进展过程中以及病毒群体发生变化的情况下。

5. 结论
所有实验结果均表明，我们建立的方法能够在单次反应中有效检测四种不同谱系的小反刍动物瘟热病毒。该方法稳健、灵敏度高且特异性强，大幅提高了小反刍动物瘟热病毒鉴别诊断的效率。通过使用更大规模、地理分布更广泛的临床样本进行进一步验证，将有助于增强该检测方法的实际应用价值。

补充材料
以下支持信息可在此处下载：
https://www.mdpi.com/article/10.3390/ani16091397/s1
表S1：本研究中使用的参考菌株详细信息。