与肠道微生物群代谢物相关的肌肉减少性肥胖的共病生物标志物：从负担到治疗

《PLOS Computational Biology》：Co-morbid biomarkers for sarcopenic obesity associated with gut microbiota metabolites: From burden to treatment

　　**摘要**
**背景** 肌少症肥胖（SO）的恶性循环显著降低了老年人的生活质量，但其机制仍不明确。
**材料与方法** 我们首先使用CHARLS数据库分析了SO的发病率。通过整合差异表达基因、加权基因共表达网络分析以及肠道微生物群代谢物的靶标，识别出关键基因，并通过机器学习方法（LASSO、XGBoost、SVM-REF、Random Forest）进一步筛选。这些基因在高脂肪饮食（HFD）诱导的小鼠模型中通过单细胞测序、接收者操作特征分析（ROC曲线分析）和肌肉免疫组化进行了验证。进一步的分析包括免疫浸润谱分析、通路富集和转录调控分析。此外，我们还探讨了关键基因与自噬、铁死亡（ferroptosis）和免疫反应之间的关系。最后，我们利用CMap数据库和分子对接技术预测并评估了潜在的治疗化合物。
**结果** 中国SO的发病率从2011年的16.1%显著上升至2018年的20.4%。机器学习识别出ALDH1A3、CSF1R和PHGDH为关键基因。这些基因在外部肌肉单细胞数据集中得到了验证，其诊断性能优异，AUC值在四个独立的GEO队列中均超过0.72。在高脂肪饮食干预后，小鼠肌肉组织中的ALDH1A3和CSF1R表达显著上调，而PHGDH则表现出持续上升的趋势，但未达到统计显著性。免疫浸润分析显示，在肥胖和肌少症状态下静息状态下NK细胞数量显著增加。使用基因本体论（Gene Ontology）和京都基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）进行的功能富集分析将这些基因与转录调控通路相关联。Cisbp_M4923基序被确定为最重要的转录因子结合位点。分子对接模拟表明，顶级候选化合物Birinapant能够稳定结合到关键基因靶标上。
**结论** ALDH1A3、CSF1R和PHGDH可作为SO的潜在共病生物标志物。

**作者总结** 目前缺乏标准化协议，这阻碍了对肌少症-肥胖共病交互机制的阐明及治疗方法的开发。为此，我们开发了一个全面的多模态计算框架。我们的工作流程首先使用CHARLS数据库进行了为期8年的临床负担纵向评估。 subsequent的整合生物信息学分析结合差异表达分析、加权基因共表达网络分析和与预测的肠道微生物群代谢物靶标的交叉参考，确定了ALDH1A3、CSF1R和PHGDH为关键共病基因。这些关键基因在两个外部单细胞数据集、四个独立的GEO队列以及高脂肪饮食诱导的小鼠模型中的免疫组化分析中得到了严格验证。上游/下游通路和免疫浸润分析进一步明确了它们的功能网络。最后，利用CMap数据库和分子对接模拟，我们筛选并验证了Birinapant作为有前景的治疗候选物。这一综合框架为复杂共病的机制探索和治疗靶向提供了系统的方法。

**引言** 随着经济发展和生活方式的改变，肥胖的全球传播已成为最严重的公共卫生挑战之一。预计到2035年，严重肥胖的患病率将从10%增加到20%，表明全球肥胖患病率仍然处于不可接受的高水平[1]。肥胖是一种多因素、慢性、复发的非传染性疾病，其特征是体内脂肪异常或过度积累[2]。肥胖管理确实是未来公共卫生策略中必须强调的关键问题。除了肥胖的全球化外，当代活动量的减少也导致了肌少症发病率的逐步增加[3]。肌少症被定义为与年龄相关的肌肉质量、力量或身体性能的丧失[4]。据估计，全球老年人群中肌少症的患病率在10%到16%之间，具体取决于诊断标准和人群统计数据[5]。肌少症与许多不良健康结果显著相关，如总体生存率和无进展生存率降低、跌倒、骨折、代谢紊乱以及一般人群中的死亡率增加[6]。肥胖与肌少症之间的强相关性促使了“肌少症肥胖”（SO）这一概念的提出，该概念于2022年正式确立。2022年，欧洲临床营养与代谢学会（ESPEN）和欧洲肥胖研究协会（EASO）就SO的定义达成了专家共识[7]，即肥胖伴随低骨骼肌质量、力量和/或功能[8]。因此，本研究首次系统地使用2011至2018年中国健康与退休纵向研究（CHARLS）的纵向随访数据，分析了中国人群中SO发病率的变化趋势，初步揭示了SO对流行病学管理的重要意义。然而，由于SO的发病机制尚未完全阐明，目前缺乏有效的特异性药物干预[9]。肠道微生物群通过调节网络（如肠道-大脑[10]、肠道-肝脏[11]和肠道-肌肉轴[12]）介导器官间的相互作用，正在重塑共病的治疗范式。因此，阐明肠道微生物群影响共病的机制为开发协同治疗策略提供了有希望的途径。为此，本研究整合了四种机器学习方法（LASSO、XGBoost、SVM-RFE和Random Forest）与肠道微生物群代谢物靶标信息，对Gene Expression Omnibus（GEO）数据库中的转录组数据进行了初步筛选，从而识别出与肥胖和肌少症共病相关的关键基因。随后，我们使用两个独立的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集和三个独立的GEO转录组数据集验证了关键基因的细胞表达模式和诊断效用。此外，我们利用高脂肪饮食（HFD）诱导的小鼠模型通过免疫组化（IHC）确认了关键基因在组织水平上的空间分布。在确定关键基因后，本研究通过综合方法系统分析了这些基因的上游和下游通路。这种方法结合了免疫细胞浸润分析、基于GeneMANIA的功能关联（GMFA）、基因本体论（GO）和京都基因组百科全书（KEGG）富集分析、调节网络构建以及miRNA分析。此外，研究还探讨了关键基因与免疫、自噬和铁死亡过程之间的关联，这些过程受到研究者的特别关注。最后，我们利用CMap数据库和分子对接模拟预测了针对这些关键基因的潜在治疗化合物。总之，这一综合框架为复杂共病的机制探索和治疗靶向建立了系统的方法学。**GO和KEGG分析**
我们使用了数据库“DAVID”（用于注释、可视化和集成发现 [20]）的“功能注释”功能，对ALDH1A3/CSF1R/PHGDH相关的DEGs及其他基因进行了GO和KEGG富集分析，这是在GMFA网络分析之后进行的。

**调控网络分析**
在本研究中，我们使用了R包“RcisTarget (1.25.0)” [21] 来预测转录因子。一个基序的标准化富集评分（NES）是通过数据库中该基序的总数来确定的。除了在源数据中识别的基序外，我们还基于基序相似性和基因序列分析推导出了额外的注释。为了确定每个基序的过表达情况，首先根据基因集与基序排序的恢复曲线计算出了每对基序-基因的AUC值。然后使用所有基序的AUC值来计算每个基序的NES。我们使用的基因-基序排名数据库是rcitarget.hg19.motifdb.cisbpont.500 bp。

**miRNA分析**
微小RNA（miRNAs）是调控基因表达的重要因素。为了研究特定miRNAs是否参与了枢纽基因的转录或降解过程，我们进行了miRNA分析。具体来说，我们使用miRcode数据库 [22] 识别了与枢纽基因相关的miRNAs，并利用Cytoscape（3.9.1）软件可视化了miRNA网络。

**ALDH1A3/CSF1R/PHGDH与关键调控机制的关系**
与免疫、自噬和铁死亡相关的基因是从GeneCards数据库（https://www.genecards.org/）中获取的。对于每个类别的前20个基因，我们提取了它们的表达水平，并分析了它们在肥胖和肌少症队列中与ALDH1A3、CSF1R和PHGDH表达的相关性。这些相关性以气泡图的形式展示出来。

**潜在治疗药物的预测**
CMap（https://clue.io/）数据库是一个有前景的药物筛选工具，它可以根据DEGs预测分子靶向药物 [23]。在本研究中，我们利用基因表达谱分析和CMap数据库预测了治疗肥胖和肌少症的潜在化学药物。

**分子对接验证**
我们使用本研究中提到的第一个核心化合物作为配体，ALDH1A3/CSF1R/PHGDH基因产物作为受体进行了分子对接验证。最初，从PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ [24]）获取了配体的3D结构，并从RCSB蛋白质数据库（https://www.rcsb.org/ [25]）获取了相应目标的3D结构。然后使用Chimera（1.16）对分子结构进行了优化，通过Autodock Vina（v1.2.3）设置了对接参数，并使用AutoDock KV1.2.3执行了对接，最终结果用Chimera 1.16进行了可视化 [26]。

**结果**
技术路线图如图1所示。下载：PNG（更大图像）| TIFF（原始图像）
**图1. 流程图。** https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1014225.g001

**SO的临床负担**
2011年，单纯肥胖的患病率为40.30%（所有肥胖患者中：3,237人），而单纯肌少症和SO的患病率分别为15.60%（所有肌少症患者中：1,820人）和16.10%（n = 924人）。到2015年，单纯肥胖的患病率上升至47.00%（所有肥胖患者中：4,126人）。相比之下，单纯肌少症的患病率为12.60%（所有肌少症患者中：1,933人），SO的患病率为17.70%（n = 1,128人）。2018年，单纯肥胖的患病率为41.20%（所有肥胖患者中：4,966人），单纯肌少症的患病率为16.00%（所有肌少症患者中：2,931人），SO的患病率为20.40%（n = 1,645人）。在整个研究期间，肌少症和SO的患病率均呈上升趋势，而肥胖的患病率始终较高（图2）。SO发病率的持续增加凸显了对医疗系统的长期经济负担。下载：PNG（更大图像）| TIFF（原始图像）
**图2. 中国2011-2018年肥胖、肌少症和SO的全国患病率、地区分布及比例。** https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1014225.g002

**筛选交集DEGs**
我们从NCBI GEO数据库下载了与肥胖相关的数据集GSE94752和肌少症相关的数据集GSE1428的系列矩阵文件。筛选标准为P值<0.05且|logFC|>0.585。在肥胖数据集中，识别出1019个DEGs，包括767个上调基因和252个下调基因（图3A）。在肌少症数据集中，识别出640个DEGs，包括353个上调基因和287个下调基因（图3B）。我们使用Venn图软件将两种疾病的上调和下调DEGs进行了交集分析，得到了45个交集DEGs（图3G）。这45个DEGs在所有样本中的表达水平以热图形式呈现（S1A-B图）。对这些45个DEGs的功能富集分析显示，它们与特定的GO和KEGG通路有显著关联，包括质膜通路和Rap1信号通路（图3C-D）。

**共表达网络构建和枢纽模块识别**
我们进行了WGCNA分析，以识别与肥胖和肌少症相关的共表达模块。对于肥胖数据集GSE94752，选择了4的软阈值（S1C图）。然后使用TOM方法识别了12个基因模块，分别是浅蓝色（2129个）、深橙色（284个）、深绿色（2953个）、橙色（11872个）、绿色（873个）、午夜蓝（237个）、棕色（1309个）、深橄榄绿（33个）、紫色（37个）、品红色（472个）、天蓝色（88个）和灰色（1个）。其中，橙色模块与肥胖的相关性最强（相关性=-0.8，p=1e-11）（图3E）。随后对肌少症数据集GSE1428进行了类似的WGCNA分析，软阈值为2（S1E图）。该分析得到了5个模块，分别是蓝色（13144个）、品红色（139个）、紫色（129个）和黑色（79个）。品红色模块与肌少症的相关性最强（相关性=-0.83，p=2e-6）（图3F）。最后，将橙色模块中的11872个基因与品红色模块中的139个基因进行了交集分析，得到了65个重叠基因（图3H）。

**候选基因的识别**
为了研究肠道微生物群在共病状态中的作用，我们从gutMGene v2.0数据库中检索了所有代谢物，并使用SEA数据库预测了这些代谢物的1289个潜在靶点。将这些1289个预测靶点与WGCNA得到的45个DEGs和65个模块基因进行交集分析，得到了12个重叠基因（图4A）。这12个基因被认为是候选基因，它们符合转录组共病交集的标准，具有模块化特性，并可能受到肠道微生物群代谢物的调控。

**机器学习识别的关键基因**
我们使用了四种机器学习方法（LASSO、SVM-RFE、XGBoost和随机森林）来识别候选基因集中的关键基因。四种方法都识别出了三个共识关键基因：ALDH1A3、CSF1R和PHGDH（图4B-F）。具体来说，LASSO回归选择了六个候选基因：ALDH1A3、CSF1R、CPA1、PHGDH、RXRB和CFTR；SVM-RFE选择了11个特征：PHGDH、CPA1、TPI1、PTGFR、PLAT、TPO、CFTR、PTGS1、ALDH1A3和CSF1R；XGBoost则将六个基因的重要性排在首位：TPI1、ALDH1A3、CSF1R、PHGDH和PTGS1。

**外部单细胞数据集验证**
为了评估这三个关键基因在肥胖和肌少症诊断中的潜力，我们在两个单细胞数据集和四个转录组数据集中验证了它们的性能。GSE163830数据集中的细胞被分为五种不同的细胞类型：B细胞、成纤维细胞、单核/巨噬细胞、NK/T细胞和平滑肌细胞（图5A）。同样，GSE172410数据集中的细胞被分为四种主要类型：内皮细胞、成纤维细胞、中性粒细胞和基质细胞（图5D）。这两种数据集中ALDH1A3、CSF1R和PHGDH的表达模式分别在图5B和5E中以气泡图形式展示（图5C和5F显示了量化结果）。在GSE163830数据集中，PHGDH在所有五种细胞类型中都表达；而在CSF1R和ALDH1A3仅在中性粒细胞中表达。在GSE172410数据集中，CSF1R在中性粒细胞中显著表达。

**外部转录组数据集验证**
这三个基因在四个外部数据集中的诊断性能均很强（图5G）。在肌少症数据集GSE136344中，ALDH1A3、CSF1R和PHGDH的AUC分别为0.856、0.871和0.720；在肥胖数据集GSE69039中分别为0.750、0.759和0.768；在另一个肥胖数据集GSE44000中分别为0.755、0.959和0.939；在肌少症数据集GSE8479中分别为0.822、0.806和0.792。GSE94752和GSE1428数据集的AUC结果分别显示在S2A和S2B图中。

**组织学验证**
为了验证生物信息学分析预测的表达差异，我们建立了HFD诱导的小鼠模型进行体内验证。与对照组相比，HFD诱导的小鼠体重显著增加（29.14±3.50 vs 40.01±2.42，p<0.001），肌肉质量显著减少（68.51±3.15 vs 48.75±2.78，p<0.001）（S2D和S2E图）。行为学研究表明，该模型同时表现出肥胖和肌肉功能下降的共病表型。代表性免疫组化结果显示，实验组中ALDH1A3（5.02±0.53 vs 8.04±1.00，p<0.001）和CSF1R（2.81±0.76 vs 10.64±5.52，p=0.014）的染色强度显著高于对照组。相比之下，PHGDH的染色强度在两组之间没有显著差异（2.22±1.06 vs 3.06±1.44，p=0.323，图5H-J）。通过整合外部单细胞数据集和转录组数据集以及小鼠模型中的免疫组化验证，我们在细胞、转录和蛋白质水平上确认了这三个关键基因的表达差异。

**免疫细胞浸润**
鉴于单细胞数据集中存在免疫细胞以及CSF1R作为巨噬细胞表面标记物的作用，我们进行了免疫细胞浸润分析以评估它们对共病表型的贡献。对照组和疾病样本中的免疫细胞浸润比例分别显示在图6A和6B中。这些发现表明，在肥胖和肌少症的发展过程中，免疫细胞谱型发生了显著改变，而CSF1R和PHGDH可能在这一过程中发挥调节作用。为了探索关键基因之间的功能关联并预测它们潜在的协同机制，我们进行了GMFA网络分析。该分析识别出另外20个与三个关键基因（包括CSF1和GRAP2）相关的基因（图7B）。然后使用GO和KEGG数据库对这些基因网络进行了功能富集分析（图7A）。值得注意的是，显著的BP术语包括小胶质细胞增殖；关键的CC术语包括转录抑制复合物；关键的MF术语包括NAD结合；关键的KEGG术语包括慢性髓系白血病。下载：PNG（较大图像）| TIFF（原始图像）图7. 功能和通路富集分析。(A) 通过GMFA对ALDH1A3、CSF1R和PHGDH基因组的GO和KEGG富集分析。(B) ALDH1A3、CSF1R和PHGDH的功能相关基因。(C) 与ALDH1A3、CSF1R和PHGDH相关的miRNA网络，其中蓝色表示mRNA，紫色表示miRNA。(D) 基于AUC显示最高富集的motif，结合NES、AUC和TF_highConf。(E) 展示了三个AUC值最高的motif。红线代表每个motif的平均恢复曲线，绿线代表平均值加上标准差，蓝线代表当前motif的恢复曲线。最大富集水平选在当前motif与绿线之间的距离（平均值+标准差）最大处。(F-H) ALDH1A3、CSF1R和PHGDH与免疫、铁死亡和自噬因子的相关性。https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1014225.g007

关于关键的转录CC术语，我们随后研究了关键基因与转录因子之间的关系。累积恢复曲线（图7E）、motif-TF注释以及显著基因的选择分析结果对这些转录因子进行了富集分析。在图7C中展示了中心基因富集的motif，包括cisbp__M2231、cisbp__M4923和cisbp__M1997。结果显示，NES值最高的motif是cisbp__M4923（图7D）。

接下来，我们评估了这三个关键基因与肥胖和肌少症背景下涉及免疫、自噬和铁死亡途径的前20个基因之间的表达相关性（图7F–7H）。结果表明，这三个关键基因与这三个途径中的基因都有很强的相关性，这表明它们在这些过程中可能具有潜在的调节作用。

在对SO的疾病负担和共病机制进行分析后，我们预测了潜在的治疗药物，为新型药物的开发提供了理论基础。我们从CMap下载了药物数据，并根据图4A中的12个潜在关键基因预测了潜在的治疗药物。在候选药物中，Birinapant得分最高，被认为是缓解共病状况最有希望的候选药物（图8D）。Birinapant与ALDH1A3、CSF1R和PHGDH的分子对接结果展示在图8A-8C中。Birinapant与这三个关键基因均具有稳定的结合。潜在药物的作用机制展示在图8E中。下载：PNG（较大图像）| TIFF（原始图像）图8. 对肥胖和肌少症潜在治疗药物的预测。(A-C) Birinapant与目标蛋白ALDH1A3、CSF1R和PHGDH的分子对接。(D) 连通性图数据库预测的潜在治疗药物得分的热图。(E) 潜在治疗药物的作用机制示意图。https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1014225.g008

讨论：肥胖与肌少症密切相关，后者的特点是脂肪组织和骨骼肌功能之间的相互作用[27]，其中脂质及其衍生物在细胞内和细胞间沉积，导致能量吸收受损，而肌肉分泌的细胞因子会加剧慢性炎症和高脂血症的发展[28]。这种恶性循环促进了SO的发展，导致比单独患有该疾病更差的预后。研究表明，同时患有肌少症和SO的女性比只患有其中一种状况的女性死亡风险更高[29]。随着人口老龄化和生活方式的改变，肌少症的患病率和全球公共卫生负担将进一步增加。因此，研究肥胖和肌少症之间的共病机制对于早期识别和干预SO具有临床重要性。对CHARLS数据库（2011–2018年）的分析（包含约20,000名个体）显示，中国的SO发病率呈上升趋势。这一趋势表明SO已经影响了大量人口，并且将继续成为一个具有重大公共卫生影响的状况。在这种研究背景下，我们整合了关于肥胖和肌少症的数据集，应用了差异基因表达分析、WGCNA和肠道微生物群代谢物靶点。四种不同的机器学习算法得出了三个关键基因：ALDH1A3、CSF1R和PHGDH。通过严格评估这些基因在两个单细胞数据集中的表达模式，并通过四个独立GEO数据集中的ROC曲线分析评估其诊断价值，验证了这些基因的代表性。此外，在HFD诱导的SO小鼠模型中，通过肌肉组织的IHC可视化了这些关键基因的表达。通过这种多方面的方法确定的基因显示了强大的代表性和稳定性。值得注意的是，这三个基因似乎通过不同但相互关联的途径参与SO的发病机制。它们的具体病理机制将在后续章节中详细讨论。ALDH1A3被确定为关键基因，位于DEGs、关键WGCNA模块和肠道微生物群代谢物靶点的交集。生理上，ALDH1A3属于醛脱氢酶家族，催化全反式视黄醛氧化为视黄酸，从而调节细胞内的视黄酸信号传导[30]。在肥胖背景下，胰腺ALDH1A3表达增加是β细胞去分化的标志[31]，这是一个关键的病理特征和潜在的治疗靶点。然而，在肌少症中，ALDH1A3的作用尚不明确。尽管如此，研究表明它通过视黄酸的形成调节肌肉卫星细胞的成肌分化[32]，这一机制可能影响肌少症的病理。总体而言，鉴于ALDH1A3在肥胖相关代谢功能障碍和肌少症相关肌肉再生障碍中的作用，它被提名为一个有前景的治疗靶点。

虽然PHGDH属于与ALDH1A3相同的酶家族，但它不是关键WGCNA模块的成员。PHGDH是丝氨酸合成途径中的第一个且限速的酶[33]。该反应启动了丝氨酸合成途径，并同时产生NADH。在肥胖模型中，抑制PHGDH似乎有益；髓系PHGDH缺乏可以逆转饮食诱导的肥胖[34]，而脂肪细胞特异性的PHGDH敲除可以改善葡萄糖不耐受[35]。相反，在肌少症背景下，PHGDH过表达促进肌细胞增殖[36]。因此，鉴于这些相反的组织特异性效应，PHGDH对SO发病机制的精确贡献仍有待阐明。因此，我们假设一种双重组织靶向策略可能在治疗SO方面有效：在脂肪细胞中抑制PHGDH，同时在肌肉中促进其活性。值得注意的是，PHGDH缺乏的抗肥胖效应部分通过调节巨噬细胞中的线粒体生物生成来介导。这种以巨噬细胞为中心的机制为CSF1R提供了逻辑联系，CSF1R也在线粒体生物学中起着关键作用。在识别的关键基因中，CSF1R是唯一一个与肠道微生物群代谢物靶点无关的。作为配体CSF1和IL-34的受体，CSF1R是巨噬细胞存活、增殖、分化和功能的主要调节因子[37]。在肥胖中，抑制CSF1R已被证明可以预防饮食诱导的肥胖和胰岛素抵抗，从而改善代谢参数[38,39]。在肌少症中，CSF1R被认为是SO的关键调节因子[40]，尽管其作为治疗靶点的潜力尚未探索。目前，这些关键基因与SO之间的关联主要基于其已知的生物学功能和间接证据。因此，阐明它们的精确病理生理作用和潜在的分子机制是未来研究的关键方向。如引言中所述，肠道微生物群通过微生态调节可能比单一药物治疗更有效地管理复杂的病理状况，如共病。因此，我们将肠道微生物群代谢物靶点纳入了潜在关键基因的选择中。ALDH1A3和PHGDH都是肠道微生物群代谢物的靶点，这促使我们调查它们与微生物群的特定相互作用。Cui等人证明，来自Peptostreptococcus anaerobius的色氨酸代谢产物trans-3-吲哚丙酸能够转录上调ALDH1A3的表达。使用视黄醛作为底物，ALDH1A3产生NADH，从而抑制铁死亡并促进结直肠癌[41]。由于肥胖引起的脂质过氧化会加剧铁死亡[42]，铁死亡相关因子的失调会进一步触发M2巨噬细胞和Treg细胞中的铁死亡，从而破坏局部免疫微环境[43]。铁死亡通过驱动肌肉组织内的铁过载和活性ROS积累促进肌少症，从而促进氧化损伤并损害再生能力[44]。鉴于铁死亡在肥胖和肌少症中的关键病理作用，上调ALDH1A3可能通过抑制铁死亡来缓解肌少症[45]，并通过增强肌肉功能来缓解肥胖。然而，其他证据表明，脂肪细胞中的铁死亡减少可以减轻肥胖。鉴于这一明显的矛盾，我们进一步调查了这三个关键基因与我们在功能分析中确定的20个铁死亡相关基因之间的关系。同样，PHGDH介导的丝氨酸途径是肠道微生物群代谢的关键组成部分，也参与肝脏脂质代谢[46]。然而，它与肌少症的直接联系仍不明确。尽管CSF1R不是肠道微生物群代谢物的直接靶点，但肠道微生物群与巨噬细胞之间的相互作用对肠道稳态至关重要，是当前的研究焦点。因此，肠道微生物群对免疫微环境的调节代表了缓解共病的潜在治疗途径。正如前面的讨论所说明的，这三个关键基因之间存在复杂的功能联系。为了进一步研究它们的功能，我们进行了一系列下游分析，包括GMFA、GO和KEGG通路富集以及转录分析。GO和KEGG分析显示，与丝氨酸相关的通路（如甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢以及L-丝氨酸生物合成过程）显著富集。这一发现与我们之前的讨论一致，主要受PHGDH驱动。与NAD结合和转录抑制复合物相关的通路也显著富集。此外，转录分析确定cisbp_M4923是最相关的转录因子。鉴于ALDH1A3与铁死亡的已知关联，我们研究了这三个关键基因与三个关键通路（包括自噬、铁死亡和免疫）之间的关系，以阐明它们在SO中的潜在机制。结果表明，ALDH1A3在肥胖和肌少症中的表达趋势大体一致，而CSF1R在这两种状况下的趋势则更为对立。相比之下，PHGDH与所有三个关键通路中的基因的相关性较低。在两种状况下，ALDH1A3主要与免疫相关基因呈正相关，这一发现可能解释了ALDH1A3调节的视黄酸在成人免疫功能中的重要作用[47]。然而，ALDH1A3与铁死亡相关基因之间的相关趋势并不一致，这突显了进一步验证潜在分子机制的必要性。总体而言，这三个关键基因的表达水平与自噬、铁死亡和免疫通路中的因素表现出不同的相关性，表明这些过程在SO中存在复杂的相互作用。肥胖个体的代谢紊乱和器官组织并发症与脂肪组织内的慢性炎症有关[48]。这种炎症反应也在骨骼肌中观察到，主要表现为免疫细胞浸润增加和间质细胞及肌周脂肪组织的促炎激活，这可能加剧肌少症[49,50]。因此，研究与肥胖和肌少症相关的免疫微环境至关重要。此外，CSF1R和PHGDH都参与了免疫调节通路，这三个关键基因都与免疫相关基因集显著相关。这些观察结果促使我们进行了免疫浸润分析。分析显示，静息NK细胞是肥胖和肌少症中唯一升高的免疫亚群。此外，CSF1R的表达与肥胖中的静息NK细胞浸润呈正相关。先前的研究表明，选择性消除CSF1R阳性的NK细胞群体可以减轻肥胖和胰岛素抵抗[39]。此外，多项生物信息学研究 [51,52] 报告了静息状态下的NK细胞与肥胖之间的关联。肥胖个体中静息NK细胞的积累可能反映了活化过程的失调。由于有氧糖酵解是NK细胞活化的重要代谢特征 [53]，而脂肪细胞对糖酵解的依赖性较高，可能会竞争性地剥夺NK细胞所需的必需底物 [54]，从而抑制NK细胞的活化。然而，这种代谢竞争机制仍需进一步的实验验证。最近的另一项研究也发现，静息状态的NK细胞与肌少症 [55] 有密切关联；同时，运动后NK细胞活性的增加表明这可能是改善肌少症的一种潜在治疗途径 [56–58]。IL-15 在骨骼肌中高度表达，它具有抑制脂肪沉积和促进骨骼肌合成代谢的作用。IL-15 对NK细胞的发育、维持和存活也是必不可少的 [59]。在肥胖和肌少症的恶性循环中，IL-15 水平降低，可能成为NK细胞免疫老化的潜在诱因。作为先天免疫系统的关键组成部分，NK细胞如何参与这两种疾病的发病机制仍需进一步深入的实验研究。先前的研究表明，患有这两种疾病的患者预后较差。然而，利用生物信息学方法探索肥胖和肌少症之间的发病机制和共同病因因素的研究还不够充分，这突显了研究这两种疾病共病机制在改善患者预后方面的临床重要性。在本研究中，我们确定了肥胖和肌少症中的关键基因，并分析了潜在的调控因子和治疗剂，从而更深入地理解了这两种疾病共存的分子机制。然而，我们的研究也存在一些局限性：首先，我们仅识别出了3个关键基因；其他表现出关联性的基因及其可能调控的替代或补偿途径，是未来研究的有希望的目标。其次，这些关键基因、miRNA 和转录因子如何影响这些疾病的详细分子机制尚未明确。最后，这些关键基因的功能以及潜在治疗剂在体内的有效性需要通过进一步的实验和临床研究来验证。

CHARLS数据库的分析证实了肌少症发病率的上升，强调了其重大的公共卫生意义。我们采用了一种综合的多阶段筛选策略，包括差异表达基因（DEGs）分析、全基因组拷贝数变异（WGCNA）分析以及与预测的肠道微生物群代谢物的交叉分析，以筛选出12个初步候选基因。这些候选基因通过四种独立的机器学习方法（LASSO、XGBoost、SVM-RFE 和随机森林）进行了进一步筛选，最终确定ALDH1A3、CSF1R 和 PHGDH 是与肥胖和肌少症相关的高信心关键基因。通过两个独立的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集和四个独立基因表达组（GEO）队列的ROC曲线分析，验证了这些关键基因的稳定性和诊断潜力。最重要的是，本研究通过在高脂饮食（HFD）诱导的肌少症小鼠模型中对腓肠肌组织进行免疫组化（IHC）检测，直接证明了这些基因的表达和空间分布。进一步的研究表明，这些关键基因与两种疾病中的多种免疫细胞浸润显著相关，揭示了它们在塑造免疫微环境中的作用。通过基因功能富集（GMFA）以及GO（Gene Ontology）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Gene Functions）通路分析，将ALDH1A3、CSF1R 和 PHGDH 与多个重要通路联系起来，其中Cisbp__M4923基序是最相关的转录因子结合模式。此外，这些基因还参与了自噬、铁死亡（ferroptosis）和免疫应答过程。最后，利用CMap数据库，我们发现了潜在的治疗化合物；其中最有前景的候选化合物Birinapant 经过分子对接实验，证实了其与这些关键基因的稳定结合能力。总之，本研究建立了一个全面的计算生物学研究框架，涵盖了临床负担评估、关键基因识别、外部数据集和实验验证、上下游通路富集分析以及潜在药物发现。这项工作深化了对肌少症-肥胖共病机制的理解，并为开发新的治疗策略奠定了基础。

致谢：我们感谢Gene Expression Omnibus项目提供的数据支持。

参考文献：