《Journal of Virology》：Comparison of Ebola virus infection routes and resulting disease in animal models
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埃博拉病毒病（Ebola virus disease, EVD）是由埃博拉病毒（Ebola virus, EBOV）引起的一种高致病性、致死性疾病。该病流行于撒哈拉以南非洲地区，自1976年以来，EBOV在零星爆发的EVD疫情中一直引发全球卫生关注，特别是20
埃博拉病毒病（Ebola virus disease, EVD）是由埃博拉病毒（Ebola virus, EBOV）引起的一种高致病性、致死性疾病。该病流行于撒哈拉以南非洲地区，自1976年以来，EBOV在零星爆发的EVD疫情中一直引发全球卫生关注，特别是2013年至2016年西非的疫情。EBOV通过受污染体液接触黏膜或皮肤破损处传播，具有高致死率，因此被指定为优先病原体和需在最高防护等级实验室（maximum containment laboratories）中进行研究的特定制剂（select agent）。历史上，EBOV主要在动物模型中通过肌内（intramuscular, IM）和腹腔内（intraperitoneal, IP）接种等人工感染途径进行研究，这些模型能准确重现人类疾病的进程、症状和结局。近期，学界致力于通过黏膜接种途径表征动物模型中的疾病，旨在更精准地模拟人类感染及EVD的发展。本综述旨在总结和表征EBOV研究中使用的不同动物模型及其感染途径，概述“人工”与黏膜感染途径在疾病进程上的差异，并将其与人类EVD病程进行比较，以突显异同点。
引言
埃博拉病毒（EBOV）于1976年在扎伊尔（现刚果民主共和国）首次被发现，属于丝状病毒科（Filoviridae），是埃博拉病毒病（EVD）的病原体。EVD症状包括发热、皮疹、腹泻、肌痛、凝血功能障碍、异常出血以及肝脾变性，最终导致多系统器官衰竭。由于EVD爆发的不频繁性及其地理位置偏远，利用人体试验来确定治疗药物或疫苗等医疗对策（Medical Countermeasures, MCMs）的有效性极具挑战性。因此，动物模型成为表征发病机制和免疫反应的主要工具。美国食品和药物管理局（FDA）将动物规则（animal rule）视为EVD等疾病MCM审批的途径。然而，不同动物模型面临成本、可获得性、操作便利性和伦理问题等挑战。历史上，动物通过IM和IP等人工途径接种，虽能精确控制病毒剂量，但人类传播主要通过黏膜途径和经皮皮肤破损。因此，近年来，鼻内（IN）、口腔、眼部和气溶胶（AE）等黏膜途径被用于丝状病毒感染研究，揭示了疾病进程和发病机制的差异。
人类
EBOV通过感染者血液等体液传播。病毒经黏膜或皮肤破损进入体内后，主要靶向感染部位的树突状细胞和巨噬细胞，随后将这些感染的细胞运送至引流淋巴结，进而扩散至肝脏和脾脏。潜伏期至少3天后，EVD早期表现为非特异性症状，如肌痛、疲劳、不适和暴露后8-10天的发热。随后几天（暴露后10-14天），患者出现腹痛、呕吐和腹泻，且排泄物中含有高滴度病毒。此阶段可能出现特征性瘀点样皮疹及牙龈、眼睛等处的凝血功能障碍和出血。细胞因子失调常见于人类病例，白细胞介素（IL）和肿瘤坏死因子（TNF）水平飙升，干扰素（IFN）反应受损，导致重症病例出现细胞因子风暴，增加致死可能性。EVD患者常见白细胞减少症、血小板减少症和中性粒细胞增多症。随着疾病进展，病毒复制、血管渗漏和细胞因子风暴导致的器官损伤愈发明显，终末期病例表现为系统性感染，导致肾损伤、肌肉横纹肌溶解和脑炎，最终多器官衰竭死亡。然而，人类EVD并非均致死，2013-2016年西非疫情中约50%的生存率表明，幸存者通常在发病后6-10天开始好转。
非人灵长类动物（NHPs）
NHPs，特别是恒河猴和食蟹猴，被视为EBOV研究的金标准。食蟹猴的EVD病程较恒河猴压缩，呈现更严格的模型，故常用于疫苗效力研究；而恒河猴则更适用于评估治疗剂，因其提供更长的治疗窗口。两种猕猴通过多种途径感染野生型（WT）EBOV均能紧密重现人类患者的EVD。历史上，猕猴通过尾部大腿IM接种WT-EBOV，模拟意外针刺暴露。尽管IM是高标准的MCM开发途径，但它不能准确模拟发生于黏膜表面的自然暴露。当以1,000 PFU IM感染时，恒河猴迅速出现发热（感染后3天[3 DPI]），随后在5-6 DPI出现瘀点样皮疹。疾病体征包括3 DPI内出现的血毒症、凝血功能异常、血小板减少、红细胞压积和血红蛋白下降，罕见情况下出现孔窍和黏膜出血。免疫系统失调表现为淋巴细胞减少和细胞因子风暴，伴随IFN、IL和巨噬细胞炎症蛋白（MIP）的积累。该病平均死亡时间为6.5 DPI，尸检常见肝脏肿大易碎、脾脏及淋巴结肿大伴出血水肿。虽然IM是标准感染途径，但NHPs对IP接种也易感，尽管这不常用。当以6 PFU WT-EBOV IP感染时，未接种的食蟹猴均于5-7 DPI死亡，表现出与恒河猴相同的疾病体征。
NHPs在黏膜感染后也会发展为致命性EVD，包括IN途径。一项研究比较了食蟹猴IN（两组：120和500 PFU）和IM（100 PFU）感染WT-EBOV后的差异，发现IN组的平均死亡时间（8.9 DPI）长于IM组（7 DPI），临床症状出现也更晚。这种黏膜感染后病程延长现象在恒河猴和食蟹猴中一致，并与人类感染观察结果相符。虽然大多数临床参数相似，但IM组记录了更多的肝损伤。IN组早在3 DPI即检测到病毒血症，而IM组在5 DPI才出现。病毒血症和肝损伤的差异提示两组间早期复制位点不同。此外，IN组胃肠道（GI）出血和凝血异常更为显著。血小板计数在IN和IM组均从约3 DPI开始下降。其他黏膜感染途径包括结膜和口腔途径，但与IM和IN相比，需要更高的病毒感染剂量才能引起致命疾病。结膜感染的存活率呈剂量依赖性，10,000 PFU导致全部死亡，100 PFU则有80%存活。相比之下，口服10,000 PFU WT-EBOV的NHPs虽有40%存活。不同研究中口服感染的结果差异提示NHP物种和EBOV分离株等因素影响疾病结局。气溶胶途径也可在NHPs中实现EBOV感染，同样呈剂量依赖性，高剂量导致全部死亡。例如，1,000 PFU AE感染可在7-10 DPI导致全部死亡。鉴于NHPs和人类中自然黏膜感染和传播的显著性，利用黏膜感染途径重现EVD对于增进疾病进展理解和识别新治疗方案至关重要。
小鼠
尽管小鼠重现人类EVD的程度不及NHPs，但其成本低、易于操作且拥有丰富的基因敲除品系和分析试剂，使其成为丝状病毒发病机制研究中最常用的动物物种。通常，野生型小鼠接种WT-EBOV无论何种途径均不发病。为获得毒力，需通过在哺乳期小鼠体内连续传代生成鼠适应型（MA-）EBOV。当IP接种MA-EBOV时，野生型小鼠出现疾病并全部死亡。当皮下（SC）或IM接种时，MA-EBOV不引起疾病，反而赋予针对随后IP再感染的免疫力。IP感染的小鼠表现出人类和NHPs的部分EVD特征，包括肝脾病毒损伤、肝细胞酶升高、变性和坏死、血小板减少及偶发轻度凝血病。高滴度的EBOV复制发生在脾脏、肝脏和淋巴结，导致器官变性、病变形成并最终坏死。早期检测到病毒血症及TNF-α和单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）等促炎细胞因子。这种增强的细胞因子反应失调导致致死。观察到的弱IFN-α和强TNF-α反应已被证明是IFN信号下调的结果。值得注意的是，SC感染时观察到更早、更显著的IFN-α反应，从而产生更强的先天免疫反应以提供保护。奇怪的是，感染MA-EBOV的小鼠不会出现人类和NHP EVD常见的瘀点样皮疹，且凝血病表现不一致。
免疫缺陷或具有（部分）人源化免疫系统的小鼠在WT-EBOV感染后可能出现EVD样疾病。缺乏IFN-α/β受体（IFNAR?/?）的小鼠在一周内死于WT-EBOV感染。IFNAR?/?和STAT1?/?小鼠以及经抗IFN-α/β抗体处理的免疫 competent野生型小鼠在IP和SC途径感染MA-EBOV或WT-EBOV后均观察到致命疾病，IP途径导致更短的死亡时间。在免疫缺陷小鼠的脾脏和肝脏中发现大量复制病毒。这些观察结果表明，对致命性EBOV感染的保护至少部分归因于功能性I型IFN反应。然而，由于这些小鼠的免疫缺陷性质，很难从中提取可转化至人类EVD的免疫学发现。
植入人免疫细胞的“人源化小鼠”在WT-EBOV感染后已显示出发展EVD样疾病的能力。不同类型的HIS小鼠通过IM、IN和IP途径感染WT-EBOV均可发生致命疾病。例如，Hu-NSG-SGM3小鼠表达人IL-3、GM-CSF和SCF细胞因子，仅10 PFU WT-EBOV IM感染即导致66%的死亡率。另一项研究中，Hu-NSG-A2小鼠通过IN感染WT-EBOV以模拟黏膜传播，1,000 FFU剂量下导致>92%的死亡率，小鼠持续在10-20 DPI死亡。血清中检测到高水平的病毒血症和天门冬氨酸氨基转移酶（AST）。
仓鼠
与小鼠类似，叙利亚金黄地鼠作为实验动物容易获得，但感染WT-EBOV也不发病。然而，MA-EBOV IP接种可导致致命疾病。地鼠SC接种MA-EBOV则不发病。地鼠的EVD样疾病体征包括I型干扰素抑制形式的细胞因子失调、淋巴细胞凋亡和降解，以及脾脏、肝脏和淋巴结的坏死，这些均类似于人类和NHPs的表现。与小鼠不同，地鼠表现出类似于NHPs和人类的凝血病。然而，地鼠不显示瘀点样皮疹，这是与人类EVD的一个差异。在COVID-19大流行之前，地鼠并未广泛用于传染病研究，因为缺乏深入分析免疫反应的工具。但随着大流行，试剂开发加剧，现已具备多种解析T细胞和细胞因子反应的工具。
豚鼠
与小鼠和地鼠一样，豚鼠在WT-EBOV接种后不发病。豚鼠适应型EBOV（GPA-EBOV）通过在豚鼠体内连续传代WT-EBOV生成，当其IP接种至豚鼠时，动物发展出EVD样疾病。与小鼠和地鼠不同，豚鼠更准确地重现了人类EVD的标志性症状。这不仅为NHPs和人类的MCM效力测试提供了更高的预测价值，还允许更准确地理解取决于接种途径的疾病发展。豚鼠IP感染GPA-EBOV发展出全部致死性疾病，于8-9 DPI死亡。IP感染产生许多EVD的标志性症状，包括体重减轻、血小板减少、淋巴细胞计数和肝酶水平增加以及病毒血症。GPA-EBOV最初在肝脏和脾脏中复制至高滴度，然后扩散至肾脏、肺、胰腺和肾上腺。与小鼠相比，豚鼠会发烧，凝血异常一致，且疾病进程普遍较慢。豚鼠对SC感染GPA-EBOV也易感，这导致疾病发作延迟以及病毒血症降低。尽管疾病发作延迟，SC感染仍是全部致死的，且疾病体征与IP感染豚鼠相似。
值得注意的是，豚鼠也对IN等黏膜感染途径易感。以10,000 LD50GPA-EBOV IN感染的豚鼠观察到全部致死，平均死亡时间为8.7 DPI（长于同剂量IP组的7.3 DPI）。疾病体征包括快速体重减轻、发热、体温过低和早期病毒脱落，尤其见于鼻拭子。由于有效的病毒脱落，与IP感染的供体豚鼠相比，病毒更容易传播给 naive 豚鼠。IN感染的豚鼠除了表现出与IP组相似的肺部疾病体征外，还导致了显著的肺炎和更严重的病变。组织学分析显示，这些豚鼠肺部的肺泡气腔中含有大量变性的巨噬细胞、粒细胞和坏死碎片。尽管与小鼠相比，豚鼠对EBOV MCM开发具有更高的预测价值，但可用于分析细胞免疫反应和细胞因子反应的试剂有限，阻碍了该模型的使用。
雪貂
雪貂属于食肉目鼬科（Mustelidae），不同于经典的啮齿类疾病模型。在过去十年中，雪貂更多用于研究EBOV发病机制，因为它们不需要病毒适应即可发展出致命疾病。与其他非啮齿类动物模型（如NHPs）相比，雪貂具有若干优势：它们更易获得，获取成本更低，便于在BSL4实验室中研究更大的群体规模并易于操作。雪貂通过IM或IN途径感染WT-EBOV，即使剂量低至0.1 PFU，也会在5-7 DPI发展出全部致死性疾病。疾病体征包括体重减轻、发热、凝血病和血小板减少、病毒血症和免疫失调，表现为淋巴细胞减少、中性粒细胞增多以及TNF-α和许多其他促炎细胞因子和趋化因子的水平升高。无论感染途径如何，死亡时均在肝脏、脾脏、肾脏和肺部发现高病毒滴度。感染雪貂还表现出瘀点样皮疹，这是人类和NHPs EVD的标志，而在啮齿类模型中并不一致。与豚鼠类似，IN感染的雪貂表现出严重的肺部病理改变，包括肺炎、细支气管炎和血管周围炎。
雪貂对包括口腔、眼部和口鼻腔在内的黏膜感染途径敏感。眼部感染高达100 PFU WT-EBOV的雪貂仅发展极轻微或无疾病并存活；病理分析显示存在亚临床感染。相比之下，口腔和口鼻腔感染的雪貂发展为全部致死性疾病。大多数雪貂在5-6 DPI死亡，尽管一只经口感染1 PFU WT-EBOV的雪貂直到10 DPI才死亡。这些途径的疾病体征包括发热、瘀点样皮疹、肝脏、脾脏和肾脏的高病毒滴度、凝血病、淋巴细胞减少和中性粒细胞增多，与其他感染途径（黏膜[IN]和人工[IM]）一致。雾化WT-EBOV也可用于感染雪貂。一项比较IM和AE感染的研究发现，脾脏和肝脏中的病毒以及病毒血症在AE模型中更早出现。反之，发热、疾病临床体征、全身炎症和肝脏病理在IM组中发生得更早。此外，AE组死亡所需时间更长（6-7 DPI而非IM的5-6 DPI）。仅在AE组观察到肺部受累，而IM组显示肾损伤。
讨论
在动物模型中建模和研究EVD时，感染途径对所观察到的疾病进程具有显著影响。通常，EBOV IP注射最常用于啮齿类动物，病毒首先感染腹腔内的巨噬细胞，然后通过淋巴系统到达脾脏。这种人工感染途径虽然能够控制感染剂量和体积，但导致疾病快速发展且通常致死，这虽然理想于MCM开发，但并不能重现自然的疾病过程。相比之下，黏膜感染途径靶向上呼吸道的巨噬细胞和树突状细胞，这些细胞随后迁移至区域淋巴结，再到达脾脏和肝脏。如上所述，感染途径决定了病理差异，包括肺部和胃肠道的损伤。肝脏病理的差异也有记录，EBOV IM注射导致更高水平的肝损伤和变性。人工（IP和IM）与黏膜/自然感染途径（黏膜和经皮）的差异还影响死亡时间、发病时间以及病毒血症水平。虽然人工途径暴露导致一致但缩短的疾病过程，并为MCM开发设定了高标准，但它们并不能忠实地重现人类疾病，因此在解释临床前数据时应谨慎。通常，包括NHPs在内的动物模型症状发作较早；然而，人类EVD中由呕吐和腹泻引起的广泛脱水在动物模型中往往不存在。
当通过黏膜途径暴露于EBOV时，NHPs、豚鼠和雪貂显示出比通过人工途径（如IM或IP）感染的动物延迟的EVD体征和更长的疾病过程。豚鼠和NHPs的IN感染均导致一致的病程延长。虽然雪貂的大多数感染途径导致的死亡时间相似，但口腔和气溶胶途径导致更长的疾病过程。这些较长的疾病过程更准确地代表了人类EVD，允许更深入地表征EVD，并在通过黏膜途径感染的动物模型中更准确地测试和使用MCMs。通过黏膜途径延长的疾病过程和EBOV感染存活也将使我们能够扩展对后遗症和病毒复燃的理解，正如在人类EVD幸存者中所观察到的那样。
动物模型中黏膜感染途径与胃肠道和肺的严重病理相关。胃肠道受累是人类EVD的常见症状。肺部症状在EVD患者中也已有报道，并随着疾病进程的进展变得更加明显。通过更精确地重现动物模型中的人类EVD体征，研究人员对MCMs对疾病特定方面的影响有了更好的理解。同样，黏膜感染使得动物间的病毒传播调查率远高于其他途径。早期的快速病毒脱落导致从IN感染的豚鼠到 naive 笼友的传播率增加，导致 naive 动物的死亡率显著升高。通过黏膜途径攻毒的NHPs在没有直接接触的情况下将EBOV传播给了 naive NHPs，肺部病理表明存在黏膜传播。黏膜攻毒已被证明能更忠实地重现人类EVD的时间框架、病理和症状。在动物模型中使用黏膜攻毒途径可以更好地模拟人类传播和EVD，提供我们可以研究和治疗的更现实的EVD模型。虽然黏膜感染途径可能更好地重现EVD，但在使用这些方法时存在障碍。使用人工途径的好处之一是全部致死性。显示全部致死性的动物模型是MCM开发所追求的，因为可以用更少的动物实现统计学显著性。通过黏膜途径感染的NHPs的死亡率高度可变且依赖于剂量，因此在MCM研究中将需要更多的动物数量或导致生存原因的不确定性。此外，人工途径创造了更紧凑且相对一致的死亡时间，最大限度地减少了实验长度和所需试剂。如前所述，使用黏膜途径的动物研究在死亡时间上可能有显著差异。关于感染途径如何影响EVD病程的理解仍存在空白。必须开展进一步工作以充分表征免疫反应、病毒复制、结果等方面的变化。EBOV研究的一个新焦点涉及幸存者的后遗症和复燃。后遗症是指不一定与病毒持续存在相关的既往疾病状况，而复燃是指EVD症状的复发及潜在的再次感染，这是初始感染和EVD之后的不同状况。在西非流行之后，很明显许多幸存者经历了后遗症，病例偶尔会变得严重甚至危及生命。在病毒持续性方面，在幸存者的某些身体部位（如眼部和精液）发现了病毒RNA，那里的免疫环境允许其存活，并通过接触（如性传播）导致随后的爆发。在动物中使用黏膜途径更精确地模拟EVD过程，可以让研究人员在实验室环境中复制后遗症和复发病例，并更好地理解其原因和治疗方法。
