开发与优化用于检测口蹄疫病毒O型的间接夹心ELISA方法 穆罕默德·穆贾希德·阿姆杰德（Muhammad Mujahid Amjed）， 库希·穆罕默德（Khushi Muhammad）， 马苏德·拉巴尼（Masood Rabbani）， 阿曼·乌拉·汗（Aman Ullah Khan）， 穆罕默德·穆巴沙尔·贝格（Muhammad Mubashar Beig） 以及 穆罕默德·阿萨德·阿里（Muhammad Asad Ali）

《Immuno》：Development and Optimization of an Indirect Sandwich ELISA for Detection of Foot-And-Mouth Disease Virus Serotype O Muhammad Mujahid Amjed, Khushi Muhammad, Masood Rabbani, Aman Ullah Khan, Muhammad Mubashar Beig and Muhammad Asad Ali

口蹄疫（Foot-and-Mouth Disease, FMD）由FMD病毒（FMDV）引起。本研究标准化了间接夹心酶联免疫吸附试验（Indirect Sandwich Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, IS-ELISA）以表征FMD O型病毒。豚鼠血清（全血清）、硫酸铵沉淀豚鼠血清（Ammonium Sulfate Precipitated Guinea Pig Serum, ASPGPS）蛋白及离子交换纯化豚鼠血清（Ion-Exchange-based purified Guinea Pig Serum, IEGPS）蛋白的总蛋白浓度分别为52 μg/mL、24 μg/mL和10 μg/mL。豚鼠和兔的全血清显示出1:32和1:64的抗FMD O型病毒中和抗体滴度，而IEGPS蛋白的抗FMD O型病毒中和抗体滴度达到1:128。将具有1:128中和抗体滴度的IEGPS蛋白用作捕获/诱捕抗体进行试验标准化。研究发现，蛋白浓度为10 μg/mL的IEGPS蛋白以1:1000稀释度作为捕获/诱捕抗体为最佳条件。为了覆盖残留空白区域，评估了不同的封闭缓冲液，其中磷酸盐缓冲盐水（Phosphate-Buffered Saline, PBS）中的5%脱脂乳溶液（PBS5%）被证明是最佳的封闭缓冲液。37 °C孵育1小时随后4 °C过夜储存的1:1000稀释IEGPS包被条件最佳。FMD O型病毒1:100稀释在IS-ELISA中表现最佳。同样，兔抗FMD O型病毒特异性免疫血清1:10,000稀释和辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase, HRP）标记的山羊抗兔IgG 1:4000稀释也被确定为试验标准化的最佳条件。最后，ELISA板被证明是试验中可用的最佳微孔板。在每个实验中，均记录了平台期、测试背景和板背景。最终成功建立了一种优化的、具有潜在成本效益的IS-ELISA，有待在该国研究和诊断实验室进行进一步的诊断验证。

该论文发表于《Immuno》期刊，针对口蹄疫（FMD）这一对全球畜牧业构成重大经济威胁的跨境动物疫病，聚焦于O型口蹄疫病毒（FMDV serotype O）的诊断难题，系统构建并优化了用于检测的间接夹心酶联免疫吸附试验（IS-ELISA）。

研究背景指出，FMD是由小核糖核酸病毒科（Picornaviridae）口蹄疫病毒属（Aphthovirus）引起的急性、高度接触性传染病，其中O型是全球流行最广、暴发最频繁的血清型。尽管病毒分离、病毒中和试验（VNT）及分子检测等传统方法是确诊依据，但其依赖专业实验室设施、操作繁琐且耗时较长，限制了在资源有限地区的大规模监测应用。现有的商业ELISA试剂盒往往价格昂贵且可能未针对地方性流行毒株进行优化，导致灵敏度不足或产生假阴性结果，影响疫情控制效率。因此，开发一种灵敏、特异、成本低廉且适合本地应用的诊断方法是迫切需要的。本研究旨在通过在受控实验室条件下优化IS-ELISA的关键参数，建立一种可靠的FMDV O型检测工具。

为实现上述目标，研究人员采用了以下关键技术方法：首先，通过接种油佐剂FMDV O型疫苗免疫豚鼠和家兔制备高免血清，并利用硫酸铵沉淀结合二乙氨基乙基（DEAE）纤维素离子交换层析技术纯化豚鼠免疫球蛋白（IEGPS）。其次，采用紫外吸收法（A280/A260）测定蛋白浓度。第三，利用病毒中和试验（VNT）在BHK-21细胞系上验证抗体的生物学活性。最后，也是核心环节，通过系统性的方阵滴定实验，对IS-ELISA的捕获抗体稀释度、封闭剂种类、包被条件、抗原浓度、检测抗体稀释度、酶标二抗（HRP-conjugate）浓度及微孔板类型进行了全面的优化与评估。

研究结果部分详细展示了各项优化的数据支撑：

在蛋白浓度测定方面，全豚鼠血清、ASPGPS及IEGPS的蛋白浓度分别为52 μg/mL、24 μg/mL和10 μg/mL，表明离子交换纯化显著去除了非特异性蛋白。

病毒中和试验结果显示，豚鼠全血清、兔全血清及IEGPS的中和抗体滴度分别为1:32、1:64和1:128，证实IEGPS保留了最高效的功能性抗体。

在捕获抗体浓度优化中，IEGPS在1:1000稀释时表现出最佳的信噪比，优于全血清和ASPGPS。

封闭剂比较实验表明，5%脱脂乳（Skimmed Milk）产生的背景信号最低，封闭效果优于胎牛血清（FCS）、牛血清白蛋白（BSA）和马血清等。

包被条件评估发现，37 °C孵育1小时后4 °C过夜的组合方式能获得最高的光密度（OD）值。

抗原浓度滴定显示，FMDV O型抗原在1:100稀释时信号最佳，且与新城疫病毒（NDV）对照无交叉反应。

检测抗体（兔免疫血清）稀释度实验确定1:10,000为最佳工作浓度。

微孔板类型比较中，Maxisorp免疫板因其高结合力表现出最高的阳性信号，优于标准聚苯乙烯板和U型细胞培养板。

酶标二抗（山羊抗兔IgG-HRP）浓度优化结果表明，1:4000稀释度在保证信号强度的同时有效降低了背景干扰。

讨论部分深入分析了上述结果的成因与意义。研究认为，尽管IEGPS总蛋白浓度最低，但通过离子交换层析富集了功能性抗原特异性免疫球蛋白，从而提升了检测效能。脱脂乳因其富含酪蛋白等两亲性蛋白，能有效占据微孔板表面的疏水位点，减少非特异性吸附。优化的包被条件结合了高温快速吸附与低温稳定构象的优势。研究强调，IS-ELISA的性能高度依赖于捕获抗体的亲和力纯度、封闭效果及试剂稀释度的平衡。

结论部分指出，本研究成功通过对捕获抗体、封闭剂、抗原与抗体稀释度、微孔板特性及结合物浓度等关键参数的系统性优化，显著提高了用于检测FMDV O型病毒的IS-ELISA的灵敏度与特异性。所建立的优化IS-ELISA具有潜在的诊断应用价值，特别是在资源有限的流行地区。然而，作者也客观指出了本研究的局限性，即缺乏大规模田间样本验证及与国际商业化试剂盒的直接比对，建议未来的研究应纳入受试者工作特征（ROC）曲线分析和Cohen's kappa一致性检验，以全面评估该方法的诊断准确率。