《Journal of Biotechnology》：Leveraging Mixed-Mode Filter During Cell Culture Harvest to Prevent Antibody Reduction
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王振书|迈克尔·哈特曼|吉坦贾莉·彭迪亚拉|维维安·加斯卡|谢安德鲁|马吉德·阿尔斯拉伊蒂|香农·里维拉|安东·科兹里耶夫|苏曼·南迪|钱瑞琳|吴素阳|张小琳|帕特里夏·罗斯|桑德拉·贝努恩|桑杰夫·阿胡贾
默克公司（Merck & Co., Inc.）生物制品工艺研究与开发部（
王振书|迈克尔·哈特曼|吉坦贾莉·彭迪亚拉|维维安·加斯卡|谢安德鲁|马吉德·阿尔斯拉伊蒂|香农·里维拉|安东·科兹里耶夫|苏曼·南迪|钱瑞琳|吴素阳|张小琳|帕特里夏·罗斯|桑德拉·贝努恩|桑杰夫·阿胡贾
默克公司（Merck & Co., Inc.）生物制品工艺研究与开发部（BPR&D），新泽西州拉赫韦
摘要
在一种采用中国仓鼠卵巢（CHO）工艺生产的单克隆抗体（mAb1）中观察到二硫键的还原现象，这一过程主要由 harvested cell culture fluid (HCCF) 中存在的硫氧还蛋白（Trx）– 硫氧还蛋白还原酶（TrxR）系统驱动。为了解决这个问题，我们评估了 Solventum Polisher ST (PST) 深层过滤器作为二级收获阶段的过滤步骤，旨在去除具有氧化还原活性的酶并提高产品稳定性。质谱分析显示，在负载量达到 150 L/m2 时，PST 过滤可减少约 1 log 的 Trx 和葡萄糖-6-磷酸 1-脱氢酶（G6PD）；而在负载量达到 100 L/m2 时，TrxR 无法检测到。蛋白质生物物理性质的计算表明 Trx 与 mAb1 之间存在强烈的静电吸引力，这可能在常规季铵过滤器中促进酶-抗体的共洗脱。与稀释、KMnO? 氧化以及使用 L-半胱氨酸的可逆抑制相比，PST 过滤在室温下最有效地抑制了七天内的二硫键还原。在 PST 过滤前向 HCCF 中添加含有胍基的化合物，进一步将 100–200 L/m2 浓度范围内 mAb1 的稳定性从 19.5 小时延长至 72.5–95.3 小时，证实了胍基在减轻还原作用中的功能性作用。高达 50 L 的中试批次评估显示出一致的性能，证明 PST 过滤是一种实用且可靠的方法，可用于控制生物工艺收获过程中的酶促还原。
引言
单克隆抗体（mAb）是治疗癌症和自身免疫疾病的重要生物制剂，由于其高产量和转录后修饰能力，中国仓鼠卵巢（CHO）细胞被用作主要生产平台。mAb 制造过程中一个持续存在的挑战是收获过程中抗体的还原，这主要是由于链间二硫键的断裂所致（Handlogten 等，2020；O’Mara 等，2019；Trexler-schmidt 等，2010；Hutterer 等，2013）。这种还原由复杂的相互关联机制驱动，包括离心和深层过滤过程中的机械剪切作用，这些作用会导致细胞裂解并释放出如 TrxR 和 G6PD 等还原酶。这些酶以 NADP+/NADPH 依赖的方式催化二硫键的还原（O’Mara 等，2019），从而破坏抗体结构和功能，增加游离巯基和聚集物的数量，加速产品降解（Chung 等，2017）。
已经探索了多种策略来减轻抗体还原，包括化学抑制还原酶和调节 HCCF 中的氧化还原电位。例如，增加溶解氧或添加铜(II)离子已被证明可以改善氧化还原平衡（Handlogten 等，2020），而 CuSO?、EDTA、L-半胱氨酸和空气喷射的组合（Trexler-schmidt 等，2010）以及过氧化氢的补充（Du 等，2018）也进行了研究。
带电过滤器通过静电相互作用成为去除残余 DNA（rDNA）和宿主细胞蛋白（rHCP）的有效工具。O’Mara 等人证明，Solventum Harvest RC 过滤器在去除 rDNA 和 rHCP 方面上的效果与多阶段纯化过程（结合 Emphaze AEX 混合纯化器使用）相当（O’Mara 等，2023）；而 Parau 等人发现二级带电过滤器（X0HC 和 X0SP）对去除 rDNA 或 rHCP 没有显著效果，rDNA 在收获后会在 Protein A 柱中积累（Parau 等，2023）。这些结果强调了静电相互作用在过滤效率中的重要性（Yigzaw 等，2006）。最近推出的 Solventum Polisher ST (PST) 功能化色谱膜吸附剂含有季铵基和胍基，具有混合模式功能，在去除 rHCP 和病毒方面显示出潜力（Hester 等，2020），但其在收获过程中的应用尚未有相关报道。
在本研究中，我们首次系统地评估了 Polisher ST 过滤器作为二级带电过滤器的效果，该过滤器利用膜表面功能化的胍基选择性地去除 Trx 和 TrxR。蛋白质-蛋白质对接和表面斑点分析显示 Trx 与 mAb1 之间可能存在有利的静电相互作用。这种蛋白质-蛋白质相互作用可能保护负电荷，或使 Trx 能够通过带正电荷的过滤器，从而减少其与常规季铵配体的结合。我们将这种方法与添加 L-半胱氨酸（一种竞争性抑制剂）和 KMnO?（一种氧化剂）进行了比较，结果发现 Polisher ST 策略的性能更优。值得注意的是，在 Polisher ST 过滤前向 HCCF 中添加含有胍基的化合物，将 100–200 L/m2 浓度范围内 mAb1 的稳定性延长至 72.5–95.3 小时，而尿素或 NaCl 的添加则没有类似效果（仅延长至 19.5 小时），这突显了胍基在减轻抗体还原中的独特作用。
章节片段
材料与方法
更多实验和方法细节请参见补充信息（SI）。
发现 mAb 1 对二硫键还原的敏感性
在一个 50 升的一次性生物反应器中培养 mAb1，并使用非带电过滤器（D0SP + PDE2）进行连续深层过滤以获取用于下游纯化过程的样品，以研究 rDNA 和 rHCP 的去除情况。在初级过滤器的压差为 15 psi 的条件下，对二次过滤后的样品进行了最坏情况研究。NR CE-SDS 分析（表 S1）显示抗体单体含量降低了十倍。
结论
我们证明 Polisher ST 作为一种有效的二级带电过滤器，在高程度裂解的 HCCF 中可将抗体二硫键的还原程度降低至 150 L/m2。对 Polisher ST 过滤后早期 HCCF 分馏物的靶向 LC–MS 分析显示 G6PD、Trx 和 TrxR 的选择性减少。蛋白质生物物理性质计算表明 Trx 与 mAb1 之间的静电相互作用是可能的，这可能有助于 Trx 通过季铵功能化介质的传输。
资金信息
本工作得到了默克公司（Merck & Co., Inc.）的支持。
CRediT 作者贡献声明
王振书：写作 – 审稿与编辑、撰写初稿、数据可视化、验证、监督、项目管理、方法论设计、调查、数据分析、数据整理、概念化。迈克尔·哈特曼：写作 – 审稿与编辑、撰写初稿、数据可视化、数据分析。吴素阳：写作 – 审稿与编辑。张小琳：写作 – 审稿与编辑。帕特里夏·罗斯：写作 – 审稿与编辑。桑德拉·贝努恩：写作 – 审稿与编辑。
写作过程中使用生成式 AI 和 AI 辅助技术的声明
在准备本手稿的过程中，作者使用 GPT-5 mini 对初稿进行了语言润色。作者随后根据需要审阅和修改了文本，并对其发表内容承担全部责任。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的利益冲突或个人关系。
致谢
作者感谢 Elvin Yang 和 Viktor Boris 在本研究中的细胞培养工作，同时也感谢 Divya Chandra 的宝贵讨论。
王振书、迈克尔·哈特曼、吉坦贾莉·彭迪亚拉、谢安德鲁、维维安·加斯卡、马吉德·阿尔斯拉伊蒂、香农·里维拉、安东·科兹里耶夫、苏曼·南迪、钱瑞琳、吴素阳、张小琳、帕特里夏·罗斯、桑德拉·贝努恩和桑杰夫·阿胡贾是默克公司（Merck & Co., Inc.）旗下子公司 Merck Sharp & Dohme LLC 的员工，该公司可能拥有相关权益。
