牛乳中的非金黄色葡萄球菌和哺乳动物球菌（NASM）：抗菌素耐药性、毒力及其与巴西饲养管理实践的关联

《Journal of Dairy Science》：Non-aureus Staphylococci and Mammaliicocci (NASM) in bovine milk: antimicrobial resistance, virulence, and associations with management practices in Brazil

布鲁娜·洛伦索·克里帕（Bruna Louren?o Crippa）|埃里克·达席尔瓦·佩雷拉（Erik da Silva Pereira）|克拉丽丝·热巴拉（Clarice Gebara）|辛蒂娅·米纳夫拉（Cíntia Minafra）|赫利奥·朗戈尼（Hélio Langoni）|安德烈·塔莱尔·内托（André Thaler Neto）|莫妮卡·科雷亚·贡萨雷斯（M?nica Correia Gon?alves）|莫妮卡·塞尔凯拉（M?nica Cerqueira）|卡洛斯·E·菲德尔利斯（Carlos E. Fidelis）|马科斯·维加·多斯桑托斯（Marcos Veiga dos Santos）|索拉亚·德阿劳茹·迪尼兹（Soraia de Araújo Diniz）|费尔南多·诺盖拉·索扎（Fernando Nogueira Souza）|娜塔莉亚·克里斯蒂娜·西罗内·席尔瓦（Nathália Cristina Cirone Silva）

巴西圣保罗州坎皮纳斯市坎皮纳斯州立大学（UNICAMP）食品工程学院（FEA）食品科学与营养系

**摘要**
非金黄色葡萄球菌和哺乳动物球菌（NASM）经常在乳腺炎和乳房内感染病例以及乳房外环境中从牛奶中分离出来。尽管在NASM的物种水平鉴定方面取得了进展，但不同研究之间的鉴定结果并不一致，这可能限制了对它们流行病学意义的全面理解。本研究旨在对巴西五大乳制品生产区域从牛奶中分离出的NASM进行全面表征。使用MALDI-ToF质谱技术，对来自体细胞计数（SCC）低和高的奶牛以及临床乳腺炎病例的309株NASM进行了物种水平的鉴定。所有分离株均接受了抗菌药物敏感性测试，并筛查了甲基苯唑西林耐药基因（mecA、mecC）、消毒剂耐药基因（qacAB、qacC）和肠毒素基因（sea、seb、sec、sed、see、seg、seh、sei）的存在。此外，还评估了NASM的发生与畜群管理实践之间的关联。

共鉴定出18种NASM，其中Staphylococcus chromogenes（58.6%）、S. simulans（8.4%）和S. haemolyticus（8.1%）是最常见的分离株。41株（13.3%）被归类为多重耐药菌，15株携带mecA基因。最常检测到的肠毒素基因是seb，存在于15.2%的分离株中。管理与NASM出现的关联分析表明，Staphylococcus chromogenes广泛存在于具有良好挤奶卫生条件的农场中，而非色素生成菌种则更常与卫生措施不规范的畜群相关。

本研究首次对巴西多个地区的NASM进行了大规模、物种水平的评估，整合了表型、基因型和管理相关数据。研究结果突显了NASM作为常见乳房内病原体的重要性，以及它们在乳腺炎持续存在、抗菌药物耐药性传播和乳牛群管理挑战中的作用。

**解释性总结**
非金黄色葡萄球菌和哺乳动物球菌（NASM）越来越多地被视为牛奶中的重要细菌，对乳房健康和牛奶质量有影响。我们鉴定了来自巴西五大乳制品区域的309株NASM，评估了其物种分布、抗菌药物耐药性、毒力基因和农场管理实践。结果显示，Staphylococcus chromogenes的频率较高，13.3%的分离株具有多重耐药性，并且检测到了相关毒素基因。这些发现为了解巴西奶牛场中的NASM提供了全面概述，强调了它们在乳腺炎、抗菌药物耐药性传播以及乳牛群管理中的潜在作用。

**引言**
非金黄色葡萄球菌和哺乳动物球菌（NASM）是从无菌采集的奶样中最常分离出的细菌。尽管NASM被认为是次要的乳腺炎病原体，但它们可以引起亚临床乳腺炎，甚至在少数情况下引起临床乳腺炎（Naushad等人，2016年）。已在奶牛的不同解剖部位及周围农场环境中鉴定出多种NASM菌种，它们占据着多种不同的生境。例如，Staphylococcus cohnii主要存在于奶牛的粪便和环境中，表明这些菌种引起的乳房内感染可能是环境性的。相比之下，Staphylococcus chromogenes通常从无菌采集的奶样中分离出来，表明它可能适应了乳房环境（Piessens等人，2011年；De Visscher等人，2014年；Vanderhaeghen等人，2014年、2015年；Wuytack等人，2019年；De Buck等人，2021年）。此外，已记录了牛相关NASM菌种在流行病学、生态学（Vanderhaeghen等人，2015年；Souza等人，2016年）、抗菌药物耐药性（Fergestad等人，2021年）、毒力（Vanderhaeghen等人，2014年；Wuytack等人，2020年、Zmantar等人，2011年；Fran?a等人，2021年）、宿主相互作用（Simojoki等人，2012年；Piccart等人，2016年；Souza等人，2016年、2022年）及其对乳房健康和牛奶生产的影响（Piepers等人，2010年；Tomazi等人，2015年；Valckenier等人，2019年、2020年、2021年；Crippa等人，2024年；Cuny等人，2011年）方面的显著差异。尽管如此，NASM仍经常从无菌采集的奶样中分离出来，但其在乳房健康中的具体作用尚不清楚，需要进一步研究来填补这一知识空白（Addis等人，2024年；Freu等人，2024年；Gómez-Sanz等人，2010年；ISO（国际标准化组织），2006年；Johnson等人，1991年；Klibi等人，2018年）。此外，先前的研究表明，如挤奶频率和乳头消毒程序等畜群管理实践，以及畜群和环境特征（包括畜群规模和当地气候）会影响NASM的流行率（Lan等人，2017年）。因此，本研究的主要目的是从巴西所有地区的奶牛奶样中分离和鉴定NASM菌种，这是迄今为止在该国进行的最大规模的NASM调查。物种鉴定使用的是矩阵辅助激光解吸/电离-飞行时间质谱（MALDI-ToF MS）技术。次要目标包括表征抗菌药物耐药性、筛查与肠毒素产生相关的基因、消毒剂耐药基因和甲基苯唑西林耐药基因，以及评估与鉴定出的NASM菌种相关的畜群管理实践。

**材料与方法**

**牛奶采样和体细胞计数（SCC）测量**
本研究收集了1,468份牛奶样本，包括每头奶牛各乳区的1,270份混合牛奶样本和198份临床乳腺炎病例的乳区牛奶样本。牛奶样本由研究人员在兽医的协助下按照研究团队提供的指导和培训进行无菌采集。研究仅包括哺乳期奶牛。样本来自分布在巴西五个区域（南部、东南部、中西部、东北部和北部）的17个奶牛群（圣卡塔琳娜州268份样本，4个畜群；圣保罗州356份样本，1个畜群；戈亚斯州258份样本，3个畜群；帕拉伊巴州285份样本，6个畜群；帕拉州301份样本，3个畜群）。农场的选择是基于便利性的。临床乳腺炎病例根据 strips cup 测试发现的肉眼可见的牛奶变化以及局部和系统的临床表现进行诊断。亚临床乳腺炎定义为体细胞计数（SCC）超过200,000个/毫升。乳房内感染（IMI）定义为从无菌采集的牛奶样本中分离出NASM，符合乳腺炎诊断的标准微生物学标准（Oliver等人，2004年；Omoe等人，2013年；Adkins等人，2017年）。牛奶SCC使用Fossomatic 5000 Basic?（Foss，丹麦）流式细胞仪根据ISO 13366–2:2006标准进行测量。SCC测定时，牛奶样本用bronopol保存，而用于总细菌计数（TBC）分析的样本则用Azidiol保存。采集后，样本在冷藏条件下（≤10°C）运送到实验室。

**微生物分析**
所有样本在?20°C下保存，最长保存7天以备后续处理。培养前，按照国家乳腺炎委员会（National Mastitis Council）的指南（Adkins等人，2017年）准备冷冻样本。

**奶牛群管理实践**
在采奶时，向每个奶牛场的管理人员发放了问卷，以获取有关奶牛群管理实践的信息。该问卷用于本研究的统计分析，涵盖了挤奶管理、乳腺炎控制实践等38个问题，包括挤奶类型、健康奶牛优先挤奶顺序、使用一次性手套、挤奶前清洗乳头、预浸泡、乳头干燥、挤奶后浸泡、加州乳腺炎测试（CMT）的执行、临床乳腺炎的即时治疗、抗生素选择、牛奶样本的常规培养、乳腺炎病原体的抗菌图谱分析、挤奶期间的喂养、挤奶后立即提供食物、干奶期疗法、使用乳头密封剂、乳腺炎疫苗、淘汰受乳腺炎影响的动物、使用热水清洁挤奶设备以及使用碱性洗涤剂、酸性洗涤剂和消毒剂清洁挤奶设备等。问卷还收集了奶牛场特征信息，如日产量、哺乳期奶牛数量、繁殖系统、技术支持及挤奶设备的维护情况。问卷（附录1）已提交给坎皮纳斯大学的研究伦理委员会（CEP），并获得批准（批准编号3.556.852）。

**NASM的分离与鉴定**
分析前，根据国家乳腺炎委员会的指南（Adkins等人，2017年），将冷冻样本在室温下解冻。细菌分离时，每份牛奶样本取0.01 μL接种在羊血琼脂（5%体积/体积，Oxoid，英国巴斯ингсток）上，并在37°C下 aerobic 条件下培养。24小时、48小时和72小时后检查平板（Oliver等人，2004年）。记录菌落数量，并根据菌落形态区分纯培养和混合培养。选择最多3个符合葡萄球菌形态的菌落进行进一步表征。单个菌落形态的平板被视为纯培养，具有两种不同菌落形态的平板被归类为混合生长。具有三种或更多不同菌落形态的平板被视为污染样本，不予进一步分析（遵循国家乳腺炎委员会的指南，Adkins等人，2017年）。当至少观察到一个菌落时（约相当于100 cfu/mL），样本被视为培养阳性。当检测到混合生长时，鉴定出主要分离株并记录下来以供进一步分析（Langhorne等人，2024年；Mehrotra等人，2000年）。

选定的菌落进行革兰氏染色、过氧化氢酶和凝固酶测试。符合葡萄球菌特征的菌落划线接种到甘露醇盐琼脂（Oxoid，英国巴斯ингсток）上，以帮助区分金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和NASM。表现出与金黄色葡萄球菌一致的表型特征的菌株通过PCR确认，并分配到单独的研究项目中。未确认为金黄色葡萄球菌的所有分离株（包括疑似NASM）使用MALDI-ToF MS进行物种鉴定。物种鉴定遵循MBT Biotyper Compass v.4.1.100数据库和制造商评分标准，得分≥2.0视为可靠的物种水平鉴定。仅包含NASM分离株（Barcelos等人，2019年；Almeida等人，2024年）。

由于农场是按便利性选择的，且奶牛是在特定时间采集的，因此结果代表的是采样时所选哺乳期奶牛中NASM的分离频率，不应解释为整个畜群的流行率。

**抗菌药物耐药性**
使用圆盘扩散法评估NASM分离株的表型抗菌药物耐药性，并根据欧洲抗菌药物敏感性测试委员会（EUCAST，2024年；BrCAST，2025年；Büthe等人，2025年）的指南进行解释。圆盘扩散试验使用含有庆大霉素（10 μg）、苯唑西林（1 μg）、头孢西丁（30 μg）、四环素（30 μg）、红霉素（15 μg）、克林霉素（2 μg）、妥布霉素（10 μg）、氯霉素（30 μg）和青霉素（10 μg）的抗菌药物圆盘。抑制圈直径根据EUCAST/BrCAST对葡萄球菌的临床临界值进行解读（单位：毫米）：庆大霉素，R <22且S ≥22；苯唑西林，R <20且S ≥20；头孢西丁，R <22且S ≥22；四环素，R <19且S ≥19；红霉素，R <21且S ≥21；克林霉素，R <22且S ≥22；妥布霉素，R <20且S ≥20；氯霉素，R <18且S ≥18；青霉素，R <26且S ≥26。对于Staphylococcus epidermidis，应用EUCAST/BrCAST推荐的物种特异性头孢西丁临界值（R <27 mm；S ≥27 mm）。由于针对从牛乳腺炎中分离出的非金黄色葡萄球菌的圆盘扩散临界值有限，因此解释基于可用的葡萄球菌临床临界值。多重耐药（MDR）分离株定义为对三种或更多抗菌药物类别具有耐药性的菌株。

**肠毒素产生基因、消毒剂耐药性和甲基苯唑西林耐药性的检测**
首先使用InstaGene Matrix试剂盒（Bio-Rad Laboratories，加利福尼亚州赫拉克勒斯）进行NASM分离株的DNA提取（按照制造商说明）。随后使用NanoDrop Lite分光光度计（Thermo Fisher Scientific）测定DNA浓度。提取和定量后，使用特定寡核苷酸扩增编码葡萄球菌肠毒素（sea、seb、sec、sed、see、seg、sej、seh）、消毒剂耐药基因（qacAB、qacC）和甲基苯唑西林耐药基因（mecA和mecC）的基因。用于检测这些基因的PCR条件见表1。用于检测非金黄色葡萄球菌（NASM）和哺乳动物球菌中与产肠毒素、甲氧西林抗性和消毒剂耐受性相关的基因的寡核苷酸和PCR条件

基因 引物序列 产物大小（bp） 退火温度 对照 参考文献

sea SEA-1 TTGGAAACGGTTAAAACGA 120 50 CATCC 136 53 (Johnson et al., 1991)
SEA-2 GAACCTTCCCATCAAAAACA 47 85 CATCC 144 58 (Johnson et al., 1991)
SEB-1 TCGCATCAAACTGACAAACG 25 50 CATCC 190 95 (Johnson et al., 1991)
SEB-2 GCAGGTACTCTATAAGTGCC 25 50 CATCC 232 35 (Johnson et al., 1991)
SEC-1 GACATAAAAGCTAGGAATTT 25 50 CATCC 232 35 (Johnson et al., 1991)
SEC-2 AAATCGGATTAACATTATCC 25 50 CATCC 232 35 (Johnson et al., 1991)
SEE-1 AGGTTTTTTCACAGGTC 20 7 CATCC 276 64 (Mehrotra et al., 2000)
SEE-2 CTTTTTTTTCTTCGGTCA 25 7 CATCC 232 35 (Omoe et al., 2013)
SEG-1 AAGTAGACATTTTTGGCGTTCC 25 5 CATCC 232 35 (Omoe et al., 2013)
SEH-1 GTCTATATGGAGGTACAAC 21 5 CFRI 36 1 (Omoe et al., 2013)
SEH-2 GACCTTTACTTATTTCGCTGTC 25 5 CFRI 36 1 (Omoe et al., 2013)
SEI-1 GGTGATATTGGTGTAGG 25 5 CFRI 36 1 (Omoe et al., 2013)
SEI-2 ATCCATATTCTTTGCCTTTACC 25 5 CFRI 36 1 (Omoe et al., 2013)

用于检测非金黄色葡萄球菌（NASM）和哺乳动物球菌中与产肠毒素、甲氧西林抗性和消毒剂耐受性相关的基因的PCR条件：

**PCR所用引物和试剂：**
- GoTaq Hot Start Polymerase试剂盒（Promega Corporation，美国马迪逊）

**PCR反应体系：**
- 1X PCR缓冲液
- 每种脱氧核苷三磷酸（dNTP）200μM
- MgCl2
- Taq聚合酶1U
- DNA 1μL
- 每种引物10pmol
- Milli-Q超纯水，总量25μL

**PCR仪器：** Bio-Rad C-1000热循环仪（BioRad，美国赫拉克勒斯）

**PCR参数：**见表2

**凝胶电泳：** 使用0.5X TBE（45 mM Tris-borate）和SYBR（Safe DNA Gel Stain）配制的琼脂糖凝胶进行电泳分析

**问卷调查内容：**
在基于统计显著性的对应分析之前，对选定的奶牛场进行了关于管理方面的问卷调查，问题包括：
- 奶奶形式（手动挤奶/机械挤奶）
- 是否定期维护挤奶设备
- 是否按顺序挤奶（先挤患有乳腺炎的奶牛还是分开挤奶）
- ?挤奶人员是否使用一次性手套
- 是否用水清洗奶头
- 是否进行奶头预浸泡
- 是否干燥奶头
- 挤奶期间是否提供食物
- 挤奶后是否立即喂食奶牛
- 是否进行加州乳腺炎测试（CMT）
- 是否定期检测泌乳期奶牛的个体体细胞计数（SCC）
- 是否治疗亚临床乳腺炎

**数据分析：**
- 首先进行描述性统计，总结NASM菌种的分布、抗菌素耐药性谱型、毒力基因和耐药基因的存在情况。
- 排除数据缺失或无统计变异性的变量（例如，100%相同的回答）。
- 使用NASM菌种组作为因变量，进行单变量分析，分为染色菌株和非染色菌株。
- 通过卡方检验评估菌种组与毒力基因、抗菌素耐药基因和表型抗菌素耐药性之间的关联。
- 保留P ≤ 0.20的变量，作为多变量分析的候选对象。

**多变量分析：**
- 由于管理措施在牛群层面进行评估，来自同一农场多个分离株具有相同的管理信息，因此采用对应分析法作为探索性多变量方法，研究选定的管理变量、NASM菌种组和临床状态之间的整体分布模式和关系，不推断因果关系。
- 使用InfoStat 2020（Di Rienzo et al., 2020）进行多变量对应分析。

**结果：**
- 共分离出309株NASM菌株：
- 染色菌株占58.6%（n = 181）
- S. simulans占8.4%（n = 26）
- S. haemolyticus占8.1%（n = 25）
- S. epidermidis占4.5%（n = 14）
- S. xylosus占4.5%（n = 14）
- S. warneri占3.0%（n = 9）
- S. equorum占3.0%（n = 9）
- S. cohnii占2.3%（n = 7）
- S. saprophyticus占2.3%（n = 7）
- S. hyicus/agnetis占1.6%（n = 5）
- M. sciuri占1.3%（n = 4）
- S. pasteuri占0.6%（n = 2）
- S. succinus占0.3%（n = 1）
- S. auricularis占0.3%（n = 1）
- S. caprae占0.3%（n = 1）
- S. capitis占0.3%（n = 1）
- S. kloosii占0.3%（n = 1）
- S. arlettae占0.3%（n = 1）

- 其中167株（54%）来自SCC >200,000细胞/mL的奶牛样本；109株（35.3%）来自SCC <200,000细胞/mL的奶牛样本；33株（10.7%）来自患有临床乳腺炎的奶牛样本。
- NASM菌株在各州的分布如下：圣保罗州（34.6%）、圣卡塔琳娜州（29.8%）、帕拉州（15.8%）、帕拉伊巴州（12.6%）和戈亚斯州（7.1%）。

**抗菌素敏感性分析：**
- 最多NASM菌株对以下抗生素具有耐药性：苯唑西林（19.6%）、青霉素（18.2%）、克林霉素（13.0%）、妥布霉素（11.1%）、氯霉素（9.5%）、四环素（9.0%）、红霉素（8.0%）、头孢氧嗪（6.4%）和庆大霉素（5.2%）。
- 每种NASM菌株至少有一种抗生素的耐药株。由于S. succinus仅有一株分离株，因此无法得出该菌种的总体耐药性结论。

**结论：**
- 染色菌株占NASM菌株的绝大多数，其在多重耐药性（MDR）中的比例较高（28/41，68.3%）。
- 不同菌种的MDR比例如下：S. haemolyticus（16.0%）、S. epidermidis（28.6%）、S. warneri（22.2%）等。
- 红霉素耐药性在非染色菌株中显著高于染色菌株（OR = 4.99；95% CI: 2.20–11.30；P < 0.0001）。

**耐甲氧西林基因检测：** 309株NASM菌株中，4.9%携带mecA基因，无菌株携带mecC基因。在mecA阳性的分离株中，4株来自患有临床乳腺炎的奶牛，5株来自SCC（奶牛乳房细胞计数）较低的奶牛，6株来自SCC较高的奶牛。为了评估基因型和表型耐甲氧西林特性之间的关联，研究人员检测了mecA阳性分离株对氧西林和头孢克肟的敏感性。在8株携带mecA的表皮葡萄球菌（S. epidermidis）分离株中，3株对氧西林和头孢克肟均表现出表型耐药性，2株仅对氧西林耐药，3株对两种抗生素均敏感。在6株携带mecA的色 Norway 葡萄球菌（S. chromogenes）分离株中，1株对氧西林和头孢克肟均耐药，1株仅对氧西林耐药，4株对两种药物均敏感。唯一携带mecA的沃纳葡萄球菌（S. warneri）分离株对氧西林和头孢克肟均敏感。这些发现表明mecA的存在与表型耐甲氧西林特性存在部分一致性，因为一些mecA阳性分离株在测试条件下并未表现出耐药性。

关于对消毒剂的耐药性，qacAB基因在1.3%（n = 4）的NASM分离株中被检测到，qacC基因在3.9%（n = 12）的分离株中被检测到。在qacAB阳性的分离株中，2株来自临床乳腺炎病例，1株来自SCC较低的牛奶样本，1株来自SCC较高的牛奶样本。在qacC阳性的分离株中，2株来自临床乳腺炎病例，7株来自SCC较低的奶牛，3株来自SCC较高的奶牛。

关于NASM分离株中肠毒素基因的存在，研究人员调查了8种肠毒素基因，并将其在乳房健康状况中的分布总结在表5中。seb基因是最常检测到的（15.2%），其次是sea（6.5%）、see（4.9%）、seg（4.5%），seh和sein的频率较低（各1.6%）。sec基因仅在2株分离株中被检测到，sed基因在所有样本中均未发现。

总共24.3%（n = 75）的NASM分离株携带至少一种肠毒素基因。表6展示了NASM分离株中耐药性和毒力基因的分布情况。

毒力和耐药性基因的分布情况如下（按物种和计数表示）：

| 物种 | mecA | mecC | seb | sec | seg | seh | seiq | qacAB | qacC |
|--------------|--------|-------|-------|--------|--------|-------|--------|--------|
| S. simulans | | | | | | | | | |
| S. haemolyticus | | | | | | | | |
| S. epidermidis | | | | | | | | |
| S. xylosus | | | | | | | |
| S. warneri | | | | | | | |
| S. cohnii | | | | | | | |
| S. saprophyticus | | | | | | | |

分析显示，毒力和抗菌耐药性基因的分布与物种组之间存在统计学上的显著关联。与非色 Norway 葡萄球菌物种相比，色 Norway 葡萄球菌物种更有可能携带mecA（OR = 4.16；95% CI: 1.36–12.68）、sec（OR = 6.14；95% CI: 1.83–20.54）、seg（OR = 9.26；95% CI: 2.33–36.72）和qacC（OR = 16.92；95% CI: 3.04–94.25）基因。相比之下，seb基因在非色 Norway 葡萄球菌物种中更为常见（OR = 2.64；95% CI: 1.30–5.35）。所有这些关联均具有统计学意义（χ2检验，P < 0.05）。然而，由于色 Norway 葡萄球菌在本研究中占NASM分离株的多数，因此这些关联需要谨慎解释。不同物种之间的分布不均可能导致某些基因分布与物种组之间的关联部分反映了物种频率的差异，而非真正的生物学差异。未来研究应包括更多种类和数量更均衡的分离株，以澄清这些关系。

在对应分析之前，值得注意的是，色 Norway 葡萄球菌是本研究中分离频率最高的物种，占所有NASM分离株的58.6%。这一显著优势直接影响多元分析中的数据分布，因此在解释对应关系时应予以考虑。对应分析显示，色 Norway 葡萄球菌和非色 Norway 葡萄球菌与某些奶牛养殖和管理实践（如图3所示）密切相关。然而，这并不能反映真正的生物学关联。

**讨论**
在本研究中，最常分离出的物种是色 Norway 葡萄球菌、S. simulans、S. haemolyticus、S. epidermidis、S. xylosus、S. warneri 和 S. equorum。De Buck等人（2021）的综述指出，从临床和亚临床乳腺炎奶牛中分离出的最常见NASM物种因国家而异。在比利时，研究报道的常见物种为S. equorum（34%）、S. haemolyticus（13%）和S. epidermidis（9%）或S. chromogenes（41%）、S. sciuri（13%）和S. cohnii（11%）；在美国，最常见的物种是S. chromogenes（48%）、S. haemolyticus（18%）和S. simulans（7%）；在中国，最常见的物种是S. arlettae、S. sciuri和S. xylosus（各12%）；在阿根廷，最常见的物种是S. chromogenes（47%）、S. haemolyticus（32%）和S. warneri（7%）。本研究的结果与其他国家和地区的研究结果一致。在巴西，de Freitas Guimar?es等人（2013）分析了圣保罗10个农场中1318份亚临床乳腺炎奶牛的牛奶样本，分离出128株NASM，其中S. warneri（31.3%）、S. epidermidis（14.8%）和S. hyicus（12.5%）最为常见。尽管仅考虑来自圣保罗的107株NASM分离株（图1），这些结果仍与本研究有所不同。Tomazi等人（2015）使用同样来自圣保罗的样本，分析了21个奶牛群中1440份乳房内感染的牛奶样本，发现S. chromogenes（74%）、S. saprophyticus（5.5%）和S. haemolyticus（4.6%）是最常见的物种，这与本研究的结果更为吻合。值得注意的是，这两项研究均使用了基于PCR的方法进行物种鉴定，而本研究则使用了MALDI-ToF MS技术。我们的研究中，我们将MALDI-TOF得分阈值设为≥2.0来识别NASM物种，这可能限制了检测的灵敏度。Cameron等人（2017）指出，使用扩展的自定义库和更低的得分阈值可以提高鉴定凝固酶阴性葡萄球菌的准确性，从而增加多样物种的检测范围。未来研究应结合扩展的光谱库和优化的得分阈值，以提高NASM鉴定的准确性和覆盖率。

值得注意的是，色 Norway 葡萄球菌占本研究中NASM分离株的58.6%，这支持了其作为多数奶牛群中的主导物种的地位（Taponen等人，2007；Persson Waller等人，2011；Condas等人，2017；Valckenier等人，2020）。这种优势可能归因于其对牛乳房更好的适应性，使其能够持续存在并成为乳房内感染的主要来源（Tomazi等人，2015）。NASM通常与亚临床乳腺炎相关，较少与临床病例相关。多项研究表明它们参与了乳房内感染，并对奶池乳中的SCC升高有贡献（Naushad等人，2016；Valckenier等人，2020）。不同NASM物种对SCC的影响各不相同。例如，在一项加拿大研究中，S. chromogenes是与高SCC最相关的物种（De Buck等人，2021）。

在本研究中，62%的高SCC样本中检测到了S. chromogenes，这进一步强调了其不仅是最常分离出的NASM物种之一，也是影响牛奶质量潜在因素的重要性。研究结果表明，S. chromogenes的流行病学重要性不仅体现在其分离频率上，还体现在其持续存在及其与SCC升高的关联，这些因素可能对奶牛群的生产力和牛奶质量产生负面影响。因此，针对该物种的控制策略可能有助于改善乳房健康和牛奶质量。

对应分析揭示了管理实践与NASM群体之间的潜在模式；然而，由于S. chromogenes在本研究中的高频率影响了其与其他管理变量的接近程度，所以对其位置的解读需谨慎。先前的研究也指出S. chromogenes是牛乳腺中的常见且持续存在的定植菌（Piessens等人，2011；Vanderhaeghen等人，2014）。相比之下，非色 Norway 葡萄球菌的较低流行率使其与卫生条件较差的实践相关，如使用桶式挤奶方式或缺乏乳房预浸泡（Piessens等人，2011；De Buck等人，2021）。这些发现表明，群体层面的管理措施可能会选择性地影响NASM物种的组成。这对于乳制品行业尤为重要，因为改善挤奶卫生和管理协议不仅有助于减少NASM的发生，还能改变与更高环境暴露相关的物种生态平衡。

本研究的局限性包括农场在规模和管理标准化程度上的差异，因为样本选取具有偶然性。因此，建立S. chromogenes和非色 Norway 葡萄球菌菌株与特定管理实践之间的稳定关系具有挑战性。从实际角度来看，这些结果强调NASM的流行病学不仅取决于细菌特性，还受到可调节管理因素的强烈影响。有针对性的群体干预可能有助于提高牛奶质量、减少乳房内感染的持续性和限制抗菌素耐药性的传播。

NASM的抗菌耐药性特征与兽医实践中抗生素的频繁使用密切相关，尤其是青霉素和四环素（Dorneles等人，2019）。美国食品药品监督管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMA）的监测报告显示，青霉素、四环素和磺胺类药物是美国和欧洲食品生产动物中最常用的抗生素类别（FDA，2022；Dorneles等人，2019；EMA，2023）。在本研究中，24.9%的NASM分离株对青霉素耐药，26.9%对氧西林耐药，8.7%对头孢克肟耐药。Klibi等人（2018）报告称，在68株来自乳腺炎奶牛的NASM分离株中，29.4%对氧西林和/或头孢克肟耐药。除S. succinus外，每种NASM物种至少有一种分离株对至少一种抗生素耐药。色 Norway 葡萄球菌是最常见的多重耐药（MDR）物种，其次是S. haemolyticus和S. epidermidis。其他研究也报告了MDR NASM的存在（Sampimon等人，2011；Nobrega等人，2018；Cheng等人，2019；Dorneles等人，2019；Phophi等人，2019）。

在本研究中，15株NASM分离株携带mecA基因，分别来自S. epidermidis（n = 8）、S. chromogenes（n = 6）和S. warneri（n = 1）。在巴西，Silva等人（2014）在圣保罗128株亚临床乳腺炎奶牛的样本中检测到了mecA基因（26%），包括S. epidermidis（n = 7）、S. chromogenes（n = 7）、S. warneri（n = 6）、S. hyicus（n = 5）和S. simulans（n = 1）。与本研究相比，Silva等人报告的mecA阳性分离株频率更高，且携带mecA的物种多样性更广。此外，一项研究指出mRNA（MRNAS）既是毒力因子的储存库，也是对其他类别抗生素具有抗性的基因的储存库（De Buck等人，2021年），鉴于这些基因可能通过水平基因转移传播给其他细菌物种，这一点尤其值得关注（Smith和Andam，2021年）。虽然mecA基因编码PBP2a，从而降低了细菌对β-内酰胺类抗生素的亲和力，但一些研究报道携带mecA的NASM表现出不一致的表型耐药性。在本研究中也观察到了这种现象，其中一部分mecA阳性的分离株在表型上仍然对苯唑西林和头孢氧噻肟敏感。这种不一致性在NASM中已有充分记录，可能归因于多种因素，包括PBP2a表达的异质性、mecA转录的低调或可诱导性以及基因表达机制的物种特异性差异（Paterson等人，2014年；Schnitt等人，2021年）。综合这些观察结果可知，NASM中mecA的存在并不总是与常规敏感性检测所发现的表型耐药性相对应。这突显了在评估NASM的耐药性时结合分子生物学和表型学方法的重要性，特别是在流行病学研究和监测项目中。

本研究的发现不仅引发了关于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的担忧，还关注到了耐甲氧西林的非金黄色葡萄球菌（MRNAS）的日益增加。正如本研究所示，这类细菌由于携带mecA基因而表现出对β-内酰胺类抗生素的耐药性。该基因编码青霉素结合蛋白2a（PBP2a），从而降低了β-内酰胺类药物的效果（Roy等人，2024年）。尽管检测到甲氧西林耐药性决定因子可能会引起担忧，但目前尚无充分证据表明在乳制品相关NASM中观察到的相对较低的耐药性频率会转化为对动物或公众健康的重大风险。

另一个相关方面是微生物对乳品环境中使用的消毒剂的耐受性。过氧乙酸、次氯酸钠和季铵化合物（QACs）等消毒剂被广泛用于乳房消毒和挤奶设备清洁。在本研究中，一小部分NASM分离株携带qacAB基因，尤其是qacC基因。这些基因编码外排膜蛋白，可降低细菌对基于QAC的消毒剂的敏感性（Czarnecka等人，2025年）。类似的决定因子也在其他乳腺炎相关葡萄球菌中被报道，包括从乳品环境中分离出的金黄色葡萄球菌和NASM（Bjorland等人，2001年；Bjorland等人，2005年；Ergun等人，2017年），这表明这些基因可能存在于乳房皮肤和农场表面常见的细菌中。然而，本研究中观察到的频率较低，携带qac基因并不一定意味着常规卫生措施失效。目前尚无证据表明这些决定因子的存在本身会增加乳房内感染的风险或直接威胁食品安全。尽管如此，它们的存在仍强调了持续监测乳品相关细菌对消毒剂敏感性的必要性，因为消毒剂的使用可能促进耐药菌株在农场环境中的持续存在和传播。

此外，大多数与葡萄球菌肠道毒素产生相关的基因也在NASM分离株中被检测到，除了sed基因。葡萄球菌肠道毒素（SEs）是热稳定的细胞外蛋白，即使在细菌死亡后仍能保持活性（Bellio等人，2019年）。经典的SEs包括SEA、SEB、SEC、SED和SEE，约占金黄色葡萄球菌相关食物中毒病例的95%（Cai等人，2021年）。然而，NASM也能产生SEs，并且越来越多地被认为是导致食源性疾病的潜在因素（da Silva Candido等人，2020年）。目前已描述了六种经典SEs（SEA–SEE、SEG）和21种类似SE的毒素（例如SEH至SEZ、SE27、SE28）（Chieffi等人，2020年）。先前的研究报道NASM中肠道毒素基因的频率较高。De Freitas Guimar?es等人（2013年）发现66%的分离株携带至少一种此类基因，主要是sea、seb和sec，其中sea在S. warneri和S. hyicus中尤为普遍。同样，Mello等人（2016年）发现41.9%的CoNS分离株携带肠道毒素基因，最常见的为sea、sec和seh，尤其是在S. chromogenes和S. epidermidis中。相比之下，本研究中只有24.3%的NASM分离株携带肠道毒素基因，其中seb最为常见，其次是sea、see、seg和seh。

除了这些频率和基因谱型的差异外，本研究还描述了肠道毒素基因在不同乳房健康状态（临床乳腺炎、高乳脂细胞计数（SCC）和低SCC）中的分布情况，为理解NASM作为这些毒力因子储存库的流行病学作用提供了更多背景信息。尽管肠道毒素基因的存在并不一定意味着毒素的表达或致病性，但在从牛奶样本中分离出的NASM中检测到这些基因仍然值得关注。来自低SCC和高SCC乳牛的牛奶最终会被混合到储奶罐中，这可能促进这些菌株在乳品链中的传播。虽然本研究没有评估细菌计数或毒素生产情况，但肠道毒素基因的检测突显了一个潜在的食品安全问题，需要进一步研究。

结论

本研究通过整合物种水平鉴定、抗菌素耐药性和毒力谱分析以及牧场管理数据，提供了关于巴西奶牛群中NASM生态学的新颖流行病学证据。除了确认S. chromogenes的主要地位外，我们还发现了物种分布的区域性差异，表明当地生产系统和环境条件可能影响NASM的动态。本研究的一个关键贡献是发现了牧场管理措施与NASM发生之间的关联。这些发现表明，与管理相关的因素可能在维持NASM在奶牛群中的持续存在方面起着重要作用。这对乳品行业具有实际意义，因为改善挤奶卫生、合理使用抗菌剂和加强牧场级管理可能有助于降低NASM的频率并提高牛奶质量。

尽管耐药性和毒力基因的频率处于中等水平，但在从适合人类消费的牛奶中分离出的菌株中发现这些基因确实引发了食品安全方面的潜在担忧。鉴于NASM作为耐药性和毒力决定因子的储存库的作用，这些发现可能具有普遍意义，有助于更全面地理解全球乳品生产系统中的NASM现象。总体而言，这种综合方法推进了当前对NASM流行病学的理解，并为改善乳房健康管理、减缓抗菌素耐药性的传播以及保障牛奶质量提供了有益的见解。