综述：生肉中大肠杆菌O157的检测挑战：VIDAS、qPCR和基于培养的方法在诊断结果上的差异

《Diagnostic Microbiology and Infectious Disease》：Detection Challenges of Escherichia coli O157 in Raw Meat: Diagnostic Discordance Between VIDAS, qPCR, and Culture-Based Methods

阿登·索伊坎（Adem SOYCAN）与穆斯塔法·比尔金（Mustafa B?LG?N）
土耳其科贾埃利（Kocaeli）食品控制实验室微生物学部门

**摘要**
本研究评估了土耳其科贾埃利市场上销售的生肉和混合绞肉制品中大肠杆菌O157的存在情况，以及免疫学方法、分子方法和基于培养的方法之间的诊断一致性。2025年1月至8月期间，共收集了150份样本，包括碎牛肉、烤肉串（一种传统的土耳其扁面包，上面覆盖着调味绞肉）、肉丸混合物和生禽肉。首先在添加新诺比辛（novobiocin）的改良色氨酸大豆肉汤中（mTSB+n）于37°C下选择性富集18–24小时，然后使用VIDAS? UP E. coli O157免疫测定法、针对rfbE、stx1、stx2和eae基因的实时PCR（qPCR）以及免疫磁分离辅助培养技术对这些样本进行了分析。通过qPCR在12份样本中检测到与O157相关的遗传标记（8.0%），而VIDAS检测出7份阳性样本（4.7%），经过IMS辅助培养后有5份样本得到确认（3.3%）。所有VIDAS阳性的样本也都显示qPCR阳性；然而，有一些qPCR阳性的样本未被VIDAS检测到或通过培养无法确认，这表明检测结果存在方法依赖性差异。重要的是，qPCR显示的O157谱型特征是在没有可检测到的stx基因的情况下存在eae基因；然而，这些谱型无法通过培养得到再现。这些发现表明，在筛查、分子方法和基于培养的方法之间存在检测结果的差异，并强调了仅依赖基于stx的分子检测在食品安全监测中的局限性。本研究不是关注流行率调查，而是评估了在复杂加工肉制品中的诊断性能，突出了需要综合多层次策略来准确解释大肠杆菌O157的存在情况。

**引言**
大肠杆菌是一种革兰氏阴性、兼性厌氧细菌，属于肠杆菌科（Enterobacteriaceae）。虽然大多数大肠杆菌菌株是人类和动物肠道微生物群中的无害共生菌，但某些致病型会导致严重的食源性疾病。其中，大肠杆菌O157，特别是O157:H7，与严重的胃肠疾病（包括出血性结肠炎和溶血性尿毒综合征HUS）有很强的关联，因此被全球公认为高优先级的食源性病原体[[1], [2], [3]]。尽管历史上大肠杆菌O157被认为是与严重食源性疾病最相关的血清群，但越来越多的关注集中在所谓的“六大”非O157 STEC血清群（O26、O45、O103、O111、O121和O145）上，这些血清群现在也被认为是全球食源性疾病的重要来源[[1], [2], [3]]。尽管如此，O157仍然是一个重要的模式生物，用于评估食品微生物学中的诊断性能和监测挑战[[4]]。
大肠杆菌O157的致病性主要与一组有限的毒力决定因子有关。由stx1和stx2基因编码的志贺毒素被认为是导致严重临床结果的最关键因素，因为它们会引发血管内皮损伤[[5]]。此外，eae基因编码的黏附蛋白intimin有助于附着于肠上皮细胞并促进定植。这些毒力相关基因的存在和组合通常用于评估O157菌株的致病潜力[[6]]。
传统上，针对大肠杆菌O157的监测策略主要集中在检测stx基因上，因为它们与严重疾病有很强的关联[[7]]。然而，越来越多的证据表明，在各种生态环境中可能存在表现出非典型毒力谱型的O157菌株，例如在缺乏可检测到的stx基因的情况下存在eae基因。除了stx和eae之外，还描述了其他几种与毒力相关的决定因子，如肠溶血素（ehxA）和STEC自身凝集素（saa），这些因子可能独立于经典毒素谱型促进定植、持续性和致病潜力[[8]]。这些谱型通常在分子水平上被识别，可能反映了生物学变异或方法学限制，而不是明确的遗传事件[[9,10]]。这些谱型使常规检测和解释变得复杂，因为它们可能逃避基于stx的筛查，同时保留定植相关特征。这类非典型O157谱型在食品基质中的流行病学相关性和检测可靠性尚未完全了解[[9,10]]。
食品安全监测中的一个主要挑战是由于免疫学方法、分子方法和基于培养的检测方法之间的不等效性而导致的大肠杆菌O157存在情况的不一致性解释[[9,10]]。因此，用于食品中O157检测的各种分析方法包括基于培养的分离、免疫学筛查测定和分子技术[[9,10]]。传统的培养方法被视为确认性方法，但劳动强度大，尤其是在复杂的食品基质中，回收率往往较低[[9,10]]。为了克服这些限制，已经广泛采用了如VIDAS?系统这样的快速免疫测定法进行初步筛查[[11,12]]。然而，关于免疫测定法的特异性和敏感性的担忧仍然存在，可能会导致假阳性或假阴性结果[[11,12]]。
分子方法，特别是实时PCR（qPCR），通过直接针对特定的遗传标记提供高分析灵敏度[[13]]。尽管有这一优势，qPCR无法区分来自活性细胞的DNA和来自死亡或受损细菌的DNA，这可能导致污染水平的过高估计[[13]]。比较研究表明，免疫筛查、分子检测和培养确认之间存在显著不一致性，强调方法依赖性差异可能显著影响监测结果和风险评估[[14]]。然而，这些方法学差异对生肉和调味肉制品中非典型大肠杆菌O157谱型的检测和解释的影响程度尚未得到充分研究[[14]]。
先前的研究一致表明，在从食品基质中检测大肠杆菌O157时，免疫学筛查测定、分子检测方法和基于培养的确认方法之间存在显著差异[[15], [16], [17]]。例如，在巴西对米纳斯弗雷斯卡尔奶酪（Minas Frescal cheese）的研究中，使用VIDAS系统报告了高阳性率，而通过培养成功回收O157的比例却很低[[15]]。在涉及新鲜农产品和肉制品的研究中也记录了类似的VIDAS筛查和基于PCR的确认之间的不一致性[[16]]。总体而言，这些发现表明，单一分析方法得出的结果可能解释价值有限，需要综合的多方法方法进行可靠的监测和风险评估[[16]]。
除了方法学差异外，人们越来越关注O157菌株中的非典型毒力谱型[[17]]。多项实验研究表明，在特定实验或环境条件下，O157菌株可能在没有可检测到的stx基因的情况下表现出可检测的定植相关标记（如eae）[[17]]。基于实验室的研究表明，缺乏可检测到的stx1和stx2序列的等基因型O157衍生物仍可以保持与定植相关的表型，表明可检测毒素基因信号的损失并不一定伴随着定植相关特征的丧失[[17]]。这一观察部分可以用切割stx基因的噬菌体的作用来解释，导致毒素基因的丢失，同时保留其他毒力相关特征[[17]]。同时，临床报告描述了从腹泻病例中分离出的eae阳性但stx阴性的O157菌株，进一步强调了这类谱型的流行病学相关性[[9],[18],[19],[20]]。
重要的是，这些观察突显了潜在的诊断和监测差距[[18],[19]]。当前的ISO检测策略主要将stx基因作为识别O157的关键分子靶点[[18]]。虽然这种方法对于识别与严重疾病相关的菌株是合理的，但它可能忽视了那些缺乏可检测到的stx基因但保留其他毒力相关特征的O157谱型[[18]]。此外，方法学因素（如富集条件、低细菌载量、背景微生物群以及qPCR无法区分活性细胞和非活性细胞）进一步复杂化了阴性stx结果的解释[[21],[22]]。因此，当存在其他O157相关标记时，应谨慎解释stx扩增的缺失[[21],[22]]。
尽管有许多研究调查了食品中大肠杆菌O157的存在情况，但对复杂调味肉制品中诊断方法性能的比较评估仍然有限[[18]]。含有混合动物种类、香料、脂肪和多变微生物背景的加工肉制品可能会显著影响富集效率、分子扩增和培养回收率[[18]]。因此，方法学一致性而非流行率估计是食品安全监测中一个关键但尚未充分探索的方面[[18]]。
在此背景下，本研究调查了土耳其科贾埃利市场上销售的生肉和混合绞肉制品中大肠杆菌O157及其选定的毒力相关基因（stx1、stx2和eae）的存在情况。在常规实验室条件下，比较评估了自动化免疫筛查测定（VIDAS?）、实时PCR和IMS辅助的基于培养的确认方法的性能和诊断一致性[[18]]。本研究不仅提供了一个简单的流行率调查，还特别讨论了方法依赖性差异如何影响复杂和调味肉制品中O157存在的解释，从而为食品安全监测提供了更现实的框架[[18]]。

**部分摘录**
**样本收集**
本研究分析了代表五种产品组的150份生食品样本，分别是碎牛肉、烤肉串型混合绞肉制品、拉赫马昆型混合绞肉制品、肉丸型混合绞肉制品和生鸡肉[[18]]。样本于2025年1月至8月在土耳其科贾埃利省收集[[18]]。每个产品组从不同的零售来源（包括肉铺、超市和当地露天市场）随机抽取了30份样本[[18]]。

**统计分析**
使用威尔逊分数（Wilson score method）计算95%置信区间，总结了VIDAS、qPCR和基于培养的方法得到的检测结果[[18]]。使用卡方检验（chi-square test）评估了产品组之间的阳性率差异[[18]]。使用精确的麦克尼马尔检验（exact McNemar test）评估了VIDAS和qPCR检测结果之间的一致性[[18]]。当p<0.05时认为统计显著[[18]]。统计分析使用IBM软件进行[[18]]。

**结果**
本研究共分析了150份生肉和生禽肉样本[[18]]。通过针对富集水平上的rbfE基因的O157特异性实时PCR，150份样本中有12份（8.0%；95% CI：4.6–13.5）被鉴定为O157阳性[[18]]。相比之下，VIDAS? UP E. coli O157免疫测定法在7份样本中检测出阳性结果（4.7%；95% CI：2.3–9.3），而经过IMS辅助培养后有5份样本得到确认（3.3%；95% CI：1.4–7.6）（表3）[[18]]。

**讨论**
本研究的结果证实了免疫学筛查测定（VIDAS）、分子方法（qPCR）和基于培养的确认方法之间存在众所周知的差异[[18]]，同时提供了来自土耳其的区域性数据，而在该地区类似的研究仍然有限[[16,26,27]]。Temelli等人[[28]]报告称，在红肉中VIDAS UP E. coli O157的阳性率达到28.30%，通过PCR增加到56.60%，但随后又降低到[[28]]。

**结论**
本研究不仅提供了一个简单的流行率调查，还对常规食品监测条件下应用的免疫学方法、分子方法和基于培养的检测方法之间的诊断一致性进行了比较评估[[18]]。观察到基于VIDAS的快速筛查、qPCR检测和基于培养的分离方法之间存在方法依赖性的检测结果差异[[18]]。虽然qPCR在富集水平上的分析灵敏度高于VIDAS[[18]]，但文化...

**补充材料**
补充表S1提供了所有qPCR阳性样本的详细诊断数据，包括免疫测定结果（VIDAS）、基因特异性Ct值（rfbE、stx1、stx2、eae）和培养确认结果[[18]]。

**伦理批准**
由于本研究未使用人类或动物受试者，因此无需伦理批准[[18]]。

**人类伦理和参与同意**
不适用。本研究不涉及人类参与者[[18]]。

**利益冲突**
作者声明没有利益冲突[[18]]。

**数据可用性**
本研究生成和分析的数据集可根据合理要求向相应的作者索取[[18]]。

**作者贡献声明**
阿登·索伊坎（Adem SOYCAN）：撰写——审阅与编辑、初稿撰写、验证、方法学、调查、数据管理、概念化。穆斯塔法·比尔金（Mustafa B?LG?N）：撰写——审阅与编辑、验证、方法学、正式分析、数据管理[[18]]。