《Plant Biotechnology Journal》：A Modified Cas9 Scaffold Allows Extension of the Virus-Induced Gene Editing Technology to the Large Potyvirus Genus
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植物病毒被公认为是将CRISPR-Cas反应组分递送至植物的快速有效载体，该策略被称为病毒诱导基因编辑（VIGE）。然而，VIGE受限于病毒载体的宿主范围。开发能够靶向更广泛植物物种的新型病毒载体，将有可能实现编辑组分向新品种的递送。马铃薯Y病毒属（Potyv
植物病毒被公认为是将CRISPR-Cas反应组分递送至植物的快速有效载体，该策略被称为病毒诱导基因编辑（VIGE）。然而，VIGE受限于病毒载体的宿主范围。开发能够靶向更广泛植物物种的新型病毒载体，将有可能实现编辑组分向新品种的递送。马铃薯Y病毒属（Potyvirus）包含了最大的植物RNA病毒群体。此类病毒载体表达非编码RNA的主要限制在于潜在的终止密码子插入，这会中断涵盖大部分马铃薯Y病毒基因组的开放阅读框。Streptococcus pyogenesCas9 sgRNA支架的情况便是如此，其在所有三个可能的阅读框中均包含终止密码子。本研究首先建立了一个针对本氏烟草（Nicotiana benthamiana）镁螯合酶亚基I（CHLI）两个同源基因的可视化报告系统。其次，研究人员通过设计一种经过改造的、无终止密码子的Cas9支架，开发了源自烟草蚀纹病毒（TEV; Potyvirus nicotianainsculpentis）的VIGE载体，该支架旨在维持马铃薯Y病毒多聚蛋白的阅读框同时确保有效的编辑效率。该载体能够自我复制并进行系统移动，从而在整个植株中高效递送sgRNA。这使得研究人员能够通过受感染叶片的离体再生获得表现出白色表型的四等位基因编辑植株，并产生了编辑后代。研究人员进一步在番茄中证实了该载体的效用。鉴于马铃薯Y病毒属内保守的生物学特性，这些发现可能广泛适用于其他马铃薯Y病毒，从而扩展了VIGE技术的应用范围。
论文解读：拓展病毒诱导基因编辑技术在马铃薯Y病毒属中的应用
研究背景与意义
随着靶向基因组编辑技术特别是CRISPR-Cas系统的出现，植物科学发生了革命性变化。然而，基因组编辑在植物中的广泛应用通常受到劳动密集型且基因型特异的离体组织培养的限制，这些方法通常涉及农杆菌介导的转化或基因枪法。病毒诱导基因编辑（VIGE）作为一种有前景的替代方案应运而生，它利用植物病毒作为瞬时递送载体，能够绕过或显著减少离体组织培养的需求。尽管RNA病毒载体因其不整合外源DNA的特性备受青睐，但其有限的装载容量使得递送像Streptococcus pyogenesCas9（SpCas9）这样的大分子核酸酶极具挑战性。此外，每种病毒载体的宿主范围有限，也制约了VIGE技术的普适性。马铃薯Y病毒属（Potyvirus）是最大的植物RNA病毒群，但其基于多聚蛋白的表达策略使得表达非编码RNA（如sgRNA）面临巨大障碍，因为sgRNA支架中的终止密码子会破坏其开放阅读框。因此，本研究旨在克服这一限制，将VIGE技术拓展至该病毒属，以扩大其宿主范围和应用潜力。该研究成果发表于《Plant Biotechnology Journal》。
主要关键技术方法
本研究采用了多项关键技术。首先，建立了基于本氏烟草CHLI基因的视觉报告系统，用于评估体内编辑效率。其次，利用CRISPOR工具设计了针对CHLI同源基因的sgRNA。核心方法是设计并构建了含有无终止密码子修饰支架（sgRNAm）的烟草蚀纹病毒（TEV）载体。此外，还构建了马铃薯X病毒（PVX）和烟草脆裂病毒（TRV）作为对照载体。为了获得可遗传的编辑植株，研究人员对TEV载体进行了衰减突变处理。实验材料主要包括表达SpCas9的本氏烟草和番茄MicroTom栽培种。通过农杆菌渗透法进行植物接种，并利用推断的CRISPR编辑（ICE）分析、桑格测序以及逆转录PCR（RT-PCR）等手段检测编辑效率和病毒侵染情况。
研究结果
2.1 利用视觉报告系统评估植物VIGE
研究人员首先选择了本氏烟草的CHLI基因作为理想的视觉标记，因为该植物是异源四倍体，拥有位于不同染色体上的两个同源基因座（CHLI-A和CHLI-B）。通过将三种不同的sgRNA克隆到已验证的TRV和PVX载体中，并在sgRNA的3'端添加拟南芥FT移动结构域以促进可遗传编辑。结果显示，虽然所有组合都能诱导白色表型斑块，但TRV载体引起的漂白程度比PVX更均匀，且编辑活性显著更高。叶绿素含量测定证实，白化表型与CHLI基因敲除导致的叶绿素合成减少直接相关。这表明CHLI是一个优秀的标记基因，且VIGE的效果取决于所选sgRNA和病毒载体。
2.2 利用CHLI报告系统分析可遗传VIGE
基于上述结果，研究人员选择sgRNA-1评估TRV和PVX在生殖系传递中的差异。种子萌发实验表明，TRV产生的编辑种子比例约为PVX的三倍（35% vs. 13%）。幼苗表型可分为绿色、浅绿色/黄色和白色三类，且这三种表型与编辑等位基因的数量（分别为0-2个、3个和4个）呈强相关性。值得注意的是，拥有3个编辑等位基因的黄色植株可以在土壤中生长并产生可育花朵，其后代呈现出预期的孟德尔遗传分离比。这证明在异源四倍体本氏烟草中，可以通过叶色直观预测CHLI标记基因的编辑结果。
2.3 设计适用于马铃薯Y病毒载体VIGE的修饰sgRNA
为了将VIGE技术拓展至马铃薯Y病毒属，研究人员针对TEV载体进行了设计。由于SpCas9支架在所有三个阅读框中都包含终止密码子，会中断病毒的多聚蛋白翻译，研究人员基于Nishimasu等人的工作，设计了一种经过修饰的无终止密码子SpCas9支架（sgRNAm）（包含U25C, A46G突变和ΔC30-G39缺失）。功能测试表明，该修饰支架在TRV载体中保留了与原始支架相同的编辑效率。随后，将sgRNAm-1克隆到TEV载体中。虽然TEV能诱导基因编辑，但伴随严重的坏死症状导致植株生长受限。为此，研究人员在HC-Pro基因中引入了单点突变（CLA2和AS13a）以衰减病毒症状，使得感染植株能够存活并结籽，尽管编辑效率与症状严重程度呈正相关。
2.4 利用TEV载体进行离体再生编辑植株及可遗传基因编辑
研究人员评估了从TEV载体感染的愈伤组织中再生编辑植株的可能性。从表现出白色斑点的叶片中，成功再生了完全编辑的白色植株。更重要的是，研究人员调查了衰减型TEV-sgRNAm-1载体在植物生殖系中的遗传情况。收集靠近白色组织的花朵种子进行萌发，结果显示，来自TEV-CLA2感染植株的子代中有5%携带至少一个编辑等位基因，且经RT-PCR证实编辑后代中未检测到TEV病毒，表明获得了无病毒残留的编辑植株。
2.5 扩展马铃薯Y病毒载体在VIGE中的应用
为了验证TEV载体的通用性，研究人员在农艺重要的番茄MicroTom品种中进行了测试。使用野生型（非衰减）TEV-sgRNAm-1载体接种表达SpCas9的番茄植株，虽然未观察到明显的白色斑块，但ICE分析显示近75%的样本显示出可检测的编辑信号。此外，研究人员还将相同的策略应用于其他两种马铃薯Y病毒——莴苣花叶病毒（LMV）和芜菁花叶病毒（TuMV），并在本氏烟草中证实了它们作为VIGE载体的有效性，其中TuMV显示出比LMV更高的编辑效率。
结论与讨论
本研究成功地将VIGE技术拓展至最大的植物RNA病毒群——马铃薯Y病毒属。通过设计一种无终止密码子的修饰型Cas9 sgRNA支架，解决了该类病毒在多聚蛋白表达框架下容纳非编码RNA的关键技术瓶颈。研究结果表明，利用衰减的TEV载体，不仅能够在本氏烟草中实现体细胞编辑和离体再生，还能产生可遗传且无病毒残留的编辑后代。此外，该技术平台在番茄以及其它马铃薯Y病毒（如TuMV和LMV）中的成功应用，证明了其广泛的宿主适用性和巨大的应用潜力。尽管目前仍需依赖于预先表达Cas9的植物品系，但这项研究为未来开发完全由病毒递送所有基因编辑组件（包括微型Cas核酸酶）的DNA-free流程奠定了坚实基础，有望加速重要作物和模式植物的精准基因组工程进程。
