药物诱导的铜死亡定义塞来昔布通过HSP90-RBX1轴治疗椎间盘退变的 therapeutic window

《Advanced Science》：Drug-Induced Cuproptosis Defines the Therapeutic Window of Celecoxib in Intervertebral Disc Degeneration via the HSP90-RBX1 Axis

背景：慢性腰痛是一个重大的全球健康负担，椎间盘退变（IDD）被确定为其主要的病理原因。IDD的发病机制是一个动态且复杂的过程，其特征是炎症、细胞外基质（ECM）失调和细胞凋亡。白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）等促炎介质的产生会破坏髓核细胞内的基质稳态。尽管选择性环氧合酶-2（COX-2）抑制剂塞来昔布是治疗IDD相关疼痛的一线药物，但其对椎间盘组织的特异性影响仍知之甚少，且文献报道存在相互矛盾的结果，表明其作用可能比单纯的COX-2抑制更为复杂。目的：本研究旨在阐明高浓度塞来昔布从保护转变为有害作用的分子机制。方法：研究人员利用IL-1β刺激的髓核细胞（NP cells）和大鼠IDD模型，结合定量蛋白质组学分析、免疫共沉淀（Co-IP）、泛素化测定及体内外功能挽救实验，系统评估了不同浓度塞来昔布的作用。结果：研究发现塞来昔布对NP细胞具有浓度依赖性的双相效应。低剂量（≤20 μM）塞来昔布抑制炎症并保护ECM；而高剂量（>20 μM）塞来昔布则激活了一种先前未被识别的热休克蛋白90（HSP90）/环指蛋白1（RBX1）/铜死亡（cuproptosis）轴，导致铜积累、线粒体应激和ECM降解。机制上，升高的塞来昔布诱导HSP90上调，通过减少K48连接的泛素化来稳定RBX1。积累的RBX1促进ATP酶铜转运蛋白β（ATP7B）及其调节因子含铜代谢结构域1（COMMD1）的降解，从而引发铜死亡。体内实验中，药理学抑制HSP90或铜死亡可有效逆转高剂量塞来昔布的不良影响。结论：这些发现定义了塞来昔布治疗IDD的严格therapeutic window，并揭示了一种由HSP90/RBX1介导的新型铜死亡通路，该通路介导了其双相效应。

论文解读：药物诱导的铜死亡定义塞来昔布通过HSP90-RBX1轴治疗椎间盘退变的Therapeutic Window

研究背景与立题依据

慢性腰痛是全球主要的健康负担，而椎间盘退变（Intervertebral Disc Degeneration, IDD）是其核心病理基础。IDD的病理过程涉及炎症、细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）失调及细胞凋亡，其中白细胞介素-1β（Interleukin-1β, IL-1β）等促炎因子通过破坏髓核（Nucleus Pulposus, NP）细胞的基质稳态加剧病程。临床上，选择性环氧合酶-2（Cyclooxygenase-2, COX-2）抑制剂塞来昔布是治疗IDD相关疼痛的一线药物，但其对椎间盘组织的具体生物学效应长期缺乏系统性研究，且现有文献存在矛盾结论。这提示塞来昔布的作用可能超越传统的COX-2抑制，涉及更复杂的浓度依赖性双相效应。与此同时，作为一种新兴的铜依赖性细胞死亡形式——铜死亡（cuproptosis），已在多种退行性疾病中被证实参与病理进程，但其是否受非甾体抗炎药（Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drugs, NSAIDs）调控尚属未知。基于此，研究人员开展了此项研究，旨在阐明塞来昔布治疗IDD的精确浓度阈值及其潜在的分子毒理机制，相关成果发表于《Advanced Science》。

主要关键技术方法

本研究综合运用了体内外模型与多组学技术。研究人员构建了IL-1β诱导的NP细胞退变模型及大鼠尾针穿刺IDD模型，通过定量蛋白质组学筛选差异表达蛋白。利用免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation, Co-IP）和体内泛素化检测解析蛋白质相互作用及修饰。通过放线菌酮（Cycloheximide, CHX）追踪实验评估蛋白稳定性，并结合环指蛋白1（Ring-Box Protein 1, RBX1）的泛素化位点突变体进行功能验证。此外，还采用了酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）、Western blot（Wb）、免疫荧光（Immunofluorescence, IF）及免疫组化（Immunohistochemistry, IHC）等技术检测分子表达与表型变化。临床样本来源于同济大学附属东方医院脊柱外科手术患者的椎间盘组织。

研究结果

2.1 塞来昔布在IL-1β诱导的NP细胞和大鼠IDD模型中表现出浓度依赖性的治疗效果

研究人员首先评估了塞来昔布对NP细胞活力的影响，发现其在50 μM以内无明显细胞毒性，但超过该阈值后细胞活力显著下降。在IL-1β刺激的NP细胞中，10至20 μM的塞来昔布显著抑制了肿瘤坏死因子α（Tumor Necrosis Factor-alpha, TNF-α）和IL-6的分泌，并通过Western blot、定量聚合酶链式反应（quantitative Polymerase Chain Reaction, qPCR）和IF证实了其能有效降低含血小板反应蛋白基序的解整合素金属蛋白酶4（A Disintegrin and Metalloproteinase with Thrombospondin Motifs 4, ADAMTS4）的表达并增强II型胶原（Type II Collagen, COL2）的合成，且20 μM效果最佳。然而，当浓度升至30至50 μM时，上述治疗作用逐渐减弱。体内大鼠模型进一步验证了这一双相效应：20 μM塞来昔布能最有效地维持椎间盘高度指数（Disc Height Index, DHI）和磁共振成像（Magnetic Resonance Imaging, MRI）指数，改善组织学评分及COL2和聚集蛋白聚糖（Aggrecan, ACAN）的表达；而高浓度组（30–50 μM）的保护作用显著丧失，与IDD模型组无显著差异。

2.2 高浓度塞来昔布疗效减弱的机制：基于定量蛋白质组学的铜死亡通路激活

为探究高浓度塞来昔布失效的机制，研究人员进行了定量蛋白质组学分析。结果显示，50 μM塞来昔布特异性激活了铜死亡通路，导致热休克蛋白90（Heat Shock Protein 90, HSP90）、RBX1及泛素特异性肽酶15（Ubiquitin Specific Peptidase 15, USP15）显著上调，而铜稳态调节因子COMMD1和ATP7B下调。基因本体（Gene Ontology, GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）富集分析提示其与“钼酸盐离子转运”和“蛋白酶体降解”相关。随后的验证实验表明，高浓度塞来昔布抑制了线粒体自噬，增加了细胞内谷胱甘肽（Glutathione, GSH）与氧化型谷胱甘肽（Glutathione Disulfide, GSSG）的比率、Cu²⁺水平及丙二醛（Malondialdehyde, MDA）含量，而这些铜死亡表型可被铜死亡特异性抑制剂四硫钼酸盐（Tetrathiomolybdate, TTM）有效逆转。

2.3 HSP90-RBX1-COMMD1/ATP7B-铜死亡轴的机制解析

研究人员在临床样本中发现，重度退变NP组织中HSP90和RBX1的蛋白表达显著高于轻度退变组织。功能获得与缺失实验表明，过表达HSP90或RBX1可加剧ECM代谢紊乱并诱导铜死亡表型，而TTM处理能逆转这些效应。机制上，Co-IP证实HSP90与RBX1存在直接物理相互作用。CHX追踪实验和泛素化检测显示，HSP90通过抑制RBX1的泛素化及随后的蛋白酶体降解来增强RBX1蛋白的稳定性。下游靶标研究中，Co-IP发现RBX1可与COMMD1结合，并通过K48连接的泛素化促进COMMD1和ATP7B的降解。值得注意的是，COMMD1能通过竞争性结合ATP7B来保护其免受RBX1介导的降解。此外，USP15被鉴定为RBX1的去泛素化酶，HSP90与USP15形成互惠增强回路，共同维持RBX1的高水平稳定。

2.4 体内抑制HSP90或铜死亡可逆转高浓度塞来昔布加剧的IDD

在体内挽救实验中，研究人员将大鼠分为对照组、IDD组、50 μM塞来昔布组、50 μM塞来昔布+TTM组、50 μM塞来昔布+sh-HSP90组及50 μM塞来昔布+sh-HSP90+Elesclomol组。影像学评估显示，抑制HSP90或铜死亡能够挽救高浓度塞来昔布的负面效应。具体而言，TTM和sh-HSP90组的DHI和MRI指数较单纯高浓度塞来昔布组显著改善，组织学切片显示其椎间盘结构得到明显保护，NP区凝胶状ECM保留更多，AF结构更完整，且COL2和ACAN的荧光信号显著增强。这证实了高浓度塞来昔布通过激活HSP90/铜死亡通路加剧IDD，而靶向该通路可恢复其治疗潜力。

讨论与结论

本研究通过系统的体内外实验，阐明了塞来昔布在治疗IDD中前所未有的浓度依赖性双相效应及其狭窄的therapeutic window。研究确定了20 μM为关键阈值：在此浓度下，塞来昔布通过抑制COX-2发挥抗炎和保护ECM的作用；一旦超过此阈值，其保护作用发生逆转，通过激活HSP90/RBX1/COMMD1-ATP7B轴引发铜死亡，表现为铜积累、线粒体自噬抑制和脂质过氧化，从而加剧退变。

讨论部分指出，本研究首次揭示了超治疗浓度的塞来昔布可直接触发NP细胞的铜死亡，拓展了铜死亡在肌肉骨骼退行性疾病中的概念；明确了HSP90是将塞来昔布从治疗药物转化为促退变因子的关键分子开关；并详细解析了RBX1通过介导ATP7B的K48连接泛素化驱动椎间盘组织铜死亡的机制。尽管研究主要基于大鼠NP细胞模型，且实验药物浓度与临床实际暴露量的关系需谨慎解读，但该发现对临床实践具有重要启示：在使用NSAIDs治疗慢性腰痛时，应警惕局部药物浓度过高可能通过HSP90-RBX1-铜死亡轴加速组织退变的风险，强调了将药物浓度维持在10–20 μM治疗窗口内的重要性，并为开发基于水凝胶的局部缓释给药系统提供了关键的药理学基准。