含有乳植杆菌（Lactiplantibacillus Plantarum AR113）的共生微生物胶囊通过乙酸介导的方式调节肠道-胰腺轴，从而预防急性胰腺炎

《Journal of Functional Foods》：Synbiotic microcapsules delivering Lactiplantibacillus Plantarum AR113 protect against acute pancreatitis via acetate-mediated modulation of the gut-pancreas axis

　　魏晓|杨付|秦文飞|李泽芸|艾连忠|王广强|曾月
上海工程技术大学食品微生物学上海工程研究中心健康科学与工程学院，中国上海200093

摘要
急性胰腺炎（AP）迫切需要新的治疗策略。本文开发了一种麦芽糖-海藻酸盐合生菌微胶囊（AM-AR113），用于肠道输送植物乳杆菌AR113，并评估了其在AP中的保护作用。AM-AR113在储存和模拟胃肠道传输过程中提高了细菌的存活率。在AP小鼠中，AM-AR113减轻了胰腺和回肠的损伤，并降低了血清中的IL-6、TNF-α和IL-1β水平。它还改善了肠道微生物群的失调，并显著增加了粪便中的乙酸含量。通过使用乙酸激酶缺失突变体（AR113Δ0187），我们发现乙酸生成的减少伴随着保护作用的减弱，而外源性乙酸可以重现主要的保护效果。乙酸恢复了与肠道屏障相关的标志物，降低了血清中的DAO、LPS和FITC-葡聚糖水平，并与胰腺MCP-1的减少、M1相关炎症标志物的降低、Cd206表达的增加以及Hdac3表达的降低相关。这些发现表明，AM-AR113至少部分通过乙酸相关的肠道-胰腺轴调节来保护胰腺免受AP的影响。

1. 引言
急性胰腺炎（AP）是一种常见的胃肠道急症，其全球发病率正在上升。大约15%到20%的患者会出现持续性器官衰竭或感染性坏死，导致高死亡率（Danpanichkul等，2025；Iannuzzi等，2022）。目前的管理主要依赖于支持性治疗，包括早期液体复苏、镇痛和营养支持，因为还没有基于机制的药物治疗方法（Boxhoorn, Voermans, van Santvoort, & Besselink, 2021; Danpanichkul等，2025）。最近的临床和实验证据表明，肠道和胰腺之间的病理相互作用显著促进了AP的进展（Ammer-Herrmenau等，2024；Trikudanathan, Yazici, Evans Phillips, & Forsmark, 2024；Zhang等，2022）。具体来说，肠道屏障功能障碍、微生物移位和肠道菌群失调，加上微生物群衍生物的丢失，会引发全身性炎症，并与疾病严重程度密切相关。益生菌因其促进健康的作用而越来越受到重视，主要通过维持肠道微生物平衡、加强上皮屏障完整性、调节免疫反应和影响微生物代谢产物的产生（Muroya等，2025；Porwal & Das, 2024）。在AP的背景下，益生菌干预可能有助于增强肠道屏障并限制细菌移位。动物研究的证据表明，某些益生菌菌株可以减轻胰腺损伤、恢复紧密连接并减少感染并发症（Li等，2024；Qin, Wang, & Xia, 2024）。然而，口服益生菌的治疗潜力受到恶劣胃肠道环境的严重制约，因为在胃肠道中，胃酸和胆盐的暴露会显著降低细菌的存活率（Han等，2021；Wang等，2022）。相比之下，含有益生元的合生菌微胶囊可以在加工、储存和胃肠道传输过程中提高细菌的存活率，并支持口服后的肠道持久性（Zhu, Ji, & Shen, 2025）。
植物乳杆菌是一种广泛认可且安全的益生菌菌株。该菌株产生的短链脂肪酸（SCFAs）是参与屏障维持和免疫调节的重要微生物代谢产物（Yilmaz等，2022；Zhang等，2025）。其中，乙酸是肠道中最丰富的SCFAs之一，据报道在不同疾病情况下具有抗炎和屏障保护作用（Deleu等，2023；Lei等，2021）。最近研究发现，从传统发酵食品（泡菜）中分离出的植物乳杆菌AR113具有强大的黏蛋白结合能力和肠道定植能力，表明它是靶向肠道和胰腺之间病理相互作用的有吸引力的候选菌株（Lin, Xia, & Yang, 2020；Qin等，2022；Shao等，2025；Xia, Gong, & Lin, 2024）。然而，植物乳杆菌AR113是否可以通过基于微胶囊的递送策略缓解AP，以及哪些效应代谢物介导其潜在益处，目前尚不清楚。
在这项研究中，我们开发了一种麦芽糖-海藻酸盐微胶囊系统，有效将植物乳杆菌AR113输送到肠道，并在严重的AP小鼠模型中评估了其治疗效果。然后，我们研究了AR113微胶囊对肠道微生物组成和粪便SCFAs谱的影响，特别关注乙酸的生成。通过构建乙酸激酶缺失突变体（AR113Δ0187），我们检验了乙酸生成是否对AR113的保护作用至关重要。此外，我们探讨了外源性乙酸的潜在机制，特别是其在修复肠道紧密连接屏障和调节胰腺巨噬细胞M1极化中的作用。我们的发现提供了一个新的机制理解，说明如何利用工程化的益生菌递送系统通过靶向肠道和胰腺之间的关键链接来减轻全身性炎症。

2. 材料与方法
2.1. 动物和实验设计
从上海SLAC实验动物有限公司购买了特定无病原体级别的C57BL/6雄性小鼠（6-8周龄），并在上海通用医院的无特定病原体条件下饲养。所有对小鼠进行的操作均获得了上海通用医院动物伦理委员会的批准（2024AW033）。样本量是根据先前使用类似caerulein诱发的急性胰腺炎模型的研究以及我们对该模型的经验选择的（Qi-Xiang等，2022）。
2.1.1. 实验1
小鼠被随机分配到五个组（n = 6）：对照组、AP组、AP + AM组、AP + AR113组和AP + AM-AR113组。小鼠每天口服给予空微胶囊（200 μL）、纯AR113（200 μL，2 × 10^9 CFU）或AM-AR113微胶囊（200 μL，2 × 10^9 CFU）7天。通过腹腔注射caerulein（50 μg/kg；MedChemExpress，中国）每小时一次，共10次来诱导AP，如先前所述（Qi-Xiang等，2022）。最后一次注射后24小时，对小鼠进行安乐死。收集粪便、血清、胰腺和回肠组织。样本快速冷冻后储存在-80°C，或固定在4%甲醛中用于组织病理学评估、酶活性测定和细胞因子分析。
2.1.2. 实验2
我们在实验室中生成了一种乙酸激酶（0187）敲除菌株（AR113Δ0187），如先前所述（Huang, Song, & Yang, 2019）。简要来说，通过重叠PCR扩增0187的上下游同源臂及其相应的gRNA片段，然后将其克隆到缺失载体中以生成敲除质粒。然后将重组质粒引入AR113感受态细胞，并在含有抗生素的平板上筛选候选突变体。通过位点特异性PCR和Sanger测序验证候选克隆。在0187位点，野生型菌株的预期扩增子大小为3222 bp，AR113Δ0187突变体为2034 bp，与1188 bp的目标区域缺失一致。小鼠被随机分配到四个组（n = 6）：对照组、AP组、AP + AM-AR113Δ0187组和AP + AM-AR113组。小鼠每天口服给予微胶囊化的突变体或野生型菌株7天（200 μL，2 × 10^9 CFU），然后诱导AP。通过靶向代谢组学定量粪便中的SCFAs，使用胰腺和回肠组织进行组织病理学和细胞因子分析。
2.1.3. 实验3
小鼠被随机分配到三个组（n = 6）：对照组、AP组和AP + 乙酸组。将乙酸（B24664；Aladdin，中国）溶解在无菌生理盐水中，以200 mg/kg的剂量通过胃内给药（Pan等，2019）。AP + 乙酸组在caerulein注射期间给予乙酸，而对照组和AP组则给予相同体积的生理盐水。 ??された回肠组织用于Claudin-1、ZO-1和Mucin-2的免疫荧光染色。胰腺组织用于免疫荧光双染色（F4/80和iNOS）和Western blot分析，以评估巨噬细胞浸润和M1极化。外源性乙酸实验旨在测试乙酸作为候选关键效应代谢物是否可以重现AP进展过程中的主要保护作用。
AM-AR113干预实验、AR113Δ0187突变体实验和乙酸补充实验分别作为独立的动物队列进行。
2.2. 植物乳杆菌AR113的活化及生长曲线的测定
将植物乳杆菌AR113的冻干库存划线在MRS琼脂上，并在37°C下厌氧培养12至24小时。将单个菌落接种到MRS肉汤中并在37°C下培养以制备种子培养物。将种子培养物在新鲜MRS中传代并使用分光光度计（DU 800，Beckman Coulter，美国）调节至OD600 = 1.0。对于生长曲线测定，在96孔板的每个孔中加入200 μL含碳水化合物的MRS，并以2%（v/v）的浓度接种标准化培养物。每个条件重复三次，无细菌的孔作为空白对照。培养物在37°C下培养24小时，每2小时记录一次OD600。使用GraphPad Prism 9.0（GraphPad Software，美国圣地亚哥）绘制生长曲线。
2.3. 海藻酸钠-麦芽糖微胶囊的制备及包裹效率的计算
将海藻酸钠（2.5% w/v，A602116；Sangon Biotech，中国）和麦芽糖（3% w/v，A363021；Sangon Biotech，中国）溶解在室温下的无菌水中，按1:1体积比混合得到海藻酸钠-麦芽糖预混液。加入植物乳杆菌AR113悬浮液（9至10 log10 CFU/mL），并调整最终体积至50 mL并轻轻混合。该混合物通过内径约300 μm的注射针头注入轻轻搅拌的0.1 M CaCl2溶液（A501330；Sangon Biotech，中国）中，流速约为10 mL/min。珠粒固化30分钟，用无菌生理盐水洗涤三次以去除残留的CaCl2和游离细胞，然后收集用于进一步使用。微胶囊要么储存在4°C以评估储存稳定性并进行模拟胃肠道耐受性测试，要么在-80°C冷冻24小时并冻干以进行表征。未包裹的AR113悬浮液用作对照。通过比较将微胶囊溶解在10%（w/v）柠檬酸溶液后回收的活细菌计数与用于包裹的初始活细菌计数来确定包裹效率，并以百分比表示。
2.4. 微胶囊的形态学表征
使用徕卡显微镜（Leica，德国）在50×和100×放大倍数下观察微胶囊的整体形状和表面形态。对于扫描电子显微镜，将微胶囊冷冻在-80°C并冻干。干燥的微胶囊固定在铝制探头上，镀金后使用场发射扫描电子显微镜（GeminiSEM 300，ZEISS，德国）进行成像。
2.5. 微胶囊的珠粒大小分布
使用Leica显微镜在50×放大倍数下观察新鲜制备的AM-AR113微胶囊。使用ImageJ软件在标尺校准后测量珠粒直径。每批至少随机分析50个珠粒，来自三个独立制备。
2.6. 微胶囊的机械稳定性分析
使用配备5 mm圆柱形探头的TA-XTplus质地分析仪评估新鲜制备的AM-AR113微胶囊的机械稳定性。预测试和测试后的速度分别设置为0.5 mm/s，触发力为5 g。样品在25°C下进行两次连续压缩循环，压缩幅度为其原始高度的40%。每种样品类型至少进行五次独立测量。
2.7. 长期储存和模拟胃肠道传输过程中益生菌的存活性评估
为了评估储存稳定性，将AM-AR113微胶囊和纯AR113悬浮液储存在4°C下，并在第7天、第14天和第30天测定活细菌计数。将微胶囊溶解在10%（w/v）柠檬酸溶液中以释放包裹的细胞。悬浮液顺序稀释后接种在MRS琼脂板上。平板在厌氧条件下培养48小时，结果表示为log10 CFU/mL。
为了模拟胃肠道耐受性，将微胶囊悬浮液（1 mL）与预先加热的模拟胃液（SGF；R24025，Aladdin，中国）（9 mL）混合并在37°C下摇晃培养100 rpm。在0分钟、30分钟、60分钟和120分钟时收集样本。在每个时间点，将微胶囊溶解在10%柠檬酸溶液中，并如上所述通过计数法测定活细菌数。在120分钟的SGF暴露后，通过轻轻离心收集剩余的微胶囊，用无菌生理盐水洗涤一次，然后重新悬浮在预先加热的模拟肠液（SIF；R22156，Aladdin，中国）（9 mL）中，并在37°C下摇晃培养100 rpm。然后在180分钟、240分钟、300分钟和360分钟时收集样本，并如上所述测定活细菌数。
2.8. AM-AR113的体外释放测定
为了评估AM-AR113的体外释放动力学，将1 mL微胶囊悬浮液与9 mL预先加热的模拟结肠液（SCF；MDD01301，Mimic Flui，中国）混合并在37°C下摇晃培养100 rpm。在0分钟、30分钟、60分钟和120分钟时收集样本。在上清液中收集活细菌数，并如上所述通过计数法测定。
2.9. 组织学检查
将胰腺和回肠组织在4%甲醛中固定48小时。固定后，组织用蒸馏水洗涤，通过分级乙醇脱水并用二甲苯透明处理，然后包埋在石蜡中。石蜡块切成4 μm厚度。各部分用 hematoxylin 和 eosin 染色，并在 Leica 光学显微镜（德国）下以 100× 和 200× 的放大倍数进行观察。胰腺的组织病理学变化根据 Schmidt 等人描述的评分系统进行评估（Schmidt et al., 1992）。回肠损伤使用 Chiu 等人提出的标准进行评估（Chiu, McArdle, Brown, Scott, & Gurd, 1970）。组织学评分由对组分配不知情的研究人员进行编码切片的评分。2.10 16S rRNA 基因测序和微生物群分析使用 FastPure DNA 试剂盒（MJYH，中国）根据制造商的说明从粪便样本中提取微生物基因组 DNA。使用引物 338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和 806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）在 T100 热循环仪（Bio-Rad，美国）上扩增细菌 16S rRNA 基因的 V3–V4 高变区（Liu et al., 2016）。扩增子在 2% 琼脂糖凝胶上验证，用 PCR Clean-up 试剂盒（YuHua，中国）纯化，并在 Qubit 4.0 测量仪（Thermo Fisher Scientific，美国）上定量。等摩尔的纯化扩增子被合并，并在 Illumina NextSeq 2000 平台上使用 Majorbio Bio-Pharm Technology 提供的标准工作流程进行双端测序。原始 FASTQ 文件使用内部 Perl 脚本去复用，用 fastp v0.19.6 进行质量过滤，并用 FLASH v1.2.7 合并（Chen, Zhou, Chen, & Gu, 2018; Mago? & Salzberg, 2011）。高质量的读段进一步使用 Majorbio Cloud Platform 上基于 ASV 的工作流程去噪以生成扩增子序列变异体（ASVs）。使用 RDP Classifier 和 SILVA 16S rRNA 数据库（版本 138）对代表性 ASVs 进行分类分配，置信阈值为 0.7。下游分析在 Majorbio Cloud Platform（https://cloud.majorbio.com）上进行。使用 Mothur v1.30.1 计算属水平的 α-多样性指数，而 β-多样性通过在 ASV 水平上使用 Bray–Curtis 距离的主坐标分析（PCoA）进行评估；组间差异使用 vegan R 包 v2.5–3 中的 PERMANOVA（999 次置换）进行测试。使用线性判别分析效应大小（LEfSe）识别差异丰富的分类群，并使用 PICRUSt2 从 16S 配文件推断功能潜力。此外，使用 Wilcoxon 积分序检验比较不同组之间 Lactiplantibacillus 的相对丰度，并以箱形图可视化。2.11 免疫荧光染色将石蜡包埋的胰腺和回肠组织切片在 60°C 下加热 1 小时，然后使用 Leica Autostainer XL（Leica，美国）进行脱蜡和重新水化。在柠檬酸缓冲液中（Sangon Biotech，中国）进行抗原回收。用 PBS 冲洗后，组织切片用疏水性阻隔笔（Biosharp，中国）圈出，并在室温下用免疫染色缓冲液（Sangon Biotech，中国）封闭 1 小时。然后切片在 4°C 下与针对 MUC2（A14659；Abclonal，中国）、ZO-1（A2601；Abclonal，中国）、Claudin-1（ab211737；Abcam，美国）和 F4/80（Proteintech，目录号 28463，中国）的一抗孵育过夜，这些一抗溶解在抗体稀释液中（Sangon Biotech，中国）。用 PBS 冲洗后，切片在室温下与适当的荧光标记二抗（Yeasen，中国）孵育 1 小时，再次用 PBS 冲洗，然后用 DAPI（Yeasen，中国）复染 10 分钟。使用 Leica荧光显微镜（Leica，美国）获取荧光图像。为了基于图像的免疫荧光染色量化，所有图像在分析前都被编码，并由对组分配不知情的研究人员进行量化。2.12 酶联免疫吸附测定使用 MultiSciences Biotech 的 ELISA 试剂盒根据制造商的协议测量血清中的二胺氧化酶（DAO）、脂多糖（LPS）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、IL-6 和单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）的水平。2.13 肠道通透性测定使用 FITC-右旋糖酐测定法如先前所述（Cani et al., 2009）评估肠道通透性。简而言之，在处死前 4 小时，小鼠被给予 FITC-右旋糖酐（500 mg/kg 体重，Sigma-Aldrich，美国；100 mg/mL 在无菌盐水中）。在终点收集血液样本，并通过离心获得血清。使用微孔板读取器在 490 nm 的激发波长和 520 nm 的发射波长测量血清中的 FITC-右旋糖酐荧光。根据用系列稀释的 FITC-右旋糖酐标准品制备的标准曲线计算血清中的 FITC-右旋糖酐浓度。2.14 血清淀粉酶测定使用 Siemens 的 Advia 2400 自动化学分析仪根据制造商的说明通过标准化的酶法测定血清淀粉酶活性。2.15 定量实时 PCR使用 Tissue RNA Purification Kit Plus（EZBioscience，美国）从组织中提取总 RNA，并使用 HyperScript III RT SuperMix（EnzyArtisan，中国）进行逆转录。使用 E.Z.N.A. Stool DNA Kit（Omega，美国）从粪便样本中分离基因组 DNA。使用 NanoDrop 2000 分光光度计（Thermo Scientific，美国）测量核酸的浓度和纯度。在 QuantStudio 6 Flex 系统（Thermo Scientific，美国）上使用 S6 Universal SYBR qPCR Mix（EnzyArtisan，中国）进行 qPCR。使用 2^-ΔΔCt 方法计算相对表达水平。所有引物均由 Sangon Biotech（上海，中国）合成。为了量化不同配方下 L. plantarum AR113 的肠道定植情况，使用以下引物对粪便 DNA 进行菌株特异性 qPCR：AR113YZ-F，5′-ATGCATCAAAGTTTGTATCATCCAATTAAGAGAGGA-3′，R，5′-TTAAACAAAACAGGTAATTAAACGATAATCAG-3′；FFar2 F，5′-GCTGACAGGCTTCGGCTTAC-3′，R，5′-CAGAGCGATCACTCTACTACAG-3′；Hdac3 F，5′-GCAAGGCTTCACCAAGAGTCT-3′，R，5′-AGATGCGCCTGTGTAACGC-3′；Cd206 F，5′-CTCTGTTCAGCTATTGGACGC-3′，R，5′-TGGCACTCCCAAACATAATTTGA-3′。2.16 西洋印迹分析将冷冻的胰腺组织在液氮中研磨成细粉，并在加入蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物（Epizyme Biotech，中国）和新鲜添加的 1 mM PMSF（Beyotime，中国）的 10 体积冰冻 RIPA 溶解缓冲液中冰上匀浆。蛋白质样品在 7.5% SDS–PAGE 凝胶（Epizyme Biotech，中国）上电泳分离，并转移到 0.2 μm PVDF 膜（Millipore，美国）上。膜在室温下用 3%（w/v）BSA 封闭 1 小时，然后在 4°C 下与溶解在抗体稀释液中的一抗孵育过夜（Epizyme Biotech，中国）。使用的一抗包括抗-CD86（sc-20,060；Santa Cruz Biotechnology，美国）、抗-iNOS（sc-374,092；Santa Cruz Biotechnology，美国）、抗-CXCL10（Santa Cruz Biotechnology，美国）和抗-β-actin（sc-47,778；Santa Cruz Biotechnology，美国）。用 TBST 冲洗三次后，膜在室温下与适当的 HRP 标记二抗孵育 1 小时。膜再次洗涤，并使用增强化学发光（ECL）底物（Millipore，美国）显色。信号使用 Amersham Imager 600 系统（GE Healthcare，美国）检测。2.17 定向代谢组学通过定向 GC–MS 定量粪便中的 SCFAs。简而言之，大约 20 mg 的粪便样本与含有 2-ethylbutyric acid（10 μg/mL）作为内标物的 800 μL 0.5% 磷酸溶液混合。经过冷冻研磨、超声波处理和离心后，上层有机相用于分析。GC–MS 分析在配备 HP-FFAP 毛细管柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）的 Agilent 8890B5977B GC/MSD 系统上以 SIM 模式进行。定量基于每个分析物与内标的峰面积比。为所有分析物建立了校准曲线，醋酸的线性范围为 4.8 至 600 μg/mL，丙酸和丁酸为 2.4 至 300 μg/mL，异丁酸为 1.2 至 150 μg/mL，异戊酸、己酸和异己酸为 0.8 至 100 μg/mL。所有校准曲线的相关系数大于 0.99。在低、中、高浓度水平评估回收率，所有分析物的准确性都在 80% 到 120% 之间。每 5 到 10 个样本插入 QC 样本，QC 样本中目标分析物的 RSD 值均低于 15%。2.18 统计方法正态分布的连续变量表示为均值 ± SEM。使用 t 检验比较两个正态分布的组。应用单因素方差分析（ANOVA）比较三个或更多组。除非另有说明，体外实验至少重复三次。所有统计分析均使用 GraphPad Prism v9.0 进行。3.1. 麦芽糖-藻酸盐微胶囊的优化和表征传统的基于藻酸盐的包封由于其多孔水凝胶网络而对胃酸的保护作用有限，且缺乏能量来源限制了细菌在胃肠道传输过程中的存活（Zhu et al., 2025）。为了解决这些问题，我们筛选了各种碳水化合物以评估它们支持 L. plantarum AR113 生长的能力。值得注意的是，当使用麦芽糖培养时，该菌株表现出显著更高的生长速率，表明麦芽糖是 AR113 的更优代谢底物（补充图 1）。因此，选择麦芽糖作为共同包封材料，以可能增强细菌的存活能力。接下来，我们通过改变藻酸盐和麦芽糖的浓度来优化包封效率。如图 1A 所示，2.5%（w/v）藻酸盐和 3%（w/v）麦芽糖的组合产生了最高的包封效率，达到约 91%。因此，这种优化配方被选用于制备 AM-AR113 微胶囊，并用于所有后续实验。光学显微镜显示，优化的微胶囊具有完整且大体呈球形的形态（图 1B）。冻干微胶囊的 SEM 分析显示表面有皱纹，这可能是由于脱水（图 1C，50×）。在更高放大倍数下，表面看起来紧密且没有明显的裂纹（图 1C，2000×）。EDS 映射进一步显示交联网络中的 Ca 信号和与包封细菌成分一致的 P 信号（图 1C）。粒度分布分析显示，新制备的 AM-AR113 微胶囊具有相对均匀的直径分布。大多数珠子的直径大约在 1100 到 1300 μm 之间，以 1200 μm 为中心，表明优化配方生产的微胶囊具有均匀的尺寸（图 1D）。纹理分析显示，新制备的 AM-AR113 微胶囊具有良好的机械强度。珠子的硬度为 476.0 ± 38.15 g，表明优化配方在重复加载下具有可测量的抗压性。下载：下载高分辨率图像（833KB）下载：下载全尺寸图像图 1. L. plantarum AR113 的麦芽糖-藻酸盐微胶囊的优化和表征。(A) 使用不同浓度藻酸盐（1.0%–3.0%，w/v）和麦芽糖（1.0%–5.0%，w/v）制备的微胶囊中 L. plantarum AR113 的包封效率（EE%）。(B) 优化的微胶囊在 50× 和 100× 放大倍数下的代表性光学显微镜图像。(C) 表面形态和元素分析。顶部：50×、2000× 和 5000× 放大的 SEM 图像。底部：能量分散 X 射线光谱图显示钙（绿色）和磷（红色）的分布。图像中标有刻度尺。(D) 从三个独立制备中测量的新鲜制备的 AM-AR113 微胶囊的粒度分布，每个批次至少分析 50 个珠子。(E) 自由 L. plantarum AR113 和麦芽糖藻酸盐包封的 L. plantarum AR113（AM-AR113）在储存 30 天期间的菌落计数变化。(F) 在模拟胃肠道传输过程中，自由 AR113 和 AM-AR113 的存活情况，首先暴露于 SGF 0 到 2 小时，然后暴露于 SIF 2 到 6 小时。(G) 在模拟结肠液中，AM-AR113 微胶囊中活细菌的体外释放情况，暴露于 SCF 0 到 120 分钟。统计分析使用 Student's t 检验。**p < 0.01，***p < 0.001 表示组间有显著差异。然后我们评估了麦芽糖藻酸盐基质的保护性能。与自由 AR113 相比，AM-AR113 在长期储存期间也显示出改善的储存稳定性。这种生存优势在第 14 天和第 30 天仍然明显，AM-AR113 一致保持比自由 AR113 更高的存活计数，表明优化微胶囊在长时间储存期间保持了细菌的稳定性（图 1E）。在模拟的胃肠道传输过程中，自由 AR113 在 SGF 暴露期间迅速失去活力，而 AM-AR113 在 SGF 和随后的 SIF 暴露期间显示出显著改善的存活率（图 1F）。这些结果表明，麦芽糖藻酸盐系统在储存期间提高了稳定性，并增强了对模拟胃肠道条件的耐受性。在模拟结肠液中的体外释放分析显示，AM-AR113 微胶囊中的活细菌呈时间依赖性释放。在最初的 30 分钟内释放的活细菌显著增加，然后从 60 分钟到 120 分钟逐渐增加，达到最高水平（图 1G）。这些结果表明，AM-AR113 在模拟结肠条件下支持了渐进的细菌释放。3.2. 麦芽糖-藻酸盐包封的 AR113 缓解小鼠的急性胰腺炎（AP）和肠道损伤在体外表征之后，我们在急性胰腺炎（AP）的小鼠模型中评估了微胶囊（AM-AR113）的治疗效果。正如预期的那样，AP 组表现出严重的胰腺损伤，其特征是腺泡细胞坏死、广泛的水肿和白细胞浸润。尽管用自由 L. plantarum AR113（AP + AR113）和空微胶囊（AP + AM）治疗提供了部分缓解，但口服 AM-AR113 显著减轻了这些病理变化。AP + AM-AR113 组的组织学评分显著降低，胰腺促炎细胞因子的水平也降低（p < 0.05）（图 2A 和 B）。血清淀粉酶活性，AP 严重程度的标志物，在 AP + AM-AR13 组中也有所下降（图 2C）。鉴于急性胰腺炎（AP）通常由肠道屏障功能障碍加剧，我们进一步评估了肠道完整性（Li等人，2020年）。结果表明，AM-AR113干预有效地保护了回肠黏膜结构，并显著减少了肠道炎症（p < 0.05）（图2D和E）。下载：下载高分辨率图像（1MB）下载：下载全尺寸图像

图2. 微胶囊缓解小鼠的急性胰腺炎。(A) Con组、AP组、AP+AM组、AP+AR113组和AP+AM-AR113组的胰腺组织代表性H&E染色图像（n = 6）。放大倍数分别为100倍和200倍。条形图显示了胰腺的病理评分。(B) 相对于Gapdh标准化的胰腺促炎细胞因子（Tnf-α、Il-6和Il-1β）的mRNA表达水平（n = 6）。(C) 通过商业检测 kit检测的血清淀粉酶活性（n = 6）。(D) 回肠的代表性H&E染色图像（200倍放大）及相应的病理评分（n = 6）。(E) 回肠中炎症细胞因子（Tnf-α、Il-6和Il-1β）的相对mRNA表达水平（n = 6）。(F) 通过ELISA检测的血清促炎细胞因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）浓度（n = 6）。(G) Con组、AP组、AP+AM组、AP+AR113组和AP+AM-AR113组的L. plantarum AR113粪便负荷，通过特定菌株的qPCR进行量化（n = 6）。统计学分析采用单因素方差分析。

系统性地，AM-AR113治疗显著降低了循环中的促炎细胞因子浓度（p < 0.05）（图2F）。总体而言，这些结果表明，包封的AR113通过同时抑制胰腺炎症和保护肠道屏障而发挥强有力的治疗效果。为了直接评估不同配方下L. plantarum AR113的体内存活情况，我们使用特定菌株的qPCR测定了粪便中的AR113负荷，发现Con组、AP组和AP+AM组中几乎检测不到AR113，而在AP+AR113组和AP+AM-AR113组中分别达到了5和对数10个拷贝/克（p < 0.05）（图2G）。这一体内优势可能与AM-AR113的有利体外特性有关，包括高包封效率、改善的储存稳定性、增强的胃肠道转运耐受性以及时间依赖性的释放行为，这些因素共同促进了AR113在肠道中的有效输送。

3.3 AM-AR113补充剂调节肠道微生物群并增强短链脂肪酸（SCFAs）的产生

我们使用16S rRNA基因测序（V3-V4区域）分析了AM-AR113干预后肠道微生物群的变化。Alpha多样性分析（Shannon指数和Simpson指数）表明，与AP组相比，AM-AR113补充显著增加了alpha多样性（p < 0.05）（图3A）。基于ASV的主坐标分析（PCoA）显示AP组和AP+AM-AR113组之间存在明显的分离，表明干预后整体微生物结构发生了显著变化（图3B）。在门水平上的分类分析显示，AM-AR113处理增加了Bacteroidota和Patescibacteria的相对丰度，同时减少了Actinomycetota的丰度（图3C）。在属水平上，AP+AM-AR113处理特别富集了有益的细菌，包括Akkermansia、Dubosiella和Lactiplantibacillus（图3D-F）。Lactiplantibacillus的丰度增加与通过特定菌株qPCR测量的较高粪便AR113负荷一致，尽管16S rRNA测序数据本身无法区分外源性施用的AR113菌株和该属的内源性成员。总之，AM-AR113补充剂有效地恢复了肠道微生物群的平衡，并改善了由AP引起的菌群失调。

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图3. AM-AR113补充剂重塑肠道微生物群和SCFAs谱型。(A) AP组和AP+AM-AR113组的属水平Alpha多样性分析，以Simpson指数和Shannon指数表示（n = 6）。(B) 基于ASV水平的AP组和AP+AM-AR113组的PCoA（n = 6）。(C) AP组和AP+AM-AR113组中主要细菌门的相对丰度（n = 6）。(D) 显示AP组和AP+AM-AR113组个别样本中代表性属的相对丰度的热图（n = 6）。(E) 通过LEfSe分析在AP组和AP+AM-AR113组之间鉴定出的差异丰富菌群（n = 6）。(F) AP组和AP+AM-AR113组中Lactiplantibacillus的相对丰度（n = 6）。(G) 通过靶向代谢组学测定的粪便样本中的总SCFAs浓度（n = 5–6）。(H) 粪便样本中个别SCFAs的浓度（n = 5–6）。统计学分析使用学生t检验。*p < 0.05，**p < 0.01表示组间有显著差异。

由于L. plantarum AR113是已知的SCFAs生产者，我们假设其富集会增强肠道SCFAs的水平（Qin等人，2022年）。与这一假设一致，与AP组相比，AP+AM-AR113组的总粪便SCFAs浓度显著升高（p < 0.05）（图3G）。对个别SCFAs的分析显示，乙酸的增加最为显著（p < 0.05）（图3H）。除了乙酸外，几种其他粪便SCFAs，包括丙酸、丁酸、异丁酸、异戊酸、异己酸和己酸，在AM-AR113处理后也显示出了变化趋势；然而，这些变化总体上并不具有统计学意义（图3H）。这种代谢变化与AR113的发酵特性一致，表明抗炎SCFAs的生产增加有助于微胶囊的治疗效果。

3.4 AR113的治疗效果依赖于乙酸激酶介导的乙酸产生

基因组注释表明AR113携带一个乙酸激酶基因（位点0187），这是参与乙酸生产的关键酶。为了验证AM-AR113的治疗效果是否由乙酸产生介导，本研究使用了我们实验室之前生成的敲除突变菌株AR113Δ0187。为了排除AR113Δ0187的表型改变是由于生长受损所致的可能性，我们比较了野生型AR113和AR113Δ0187在含麦芽糖培养基中的体外生长和代谢物谱型。两种菌株的生长曲线高度相似，在静止期的OD600没有明显差异。相比之下，AR113Δ0187的乙酸产生显著减少，而乳酸产生基本保持不变。这些发现表明，0187的缺失主要损害了乙酸产生，而不是导致一般的生长缺陷（图S2）。

AM-AR113显著减少了胰腺损伤，表现为较低的组织学评分和较低的胰腺炎症细胞因子mRNA水平（p < 0.05）。相比之下，这些保护效果在用AM-AR113Δ0187处理的小鼠中减弱了（图4A和B）。在肠道中也观察到了类似的模式。AM-AR113减少了回肠损伤评分和回肠炎症细胞因子的表达，而AM-AR113Δ0187的保护作用有限（p < 0.05）（图4C和D）。

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图4. AM-AR113的治疗效果依赖于乙酸激酶介导的SCFAs产生。(A) Con组、AP组、AP+AM-AR113Δ0187组和AP+AM-AR113组的胰腺组织代表性H&E染色图像（n = 6）。放大倍数分别为100倍和200倍。条形图显示了组织病理评分。(B) 相对于Gapdh标准化的胰腺促炎细胞因子（Tnf-α、Il-6和Il-1β）的相对mRNA表达水平（n = 6）。(C) 回肠的代表性H&E染色图像（200倍放大）及相应的病理评分（n = 6）。(D) 回肠中炎症细胞因子（Tnf-α、Il-6和Il-1β）的相对mRNA表达水平（n = 6）。(E) 堆叠条形图显示粪便SCFAs（乙酸、丙酸和丁酸）的浓度（n = 5–6）。(F) 通过随机森林分析确定的变量重要性图，按变量重要性（平均准确性降低）对粪便SCFAs进行排序。统计学分析采用单因素方差分析。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001表示组间有显著差异。

为了从代谢学上证实这些发现，我们对粪便样本进行了靶向代谢组学分析。分析显示，与AP+AM-AR113组相比，AP+AM-AR113Δ0187组的乙酸浓度显著降低（图4E），证实了0187基因的缺失成功抑制了体内的乙酸产生。此外，随机森林分析进一步突出了乙酸作为粪便SCFAs中的主要区分特征（图4F）。总体而言，这些发现表明AR113的乙酸产生对于AM-AR113的完全保护效果是必需的。

3.5 外源性乙酸缓解胰腺炎并恢复肠道屏障功能

为了验证乙酸的保护潜力，我们直接用外源性乙酸处理AP小鼠。正如预期的那样，乙酸干预显著减轻了AP的严重程度。组织学评估显示胰腺坏死和水肿减少（图5A和B），并伴有回肠绒毛结构的保持（图5C和D），导致病理评分显著低于AP组（p < 0.05）。

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图5. 直接给予乙酸模拟了AM-AR113对AP的保护效果，并恢复了肠道屏障的完整性。(A) Con组、AP组和乙酸组的胰腺组织代表性H&E染色图像。放大倍数分别为100倍和200倍（n = 6）。(B) 量化组织损伤程度的胰腺病理评分（n = 6）。(C) 回肠的代表性H&E染色图像（200倍放大）（n = 6）。(D) 回肠的病理评分（n = 6）。(E–G) 游离荧光图像显示了（E）Claudin-1（绿色）、（F）ZO-1（绿色）和（G）Mucin-2（绿色）的回肠组织。细胞核用DAPI（蓝色）进行对比染色（n = 6）。(H–J) 相对于DAPI的（H）Claudin-1、（I）ZO-1和（J）Mucin-2的平均荧光强度（MFI）的定量分析（n = 6）。(K) Con组、AP组和乙酸组中的血清DAO、LPS和FITC-dextran水平（n = 6）。(L) Con组、AP组和乙酸组中ffar2 mRNA表达的qPCR分析（n = 6）。统计学分析采用单因素方差分析。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001表示组间有显著差异。

先前的研究表明，乙酸可以通过促进紧密连接蛋白的表达来增强肠道屏障功能（Caetano & Castelucci，2022；Neurath, Artis, & Becker，2025）。与这些报告一致，我们进一步探讨了乙酸如何通过评估肠道屏障的完整性来保护肠道。AP组显示出紧密连接蛋白表达的显著紊乱，其特征是Claudin-1（图5E和H）和ZO-1（图5F和I）的荧光强度显著降低。此外，AP小鼠中黏液层的关键成分Mucin-2的表达也严重减少（图5G和J）。值得注意的是，补充乙酸逆转了这些缺陷。它显著上调了Claudin-1和ZO-1的表达，恢复了肠道上皮的物理屏障（p < 0.05）。此外，它还促进了Mucin-2的产生，从而加强了化学屏障。此外，与Con组相比，AP小鼠的血清DAO、LPS和FITC-dextran水平显著增加，而乙酸处理显著降低了所有三个指标（p < 0.05），进一步表明乙酸补充改善了肠道屏障的通透性（图5K）。为了探索与肠道屏障保护相关的宿主乙酸响应通路，我们进一步测量了回肠组织中的ffar2表达。与Con组相比，AP小鼠的回肠ffar2 mRNA表达显著降低，而乙酸处理显著恢复了其表达（图5L）。这些结果表明，乙酸本身可以单独减轻AP的严重程度，可能是通过改善肠道屏障完整性来实现的。

3.6 乙酸抑制胰腺巨噬细胞的招募和M1极化

越来越多的证据强调了SCFAs在调节免疫细胞反应中的关键作用（Mann, Lam, & Uhlig, 2024；Yao等人，2022）。鉴于AP的进展在很大程度上是由巨噬细胞的浸润和适应性极化驱动的，我们进一步研究了乙酸在调节这一免疫过程中的保护作用。我们首先检查了MCP-1的水平，这是一种负责招募单核细胞和巨噬细胞到炎症部位的趋化因子。如图6A所示，AP组的MCP-1水平显著升高。然而，乙酸处理显著抑制了这种升高。我们使用F4/80（一种泛巨噬细胞标记物）和iNOS（一种特异性的促炎M1表型标记物）的免疫荧光双重染色进一步研究了浸润巨噬细胞的表型。在AP组中，我们观察到大量F4/80+巨噬细胞的浸润，并伴有明显的iNOS共染（图6B），表明主要向促炎M1状态极化。

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图6. 乙酸处理抑制胰腺中的巨噬细胞浸润和M1极化。(A) 通过ELISA测量的胰腺组织中单核细胞MCP-1的浓度（n = 6）。(B) 胰腺组织的代表性免疫荧光图像。切片同时进行了F4/80（绿色，泛巨噬细胞标记物）和iNOS（红色，M1巨噬细胞标记物）的染色。细胞核用DAPI（蓝色）进行对比染色（n = 6）。(C) 胰腺组织中M1巨噬细胞标记物（CD86、CXCL10和iNOS）的Western blot分析。条形图显示了相对于β-actin标准化的蛋白质水平（n = 3）。(D) 通过qPCR测定胰腺中M1标志物（Cd86、Cxcl10和iNOS）的相对mRNA表达水平（n = 6）。(E) 对Con组、AP组和醋酸处理组的胰腺组织中Cd206 mRNA的表达进行qPCR分析（n = 6）。(F) 对Con组、AP组和醋酸处理组的胰腺组织中Hdac3 mRNA的表达进行qPCR分析（n = 6）。使用Gapdh作为内部对照。统计数据通过单因素方差分析进行处理。*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001表示组间存在显著差异。这种对M1极化的抑制作用得到了分子分析的支持。Western blot结果显示，代表性M1标志物CD86、CXCL10和iNOS的蛋白质表达水平在AP组中显著上调，但在醋酸处理后显著下调（图6C）。与蛋白质数据一致，RT-qPCR分析也证实与AP组相比，醋酸组中Cd86、Cxcl10和iNOS的mRNA表达显著降低（图6D）。为了进一步评估醋酸是否也与修复性巨噬细胞相关标志物的变化有关，我们还测量了胰腺中的Cd206表达。与Con组相比，AP组中胰腺Cd206 mRNA表达显著增加，并且在醋酸处理后进一步升高（图6E）。接下来，我们评估了胰腺Hdac3的表达作为可能与醋酸介导的胰腺炎症调节相关的宿主因子。与Con组相比，AP组中胰腺Hdac3 mRNA表达显著增加，而醋酸处理显著降低了其表达（图6F）。这些数据共同表明，醋酸与胰腺中趋化因子信号传导的减少和M1标志物表达的减少有关。

4. 讨论
本研究的主要目标是评估合生物系统AM-AR113在缓解急性胰腺炎（AP）方面的治疗潜力。我们证明AM-AR113显著减少了小鼠模型中的胰腺损伤和全身炎症。机制分析表明，醋酸是AM-AR113充分发挥保护作用所必需的。根据国际益生菌和益生元科学协会（ISAPP）的定义，合生物是指由活微生物和底物组成的混合物，这些底物被宿主微生物选择性利用，并为宿主带来健康益处（Swanson等人，2020年）。协同作用的合生物要求底物能够被共同给予的微生物特异性利用，从而增强其存活或活性（Shi等人，2025年）。然而，在以往针对AP的研究中，益生菌通常以自由细菌细胞的形式给予，这缺乏保护作用（Lu等人，2021年）。虽然传统的海藻酸微胶囊可以提供物理隔离，但它们无法支持细菌的代谢活性（Zhu等人，2025年）。在本研究中，我们的体外表征发现麦芽糖是L. plantarum AR113的首选底物。基于此，我们构建了麦芽糖-海藻酸递送系统。与传统包封不同，麦芽糖-海藻酸具有双重功能：它不仅保护细菌免受恶劣的胃肠道环境的伤害，还为细菌提供了支持其存活和活性的营养环境。这种结合策略显著提高了L. plantarum AR113对胃酸的抵抗力，并增强了其在肠道中的持久性。然后，我们评估了AM-AR113对AP病理进展的影响。与未经处理的AP组和自由细菌组相比，AM-AR113显著降低了胰腺组织学评分、血清淀粉酶活性以及促炎细胞因子（包括TNF-α、IL-6和IL-1β）的水平。这些发现表明，通过微囊化改善的细菌存活是治疗效果的重要决定因素，并有助于解决以前研究中报道的益生菌在胃肠道传输过程中丢失的问题（Han等人，2021年；Yao等人，2020年）。我们的AM-AR113体外表征进一步支持了这一观点。优化的配方表现出高包封效率、均匀的珠粒大小、可测量的机械稳定性、改进的储存稳定性，在模拟胃肠道传输过程中显著提高了存活率，并在模拟结肠条件下实现了逐步释放。AM-AR113补充后，我们观察到与AP组相比微生物多样性增加。特别是Lactiplantibacillus、Akkermansia和Dubosiella的丰度有所增加。先前的研究表明，Akkermansia与肠道炎症和屏障功能障碍呈负相关，且共生菌的减少与AP的严重程度有关（Luo等人，2022年；Pauw等人，2025年；Zhu等人，2019年）。此外，靶向代谢组学分析显示SCFAs（尤其是醋酸）显著富集。为了验证AM-AR113是通过醋酸来缓解AP的，我们采用了基因敲除策略。基因组分析显示，L. plantarum AR113编码ackA基因（位点0187），该基因编码醋酸 kinase并参与醋酸的生产。CRISPR/Cas9介导的L. plantarum AR113中0187基因的删除显著减少了醋酸的产生，并且重要地削弱了体内的保护作用。用突变株AM-AR113Δ0187处理的小鼠未能完全再现AM-AR113所观察到的益处，表现出更高的胰腺损伤评分、更严重的肠道损伤和更多的炎症细胞因子表达。这些结果支持L. plantarum AR113产生的醋酸在其保护表型中的关键作用。我们进一步探索了醋酸发挥这些作用的下游途径。我们的数据显示，醋酸处理恢复了AP小鼠中ZO-1、Claudin-1和Mucin-2的表达。重要的是，这些结构变化伴随着血清FITC-dextran、LPS和DAO水平的降低，进一步表明醋酸改善了肠道屏障功能并减少了屏障通透性。此外，我们发现AP小鼠中的ileal Ffar2表达显著降低，但醋酸处理部分恢复了这一表达。鉴于FFAR2是醋酸的重要宿主受体，并参与肠道屏障的稳态，这一结果进一步支持了我们研究中观察到的醋酸响应性宿主信号可能会对屏障保护产生影响。我们还将这些观察扩展到胰腺的免疫微环境。醋酸与胰腺中MCP-1水平的降低、M1相关炎症标志物的表达减少以及M2相关标志物Cd206的表达增加有关。此外，AP小鼠中的胰腺Hdac3表达显著增加，但醋酸处理部分恢复了这一表达。鉴于HDAC3与炎症调节和巨噬细胞功能状态密切相关，这一结果进一步支持醋酸可能通过调节炎症相关的宿主调节分子来参与胰腺炎症的缓解。尽管直接口服醋酸是可行的，但它会在上消化道迅速被吸收。相比之下，AM-AR113系统能够在肠道中持续产生醋酸，这可能更有利于靶向肠道-胰腺轴。尽管我们的数据支持0187依赖的醋酸生产在AM-AR113的保护作用中的作用，但还需要遗传互补来加强因果推断。醋酸的全身和局部分布仍不清楚，未来的研究应量化血清和胰腺组织中的醋酸含量，并进一步检查其他SCFAs（包括丙酸、丁酸和乳酸）是否也有保护作用。此外，我们的发现支持AM-AR113在预处理方案下的保护作用，但未解决在同时或诱导后治疗下是否保持疗效的问题；也未定义AM-AR113的体内释放动力学。未来的研究还应包括专门的胆盐耐受性测试，以更好地定义胆盐压力在该递送系统保护作用中的具体作用。这些问题应在未来的研究中得到澄清，以更好地定义该递送系统的治疗窗口和转化潜力。尽管醋酸处理与M1相关炎症标志物的减少、Cd206表达的增加以及胰腺Hdac3表达的降低有关，但这些发现仍仅是相关性，并未建立巨噬细胞自主机制。因此，未来的研究应结合体外巨噬细胞模型、流式细胞术、共定位分析、其他M2相关标志物和更广泛的免疫谱型分析，以确定醋酸是否直接调节AP中的巨噬细胞极化和炎症编程。最后，目前的发现基于实验模型，需要在人类AP队列中进行验证。未来的研究应评估AM-AR113和醋酸在不同病因和严重程度的AP中的疗效，确定最佳剂量和时间，并明确年龄、性别和基线微生物群组成等宿主因素如何影响治疗反应。

5. 结论
总之，AM-AR113通过改善肠道微生物组成、促进微生物醋酸产生、增强肠道屏障完整性和抑制胰腺M1巨噬细胞极化来预防AP。这些发现为开发针对特定微生物代谢物的菌株特异性合生物制剂提供了机制基础，并支持AM-AR113作为一种有前景的营养和微生物群策略，用于预防和治疗AP。

作者贡献声明
魏晓：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原始草稿、可视化、数据管理。
杨富：资源提供、数据管理。
秦文飞：验证、监督。
李泽荣：撰写 – 审稿与编辑、验证、概念化。
艾连中：方法学。
王广强：验证、监督、资金获取。
曾悦：资源提供、资金获取、概念化。

伦理声明
所有动物实验均按照国家研究委员会关于实验室动物护理和使用的指南进行。所有在小鼠身上进行的程序均获得了上海 General Hospital 动物伦理委员会的批准（2024AW033）。特定的无特定病原体级C57BL/6雄性小鼠（6-8周龄）从上海SLAC实验室动物有限公司购买，并在上海 General Hospital 在无特定病原体条件下饲养。