作为治疗性肽类新型口服递送平台的3-羧基丙基接枝生物无机层状纳米复合材料的开发

《Journal of Advanced Research》：Development of 3-carboxypropyl-grafted bio-inorganic lamellar nanocomposite as a new oral delivery platform for therapeutic peptides

三、摘要翻译 引言：治疗性多肽药物开发的主要挑战之一在于其低渗透性和固有不稳定性。因此，能够稳定多肽并增强膜转运的制剂对于成功的产品开发和改善临床结果至关重要。 目的：本研究旨在构建一种生物无机层状纳米复合材料，作为稳定锚定治疗性多肽的新型口服递送平台。 结果：通过溶胶-凝胶法合成了3-羧丙基接枝页硅酸盐（CA-clay）。CA-clay具有层状结构，层间距约为1.72 nm，并在水中分散为阴离子纳米片。在各种细胞系中，CA-clay在高达500 μg/mL浓度下无毒，对细胞活力、膜完整性或凋亡活性均无影响。此外，当静脉或口服给予大鼠时，CA-clay主要通过尿液和粪便排泄迅速从体内清除，24小时内几乎完全恢复剂量。这些发现表明CA-clay不太可能在组织中持续存在，支持其长期蓄积潜力低。CA-clay在酸性至碱性pH范围内保持负电荷，能与具有宽范围等电点的多肽形成稳定的纳米复合物。基于CA-clay的纳米复合物显著提高了热不稳定多肽蜂毒肽在长期高温储存下的热稳定性。此外，基于CA-clay的纳米复合物显著增强了胰岛素在糖尿病大鼠体内的细胞摄取和口服疗效。 结论：CA-clay具有作为无毒、生物相容性药物递送载体的巨大潜力，为治疗性多肽的高效口服递送平台铺平了道路。

四、论文解读

研究背景与立项依据

生物制药，包括多肽、蛋白质和抗体，虽具有多样生理活性和治疗潜力，但在制造、储存及临床应用中常面临多重不稳定性问题，其结构易受热、pH值、酶等因素影响而失活。此外，这类药物通常伴有低膜通透性和广泛的体内酶降解，导致治疗效果受限。目前，大多数生物制药仅能通过注射给药，患者依从性差且存在安全隐患。因此，开发能够稳定药物、抵抗生理应激并促进非侵入性给药的载体成为迫切需求。尽管天然粘土及其有机衍生物因化学惰性、高载药量和生物相容性被视为理想载体，但其存在水溶性低、层间区域极性大、难以与大分子或非极性有机物相互作用，且天然成分杂质多、批次间差异大等问题。相比之下，合成粘土虽然纯度高、特性可控，但多数在水中分散后带正电荷，限制了其与阳离子多肽和蛋白质形成纳米复合物的能力。鉴于此，研究人员设计并合成了一种新型阴离子有机粘土——3-羧丙基功能化镁页硅酸盐（CA-clay），旨在作为稳定锚定治疗性多肽的稳健平台，并系统评估其生物相容性及作为药物载体的适用性。

关键技术方法概述

本研究采用溶胶-凝胶法合成CA-clay，并利用核磁共振（NMR）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、X射线衍射（XRD）、热重分析（TGA）、透射电子显微镜（TEM）及Zeta电位分析等技术对其结构与理化性质进行表征。研究人员通过动态光散射（DLS）和Zeta电位测量评估其粒径分布与表面电荷。在安全性评价方面，采用了MTT法、乳酸脱氢酶（LDH）释放实验及Annexin V/PI双染流式细胞术和共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）评估其对多种细胞系的潜在毒性。体内分布与消除研究则利用荧光标记的Cy5-CA-clay，通过高效液相色谱（HPLC）定量分析及活体成像技术，考察了大鼠静脉注射和口服给药后的组织分布及排泄途径。此外，以蜂毒肽（Melittin）和胰岛素（Insulin）为模型药物，制备了载药纳米复合物，并通过圆二色光谱（CD）分析药物构象稳定性，结合模拟胃肠液考察其释放特性及在Caco-2细胞的摄取情况，最终在链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病大鼠模型中评估了口服胰岛素的药效学参数。

研究结果

1. 3-羧丙基功能化镁页硅酸盐（CA-clay）的结构与理化特征

研究人员通过多种分析手段证实，CA-clay具有近似[(CH₂)₃COONa]₈Si₈Mg₆O₁₆(OH)₄的单元胞组成。NMR和FT-IR光谱证实了丙基羧酸根基团的成功引入，EDX分析确认了Mg、Si、C、O和Na等主要元素的存在。XRD分析显示其具有层状结构，层间距（d₀₀₁）约为1.72 nm，TEM图像进一步直观展示了其堆叠的层状形貌。TGA结果表明其在约400 °C以下具有良好的热稳定性。CA-clay在水中表现出狭窄的粒径分布，平均流体动力学直径为51.6 ± 0.74 nm，且在酸性至碱性pH范围内均能维持负表面电荷，这归因于表面羧基的电离状态变化。

2. CA-clay的长期储存稳定性

通过对储存于4 °C和25 °C（40% RH）条件下1年的CA-clay样品进行NMR和FT-IR分析，结果显示其化学结构未发生显著降解，证明了CA-clay在室温下亦具备适合长期储存和处理的稳定性。

3. CA-clay的体外毒性

通过MTT、LDH及Annexin V等多种细胞毒性实验评估，CA-clay在高达500–1000 μg/mL的浓度下，对Caco-2、CCD-986sk、A549和MRC-5四种细胞系的细胞活力、膜完整性及凋亡活性均未产生显著影响。CLSM图像进一步证实了经CA-clay处理后，细胞未表现出明显的磷脂酰丝氨酸外翻或膜破裂现象，表明其具有极低的潜在细胞毒性。

4. CA-clay的生物分布与消除

大鼠体内研究表明，静脉注射的Cy5-CA-clay主要在肝脏分布，随后通过尿液和粪便迅速清除；口服给药后则主要分布于肠道并随粪便排出。定量分析显示，静脉注射后24小时内约69.7%的剂量通过尿液排出，24.1%通过粪便排出；而口服给药后87.2%的剂量在24小时内随粪便排出。这表明CA-clay在体内滞留时间短，几乎不存在长期组织蓄积的风险。

5. 载药CA-clay纳米复合物的制备与表征

利用静电相互作用，CA-clay分别与带正电的蜂毒肽和胰岛素形成了Mel-CA-clay和Ins-CA-clay纳米复合物。TEM显示二者均呈球形，粒径与DLS测量结果一致。EDX映射分析证实了胰岛素中硫元素与CA-clay中镁、硅等元素在复合物中的共存。CD光谱表明，包封在纳米复合物内的药物能够保持其二级结构。

6. 载药CA-clay纳米复合物的热稳定性

在高温（40 °C）储存60天的实验中，与游离药物相比，包封在CA-clay中的蜂毒肽和胰岛素均表现出了显著的构象稳定性提升，尤其是蜂毒肽，其热稳定性得到了极大改善，这归因于无机粘土基质对多肽的物理隔离保护作用。

7. 表面修饰载药CA-clay纳米复合物的性能

为提高口服吸收并靶向结肠，研究人员对Ins-CA-clay进行了壳聚糖（Chitosan）和尤特奇（Eudragit）S100的序贯涂层修饰。结果显示，ECT/Ins-CA-clay在pH 1.2条件下释放率低（约31.7%），而在pH 7.4条件下释放率显著增加（约74.6%），表现出良好的pH响应性。在模拟胃液和肠液中，该修饰显著增强了胰岛素的抗酶解稳定性。细胞摄取实验表明，尽管CA-clay带负电，但仍能显著促进Caco-2细胞对胰岛素的摄取。在STZ诱导的糖尿病大鼠模型中，ECT/Ins-CA-clay口服给药后表现出显著的降血糖效应，最大降糖幅度（E_max）约为58.1%，药效学利用率（PA）达到约4.38%，较游离胰岛素溶液提高了约10倍。

结论与讨论总结

本研究成功合成了一种生物无机层状纳米复合材料CA-clay，该材料在水中可溶且在宽pH范围内保持负电荷。研究表明，CA-clay对细胞活力、膜损伤及凋亡的影响极小，表现出较低的潜在毒性。在大鼠体内，无论是静脉还是口服给药，CA-clay均通过尿液和粪便迅速清除，提示其长期蓄积风险较低。通过与CA-clay形成纳米复合物，不仅有效提高了热不稳定多肽（如蜂毒肽）的热稳定性，还显著增强了胰岛素在糖尿病大鼠体内的口服疗效。因此，基于CA-clay的纳米复合物为多肽类药物提供了一种更简单、更具成本效益的口服递送载体。鉴于CA-clay在宽pH范围内维持负表面电荷的特性，使其能够与具有不同等电点的多肽和蛋白质药物相互作用，这极大地增强了其作为锚定多种生物分子的稳健平台的潜力。此外，通过羧基的酯化或酰胺化反应，还可将各种用于疾病靶向和生物成像的功能配体引入CA-clay中。当然，为了推动其临床应用，仍需在相关毒理学模型中针对急性和慢性暴露进行更广泛的安全性评估。